專利名稱：滇重樓種子發(fā)芽及其快速繁殖技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及打破滇重樓種子休眠期的種子發(fā)芽技術(shù)以及快速微繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
滇重樓(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)屬延齡草科(Trilliaceae)多年生草本，為重樓屬蚤休組(Sect.Euthyra Franch.)多葉重樓(Paris polyphylla Smith)的一變種，為中藥重樓的主要藥用種。重樓生長十分緩慢，每株年生長量約為2-3克鮮重，由于近年不斷發(fā)現(xiàn)其新的藥用價值，致使需求量越來越大，加之盲目收購和采挖，致使重樓資源受到極大的破壞，除傳統(tǒng)藥用的滇重樓和七葉一枝花(P.polypylla var.chinensis)資源十分稀少外，其它種類也十分少。目前依靠重樓為主要組分的中成藥已很難大規(guī)模生產(chǎn)。而滇重樓種子具有休眠1-2年的現(xiàn)象，在正常情況下發(fā)芽情況很差，且無性苗增殖很慢，現(xiàn)有技術(shù)中還未解決這一問題。
本發(fā)明征對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種能有效打破滇重樓種子休眠期，成功地進行滇重樓快速繁殖的生物技術(shù)，具有繁殖速度快、周期短、工廠化快繁的優(yōu)點，同時能有效地提高滇重樓的產(chǎn)量和質(zhì)量。
為了達到本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了下面的技術(shù)方案滇重樓種子發(fā)芽及其快速繁殖技術(shù)，取滇重樓(Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)種子，用水沖洗，70％乙醇浸泡2-5分鐘，用0.2％HgCl2浸泡10-30分，在20-80ppm濃度度的赤霉素中、22℃黑暗條件下浸泡48小時，置于無菌培養(yǎng)皿中，在4℃或22℃、黑暗下交替放置各1周，反復(fù)3-5次進行種子發(fā)芽，然后每天光照10小時，光強1000lux，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L和6-芐氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L進行快速繁殖。
上述快速繁殖技術(shù)中，可優(yōu)選在基本培養(yǎng)基中加入滇重樓寡糖素。
下面結(jié)合本發(fā)明的試驗內(nèi)容和結(jié)果來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，同時來說明本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
1、冷處理和光照對種子發(fā)芽的影響(見表1)3次不連續(xù)的冷處理(處理1)有利于滇重樓種子休眠期的打破，提高種子的發(fā)芽率。連續(xù)4℃低溫(處理4)并不能提高種子的發(fā)芽率。連續(xù)22℃常溫(處理2)可使種子發(fā)芽，但發(fā)芽率要低于冷處理的發(fā)芽率，但常溫下光照(處理4)不利于種子發(fā)芽。
表1冷處理和光照對滇重樓種子發(fā)芽的影響
*處理方法見實施例1-4。2赤霉素處理對種子發(fā)芽的影響赤霉素對滇重樓種子發(fā)芽的影響實驗是在冷處理對種子發(fā)芽有明顯促進作用的基上進行的。從表2可以看出，適宜的赤霉素(40～80ppm)處理，在常溫(22℃)暗處芽(處理2)可以達到與冷處理相似的結(jié)果。如果采用適當濃度的赤霉素浸泡，同時對子進行不連續(xù)冷處理，能更有效地提高種子的發(fā)芽率。
綜合表1和表2，滇重樓種子在常溫和4℃下連續(xù)發(fā)芽60天和120天，統(tǒng)計發(fā)率均在50％以下，說明種子有休眠現(xiàn)象。通過冷處理和赤霉素處理均可以打破滇重樓種的休眠。光照不利于種子的發(fā)芽。
表2赤霉素對滇重樓種子發(fā)芽的影響Table 2 Effects of giberellin concentration on seedgermination of P.polyphylla var.yunnanensis<
>*處理方法見實施例1、2。
3滇重樓的微繁殖將已發(fā)芽的滇重樓種子轉(zhuǎn)至無激素的MS培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng)，即可獲得無菌植株。初步實驗結(jié)果表明，降低無機鹽含量，有利于無菌苗的生長，為了有利于芽增殖或者根的生長，采用了一系列的1/2MS培養(yǎng)基，所采用的培養(yǎng)基種類及其幼苗的生長情況，結(jié)果(見表3)表明，添加NAA0.5mg/L和6BA0.1mg/L的1/2MS培養(yǎng)基既有利于芽的增殖，同時也有利于根的生長。將試管苗經(jīng)室內(nèi)過渡到室外，慢慢過渡到盆栽，盆栽一周后統(tǒng)計成活率達95％，且生長良好。按每株試管苗每月增加兩個芽計算，每年每株可繁殖4096株苗。
表3不同培養(yǎng)基對滇重樓的微繁殖的影響Table 3 Effects of different media on milipropagationof P.polyphylla var.yunnanensis
4寡糖素對滇重樓芽增殖的影響在培養(yǎng)基中加入不同濃度的寡糖素PP-DP7、PP-DP8和PP-DP9，初步結(jié)果(見表4)表明寡糖素對根的分化和生長沒有明顯的影響，但能影響芽的增殖，PP-DP7、PP-DP8和PP-DP9有利于芽增殖的最適濃度分別為2.5ppm、10ppm和20ppm。
表4寡糖素對滇重樓芽增殖的影響Table 4 Effects of oligosaccharins PP-DP7,PP-DP8 and PP-DP9 onshoot multiplication of P.polyphylla var.yunnanensis
+表示每株試管苗每月增加1～2個芽++表示每株試管苗每月增加3個芽；+++表示每株試管苗每月增加4個芽以上。
從上述實驗結(jié)果和結(jié)論可以看出本發(fā)明的優(yōu)益效果為1、采用滇重樓的快速繁殖，用生物技術(shù)的辦法促使重樓根莖年生長量的增加，有計劃地發(fā)展重樓的種植業(yè)，確保重樓藥材的供應(yīng)，克服了重樓藥材完全依靠野生資源的被動局面。
2、通過溫度調(diào)節(jié)、赤霉素調(diào)節(jié)，能有效地打破滇重樓種子休眠期，提高了種子發(fā)芽率，可達100％，克服了現(xiàn)有技術(shù)發(fā)芽情況很差，且有性苗增殖很慢的缺點。
3、相比現(xiàn)有技術(shù)具有繁殖速度快、周期短的優(yōu)點，可實現(xiàn)工業(yè)快速繁殖。
4、有利于進一步進行滇重樓遺傳育種(如高產(chǎn)甾體皂甙含量、高產(chǎn)多糖和寡糖含量品系的建立)和生理生化(如膠質(zhì)與粉質(zhì)重樓的關(guān)系、微生物群落與重樓質(zhì)量的關(guān)系等)的研究和產(chǎn)業(yè)化。
實施例一取滇重樓(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)種子，搓揉，使種子與多汁的假種皮分離以后，將種子淘出，晾干。將種子用水沖洗，70％乙醇浸泡2分鐘，無菌水沖洗兩次，用0.2％HgCl2浸泡30分鐘，在40ppm濃度的赤霉素中、22℃黑暗條件下浸泡48小時，平鋪在濕潤的濾紙上置于無菌培養(yǎng)皿中作發(fā)芽床，然后在22℃下放置1周，4℃下放置1周，如此交替進行，經(jīng)過3次處理后，置22℃下發(fā)芽，黑暗。每一處理為100顆種子，當胚根露出種皮1毫米以上，即認為已發(fā)芽。然后以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L和6-芐氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L進行快速繁殖，試管苗每天光照10小時，光強1000lux。
實施例二取滇重樓(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)種子，搓揉，使種子與多汁的假種皮分離以后，將種子淘出，晾干。將種子用水沖洗，70％乙醇浸泡5分鐘，無菌水沖洗兩次，用0.2％HgCl2浸泡20分鐘，在60ppm濃度的赤霉素中、22℃黑暗條件下浸泡48小時，平鋪在濕潤的濾紙上置于無菌培養(yǎng)皿中作發(fā)芽床，置22℃下發(fā)芽，黑暗。每一處理為100顆種子，當胚根露出種皮1毫米以上，即認為已發(fā)芽。然后以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6-芐氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L和10ppm寡糖素9進行快速繁殖，試管苗每天光照10小時，光強1000lux。
實施例三取滇重樓(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)種子，搓揉，使種子與多汁的假種皮分離以后，將種子淘出，晾干。將種子用水沖洗，70％乙醇浸泡5分鐘，無菌水沖洗，用0.2％HgCl2浸泡15分鐘，在80ppm濃度的赤霉素中、22℃黑暗條件下浸泡48小時，平鋪在濕潤的濾紙上置于無菌培養(yǎng)皿中作發(fā)芽床，置4℃下發(fā)芽，黑暗。每一處理為100顆種子，當胚根露出種皮1毫米以上，即認為已發(fā)芽。然后以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6-芐氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L和20ppm寡糖素8進行快速繁殖，試管苗每天光照10小時，光強1000lux。
實施例四取滇重樓(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)種子，搓揉，使種子與多汁的假種皮分離以后，將種子淘出，晾干。將種子用水沖洗，70％乙醇浸泡3分鐘，無菌水沖洗，用0.2％HgCl2浸泡25分鐘，在20ppm濃度的赤霉素中、22℃黑暗條件下浸泡48小時，平鋪在濕潤的濾紙上置于無菌培養(yǎng)皿中作發(fā)芽床，置22℃下發(fā)芽，黑暗。每一處理為100顆種子，當胚根露出種皮1毫米以上，即認為已發(fā)芽。然后以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6-芐氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L和5ppm寡糖素7進行快速繁殖，試管苗每天光照10小時，光強1000lux。
權(quán)利要求
1.滇重樓種子發(fā)芽及其快速繁殖技術(shù)，其特征是取滇重樓(Parispolyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)種子，用水沖洗，70％乙醇浸泡2-5分鐘，用0.2％HgCl2浸泡10-30分鐘后，在20-80ppm濃度的赤霉素中、22℃黑暗條件下浸泡48小時，置于無菌培養(yǎng)皿中，在4℃或22℃、黑暗下交替放置各1周，反復(fù)3-5次進行種子發(fā)芽，然后每天光照10小時，光強10001ux，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L和6-芐氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L進行快速繁殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的技術(shù)，其特征是在基本培養(yǎng)基中可加入滇重樓寡糖素。
全文摘要
滇重樓(Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Fr.) Hand Mazz.)為中藥重樓的主要藥用種。本發(fā)明征對現(xiàn)有技術(shù)中存在的種子休眠、有性苗發(fā)育很慢等問題,提供一種能有效打破滇重樓種子休眠期的發(fā)芽技術(shù)以及快速繁殖生物技術(shù),具有繁殖速度快、周期短、工廠化快繁的優(yōu)點,同時能有效地提高滇重樓的產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號A01C1/00GK1210663SQ9811895
公開日1999年3月17日 申請日期1998年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月8日
發(fā)明者王世林, 周立剛, 朱宏濤, 楊崇仁 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所