專利名稱：：甘藍(lán)顯性核基因雄性不育系選育及其制種技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及甘藍(lán)顯性核基因雄性不育系選育及其制種技術(shù)，屬于甘藍(lán)雜種優(yōu)勢利用領(lǐng)域。雜種優(yōu)勢利用是白菜、甘藍(lán)等十字花科作物的一種主要育種途徑。長期以來，國內(nèi)外都是利用自交不親和系的方法配制甘藍(lán)雜交種。日、美等國在50-60年代就利用自交不親和系配制甘藍(lán)雜交種，我國從70年代開始就利用自交不親和系配制甘藍(lán)雜交種。這種方法的不足是親本必須用人工蕾期授粉方法繁殖，成本高；親本多代自交易產(chǎn)生生活力退化；由于自交不親和性是相對的，因此，配制出的雜交種種子的雜交率很難達(dá)到100％，而利用雄性不育系生產(chǎn)一代雜種可克服上述缺點(diǎn)。因此，研究和選育可利用的甘藍(lán)雄性不育系一直是國內(nèi)外甘藍(lán)遺傳育種工作者的一個研究熱點(diǎn)。到目前為止，國內(nèi)外研究的甘藍(lán)雄性不育性主要分為三類第一類是隱性核不育，Dickson(1970)；Enge(1974)；Goshew(1974)等先后報道在甘藍(lán)類作物中發(fā)現(xiàn)受隱性核基因控制的雄性不育，該類不育材料既無法找到100％不育的保持系，也很難找到聯(lián)鎖的標(biāo)記基因，用組培方法繁殖不育材料又成本太高，因而很難利用。第二類是Perrason(1972)報道的黑芥胞質(zhì)核質(zhì)互作型甘藍(lán)雄性不育，這類不育材料存在花瓣不完全開放，蜜腺不發(fā)達(dá)，不能吸引昆蟲授粉等嚴(yán)重缺陷。第三類是來源于ogura的蘿卜胞質(zhì)不育，該不育材料的最大問題是低溫苗期黃化，另外也存在花朵不能正常開放和蜜腺不發(fā)達(dá)等缺陷。近年來，國外一些學(xué)者利用細(xì)胞融合的方法消除Ougra蘿卜異源胞質(zhì)不良影響的研究方面已取得重要進(jìn)展。目前已基本上解決了苗期低溫黃化的問題。但從新引入國內(nèi)的該不育材料來看，新的蘿卜胞質(zhì)甘藍(lán)不育系上依然存在蜜腺小，不能吸引授粉昆蟲，自然授粉結(jié)實性差等缺陷。基于以上種種原因，甘藍(lán)雄性不育制種方法至今一直未能在實際制種中推廣應(yīng)用。本發(fā)明的目的是從甘藍(lán)自然群體中選擇顯性核基因雄性不育系采用自交/測交/回交方法使該雄性不育系成為穩(wěn)定純合顯性不育系，使該雄性不育系不育株率達(dá)到100％，不育度達(dá)到100％，與優(yōu)良自交系配制雜交種，其雜種率達(dá)到95％以上。本發(fā)明是在長期的甘藍(lán)遺傳育種實踐中，從甘藍(lán)原始材料79-399的自然群體中發(fā)現(xiàn)雄性不育系植株79-399-3，通過研究證明其不育性的主效基因是一對顯性核基因控制，在此基礎(chǔ)上，利用該材料在一定基因背景與環(huán)境條件下的敏感特性，通過自交、回交、測交等方法，選育出純合顯性不育系。將純合顯性不育系與優(yōu)良的臨時保持系雜交，獲得不育性及經(jīng)濟(jì)性狀穩(wěn)定的雄性不育系，再利用雄性不育系與配合力好的自交系雜交，配制出甘藍(lán)雜交種。從而創(chuàng)立起利用雄性不育系配制甘藍(lán)雜交種的制種新方法。一種甘藍(lán)顯性核基因雄性不育系的選育及其制種方法，包括顯性核型雄性不育基因的選擇，純合，保存，繁殖不育系，配制雜交種，本發(fā)明是從甘藍(lán)材料79-399繁殖田的自然群體中選擇含有CDMs399-3基因的顯性核不育系，用顯性核不育系與篩選的保持系雜交繁殖不育系；用顯性核不育系與自交系配制雜交種。用自交、回交、測交方法純合顯性核不育系。利用組織培養(yǎng)方法，保存純合顯性核不育系。本發(fā)明的實質(zhì)是利用優(yōu)良的顯性不育系配制強(qiáng)優(yōu)勢的甘藍(lán)雜交種，具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明選育的甘藍(lán)顯性不育系，優(yōu)于到目前為止國內(nèi)外已報道的各種類型甘藍(lán)雄性不育材料①不育株率達(dá)100％，顯著優(yōu)于不育株率只有50％的隱性不育材料。②不育性受顯性核基因控制，避免了現(xiàn)有的胞質(zhì)不育存在的不育胞質(zhì)帶來的不良影響。③主要經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良，無苗期低溫黃化，顯著優(yōu)于存在低溫苗期黃化的R1胞質(zhì)甘藍(lán)不育。開花結(jié)實正常，蜜腺發(fā)達(dá)，顯著優(yōu)于花瓣不完全開放，蜜腺小，不能很好地吸引昆蟲授粉的黑芥胞質(zhì)甘藍(lán)不育系及近年新引進(jìn)的經(jīng)過改造的蘿卜胞質(zhì)甘藍(lán)不育系。2.用于制種的不育系種子是由純合顯性不育無性系與臨時保持系在隔離區(qū)內(nèi)自由授粉配制而成的，生活力強(qiáng)，配制雜交種時種子產(chǎn)量高，并且不用人工授粉，比人工蕾期授粉繁殖自交不親和系成本低得多。3.不育性穩(wěn)定。雜交種種子的雜交率可達(dá)100％。圖1為不育系和雜交種選育系譜2為不育系遺傳模式圖下面敘述具體實施例方式本
發(fā)明內(nèi)容包括甘藍(lán)顯性核基因CDMs399-3的發(fā)現(xiàn)；不育性的遺傳機(jī)制；純合顯性不育系的篩選、繁殖技術(shù)；雄性不育系選育、繁殖技術(shù)；用雄性不育系配制一代雜種的雜交制種技術(shù)。一.甘藍(lán)顯性核基因CDMs399-3的發(fā)現(xiàn)及其不育性的遺傳機(jī)制1979年春從甘藍(lán)原始材料79-399繁種田的自然群體中發(fā)現(xiàn)雄性不育株79-399-3。為研究其不育性的遺傳機(jī)制，用該不育株作母本，用79-399-3材料的可育株作父本進(jìn)行測交，1981、1982、1984、1991、1992、1993、1994年春季觀察到79-399-3及其衍生后代中分離出的不育株與正?？捎隃y交，其后代育性呈1∶1分離，而正常可育株的自交后代完全可育。部分不育株在一定的遺傳背景和環(huán)境條件下出現(xiàn)微量花粉，這種具有微量花粉的不育株自交后代育性呈3∶1分離(表1、表2)。表1.不育株與正常可育株的測交后代育性表現(xiàn)年份觀察植株總數(shù)雄性不育植株數(shù)可育植株數(shù)P(1∶1)19817340.711982209110.65198414680.591991209110.6519928444400.66199319029879150.10199415327897430.24總計3558183617200.25表2.微量花粉敏感不育株自交后代育性表現(xiàn)年份觀察植株總數(shù)雄性不育植株數(shù)可育植株數(shù)P(3∶1)1993147103440.171994314227870.27總計4613301310.10以上結(jié)果表明該不育材料的不育性受一對顯性主效核基因的控制，且微量花粉不育株的微量花粉中也攜帶有不育基因?，F(xiàn)已將核顯性核基因定名為CDMs399-3。其遺傳模式如下該不育材料葉色綠或深綠，低溫下不黃化，不育株現(xiàn)蕾后無死花蕾或死花蕾少，花朵正常開放，蜜腺發(fā)達(dá)，能正常吸引蜜蜂授粉。這些性狀均顯著優(yōu)于黑芥和蘿卜胞質(zhì)不育材料。(表3)表3.幾份甘藍(lán)雄性不育材料開花植株及其花器形態(tài)</tables>研究結(jié)果表明，不育材料花藥敗育的主要特征出現(xiàn)在四分孢子形成后不久?？捎牧显谒姆宙咦有纬珊螅潆蓦召|(zhì)分解，小孢子游離出來，而對應(yīng)的不育材料胼胝質(zhì)不分解，四分孢子繼續(xù)被包裹在胼胝質(zhì)壁中不能釋放出來而逐漸敗育。研究結(jié)果還表明，該不育材料的不同測交后代育性表現(xiàn)可分為穩(wěn)定和環(huán)境敏感兩種類型。穩(wěn)定類型在不同環(huán)境條件下不育株率和不育度均可保持100％，而環(huán)境敏感類型在一定遺傳背景和環(huán)境條件下，則可出現(xiàn)微量有生命力的花粉(表4)，這一情況說明，該材料不育性除受顯性主效基因控制外，還存在修飾基因的影響。表4.幾個不育材料在不同環(huán)境條件下的育性表現(xiàn)</tables>注不育度＝(不育花總數(shù)÷調(diào)查總花數(shù))×100溫度是影響敏感類型育性表達(dá)的主要環(huán)境因子。溫度(主要是平均溫度和最低溫度)對育性表達(dá)的影響達(dá)到極顯著相關(guān)水平。溫度敏感時段在開花前的1-3周，最敏感期在開花前16-21天，臨界平均溫度約為15-20℃。試驗已證明該顯性不育材料存在著環(huán)境敏感性，即在一定的遺傳背景和環(huán)境條件下有些顯性基因處于雜合狀態(tài)下的不育植株可出現(xiàn)有生活力的微量花粉。這種微量花粉不育植株的自交后代中，可分離出不育基因純合的純合顯性不育株。純合顯性不育株與雜合顯性不育株在不育性表現(xiàn)上有時很難區(qū)分，為鑒別出純合顯性不育株，可將所有微量花粉不育株自交后代中出現(xiàn)的不育株與2-3個可育株測交，如果幾個測交后代均表現(xiàn)為100％不育，則可認(rèn)為該測交組合的母本不育株為純合顯性不育株。在育種中利用的優(yōu)良純合顯性不育株，不僅需要顯性不育基因純合、不育性穩(wěn)定，而且要求其經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良，主要性狀整齊、穩(wěn)定，因此，在鑒定不育基因是否純合的同時，應(yīng)在田間對其主要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行鑒定。為選育出優(yōu)良的純合顯性不育系，一般采用以下方法1.連續(xù)自交法在不育材料群體中選經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良育性敏感的不育植株自交，并在其自交后代中繼續(xù)選性狀優(yōu)良而育性敏感的不育株連續(xù)自交，在經(jīng)過3-5代純化的自交后代中，可選育出經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良而不育基因純合的優(yōu)良純合顯性不育系。2.二環(huán)系法(雜交自交法)在不育材料群體中，選擇經(jīng)濟(jì)性狀較好不育性敏感的不育株與一優(yōu)良自交系雜交，然后在其后代中選經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良不育性敏感的不育株連續(xù)自交5代左右，可從中選育出優(yōu)良的純合顯性不育株。3.回交法選經(jīng)濟(jì)性狀較好，不育性敏感的不育株為母本，經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良、配合力好的自交系為父本，連續(xù)回交5代左右，然后選敏感不育株自交，可從中選育出優(yōu)良的純合顯性不育株。通過近幾年的鑒定，已篩選出幾份優(yōu)良的純合顯性不育系，318P5、330L13、323P2、323P6等(表6)。表5.幾份優(yōu)良純合顯性不育系不育性表現(xiàn)純合年份1995年1996年不育系試驗地點(diǎn)大棚露地合計大棚露地陽畦合計調(diào)查株數(shù)372012231651318-P5不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100調(diào)查株數(shù)33643411330-L13不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100調(diào)查株數(shù)333339323-P2不育株率100100100100100100不育度100100100100100100調(diào)查株數(shù)331623948323-P6不育株率100100100100100100不育度100100100100100100表6優(yōu)良純化顯性雄性不育系318p5不育性表現(xiàn)1996春調(diào)查日期地點(diǎn)株號4.114.144.164.194.234.254.285.15.45.75.111---------------------------------大2---------------------------------棚3---------------------------------4---------------------------------陽5---------------------------畦6---------------------------7---------------------------露8---------------------------地9---------------------------10---------------------------注---表示徹底不育、無花粉三、優(yōu)良顯性雄性不育系的繁殖技術(shù)純合顯性不育株不育性穩(wěn)定，在各種不同環(huán)境下不出現(xiàn)花粉，因此，純合顯性不育株不能自交繁殖，需要在試驗室條件下用組織培養(yǎng)的方法保存、擴(kuò)繁。一般在4-5月份取純合顯性不育株的花枝或側(cè)芽在試驗室進(jìn)行組織培養(yǎng)，9-10月份將生根的組培苗移植于大田。冬季在保護(hù)地越冬春化，第二年春季開花。如果直接用純合顯性不育系配制雜交種則成本太高，用純合顯性不育系與可育的自交系(保持系)雜交，獲得不育性穩(wěn)定的顯性雄性不育系，用這種顯性不育基因雜合的雄性不育系制種，則可大大降低生產(chǎn)成本。但是，由于該不育材料的不育性除受顯性主效基因控制外，還受微效修飾基因的影響，不育性的表現(xiàn)與基因背景的關(guān)系十分密切，因此，并不是所有可育自交系與純合顯性不育系雜交都可獲得不育性穩(wěn)定的雄性不育系，而需要通過廣泛測交篩選臨時保持系，優(yōu)良的臨時保持系應(yīng)具有以下幾個條件1.與純合顯性不育系測交其后代不育性穩(wěn)定(不育株率達(dá)到100％，常年不育度100％或不低于95％)。2.主要農(nóng)藝性狀優(yōu)良、穩(wěn)定一致，并與純合顯性不育系相似。3.自交親和或不親和性弱，開花結(jié)實性狀好。用連續(xù)自交法或二環(huán)系法選育純合顯性不育系時，臨時保持系主要由可育的姊妹系中篩選。用回交法選育純合顯性不育系時，回交父本本身就可能是優(yōu)良的臨時保持系用優(yōu)良的純合顯性不育系作母本，臨時保持系作父本，兩者按3∶1定植于特別嚴(yán)格的隔離區(qū)內(nèi)自由授粉，由純合顯性不育系植株上收到的種子即是用于配制一代雜種的顯性雄性不育系種子。通過近幾年的篩選，現(xiàn)在獲得95-414、95-415、95-438、95-422、95-423、94-346、96-291、96-296、96-304、96-305等幾份顯性雄性不育系，他們在不同環(huán)境條件下，不育株率都達(dá)到100％，不育度也達(dá)到100％或接近100％(表7、表8)。表7。幾份優(yōu)良顯性雄性不育系不育性表現(xiàn)顯性年份1995年1996年育系試驗地點(diǎn)大棚露地合計大棚露地陽畦合計÷調(diào)查株數(shù)10354538189294-346不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100調(diào)查株數(shù)61420911183895-414不育株率100100100100100100100不育度10010010099.910099.999.9調(diào)查株數(shù)64104391695-415不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100調(diào)查株數(shù)538832246495-438不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100表8顯性雄性不育系95-415不育性表現(xiàn)1996春調(diào)查日期地點(diǎn)株號4.114.144.194.234.254.285.15.45.75.111------------------------------大2------------------------------棚3------------------------------4------------------------------5------------------------------6------------------------------7------------------------------陽8------------------------------畦9------------------------------10------------------------------11------------------------------12------------------------------13------------------------------露14------------------------------地15------------------------------16------------------------------注---表示徹底不育、無花粉四、優(yōu)良雜交組合的選配及其制種技術(shù)(一)優(yōu)良雜交組合的選配選配甘藍(lán)顯性雄性不育系優(yōu)良雜交組合的方法基本上與其他常規(guī)育種途徑相同，選用配合力好、主要性狀及來源與不育系有一定差異的自交系作父本與雄性不育系雜交，進(jìn)行配合力測定，選出最優(yōu)組合。為降低父本繁殖的成本用作父本的自交系最好是在隔離條件下自由授粉繁殖的自交親和系。通過近幾年的努力，已初步選出96春118、96春128、96春129、96秋172、96春193、96秋219等幾個優(yōu)良組合，其主要性狀見表9。表9.幾個顯性雄性不育系配出的優(yōu)良雜交組合調(diào)查項目開展度外葉球?qū)挕燎蚋咧行闹L緊實度平均單球重折畝產(chǎn)增產(chǎn)％定植到收組合(cm)數(shù)(cm)(cm)(Kg)(Kg)獲天數(shù)96春11843.2×43.812.214.6×15.48.30.500.863931.138.715296春12834.6×34.89.011.8×13.76.90.680.693154.011.695296春12941.6×41.611.012.7×13.76.70.610.703199.712.9052中甘11號41.0×41.016.612.5×13.58.60.560.622834.0CK5296秋17254.6×57.014.018.9×14.96.80.521.444113.56.15996秋19358.0×55.417.221.2×14.57.60.421.444113.56.15996秋21953.2×53.016.719.8×15.26.30.471.484227.89.159中甘8號59.6×60.616.225.2×12.75.20.401.673876.1CK82(二)顯性不育系的制種技術(shù)1.適期播種甘藍(lán)為植株春化植物，雄性不育系和父本自交系若播種過晚，會因植株過小而不易抽薹開花，若播種過早不僅易發(fā)生病害，而且在種株后期發(fā)生早衰。華北地區(qū)適宜的播種期，早熟材料為8月下旬，晚熟材料在7月下旬到8月上旬。2.保護(hù)制種親本安全越冬并完成春化華北中部及其以北地區(qū)，種株應(yīng)假植在陽畦等保護(hù)條件下越冬。華北南部種株可在露地越冬，為防凍害可在種株基部培土。3.嚴(yán)格注意制種田的空間隔離甘藍(lán)容易與甘藍(lán)類作物發(fā)生雜交，因此，甘藍(lán)制種田與其他甘藍(lán)類采種田空需間隔離1000米以上。4.保證蜂源甘藍(lán)為蟲媒花，雄性不育系無花粉不能自交，雜交時全靠父本自交系提供的花粉授粉，每畝制種田至少要放一箱蜂，才能基本上滿足傳粉需要。5.控制雙親制種時的適宜比例用雄性不育系制種，只有從雄性不育系植株上收獲的種子是一代雜種，為提高雜交種的產(chǎn)量，制種時可適當(dāng)加大雄性不育系種株的比例，一般不育系的比例以3∶1為宜。6.嚴(yán)格保證親本純度在制種的各個環(huán)節(jié)，注意親本的去雜去劣，開花期若在雄性不育系中偶然現(xiàn)微量花粉株，也應(yīng)盡量盡快拔除。權(quán)利要求1.一種甘藍(lán)顯性核基因雄性不育系的選育及其制種方法，包括顯性核型雄性不育基因的選擇，純合，保存，繁殖不育系，配制雜交種，其特征在于從甘藍(lán)材料79-399繁殖田的自然群體中選擇含有CDMs399-3基因的顯性核不育系，用顯性核不育系與篩選的保持系雜交繁殖不育系，用顯性核不育系與自交系配制雜交種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用自交、回交、測交方法純合顯性核不育系。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用組織培養(yǎng)方法保存顯性核不育系。全文摘要本發(fā)明利用甘藍(lán)顯性核型雄性不育基因CDMs399-3在一定遺傳環(huán)境條件下的敏感性，通過自交、回交、測交選育出純合顯性不育系，利用組織培養(yǎng)保存，繁殖純合顯性不育系，通過測交篩選臨時保持系，用臨時保持系與純合顯性不育系雜交獲得不育株率100％，不育度100％或不低于95％的不育系，不育系與配合力優(yōu)良的自交系雜交配制一代雜種。該方法具有雜交制種時一代雜種種子雜交率能達(dá)到100％，親本原種不需人工授粉，從而降低制種成本等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號A01H1/02GK1158216SQ9612078公開日1997年9月3日申請日期1996年11月28日優(yōu)先權(quán)日1996年11月28日發(fā)明者方智遠(yuǎn),孫培田,劉玉梅,楊麗梅,王曉武,莊木,侯安福,卞春松申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所