專利名稱：：防治土壤害蟲的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及防治土壤害蟲，特別是有害昆蟲的改進(jìn)組合物，所述組合物含有生物防治劑。在全球許多種主要作物中，如根蠕蟲，切根蟲，根蠅和線蟲的土壤害蟲會造成其產(chǎn)量的嚴(yán)重下降。在一些情況下，憑借化學(xué)農(nóng)藥會得到令人滿意的防治效果，但是防治土壤害蟲的很多種主要產(chǎn)品受到有關(guān)當(dāng)局限制或撤銷的威脅。因此，開發(fā)防治土壤害蟲的生物防治劑是所期望的目標(biāo)。在開發(fā)生物防治劑的過程中，要克服的最明顯的技術(shù)障礙可能是制劑。基于蘇云金桿菌的產(chǎn)品除外，現(xiàn)存的大多數(shù)的生物防治劑都不能滿足效果，殘效期和低造價的要求(Rhodes，1990，AspectsofAppliedBiology24145-153)。將真菌用于土壤害蟲防治的情況下更如此。到目前為止，只得到非常少的上述產(chǎn)品，通常在田間作過測試的制劑是基于簡單的半固體發(fā)酵方法，如施用在谷粒上的菌落(Keller&Zimmermann，1989，239-270頁，inWildingetal.Insect-FungusInteractions.AcademicPress，London)，可選擇地，如Andersch等人，在1990.EP87116-508中所述的方法，使真菌在液體培養(yǎng)物中生長成為菌絲團(tuán)，然后脫水并施用到土壤中，類似的方法，如Krueger&Roberts所述，使用菌絲碎片(SocietyforInvertebratePathologyAnnualMeeting，1988，使用WO84/01089中所述的技術(shù))。將生物量的真菌在液體培養(yǎng)物中液面下發(fā)酵是較理想的，這是因為這種生產(chǎn)方法適合于現(xiàn)存的工業(yè)生產(chǎn)，且生產(chǎn)的費用相對低。當(dāng)在液體培養(yǎng)物中生長時，許多昆蟲致病真菌，如白僵菌屬(Beauveria)，輪枝菌屬(Verticillium)，蛾霉菌屬(Nomuraea)，Tolypocladium屬，擬青霉菌屬(Paecilomyces)(Bartlett&Jaronski，1988.Pp.61-85inBurge.FungiinBiologicalControlSystems.ManchesterUniversityPress.Manchester)和綠僵菌屬(Metarnizium)(Andersch，1992.Pflanzenschutz-NachrictenBayer45129-142)會產(chǎn)生酵母狀的芽生孢子。令人遺憾的是，這些孢子結(jié)構(gòu)精細(xì)，并難于配制(Andersch，VideSupra)。有關(guān)成功地配制芽生孢子的描述并不多。Blachere等人，1973。在AnnZool.Ecol.anim.569-79中描述了一種通過在二氧化硅上干燥保存卵孢白僵菌(Beauveriatenella)芽生孢子的方法，但是其中不含有刺激真菌在土壤中生長的營養(yǎng)物，結(jié)果所得的粉末狀物質(zhì)不適于以顆粒狀向土壤施用。另外，此干燥方法(在通風(fēng)爐中干燥5至36小時)以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)是不實用的。Fargues等人1979，Ann.Zool.Ecol.Anim.11247-257試圖配制的白僵菌的芽生孢子。盡管在冷凍條件下上述制劑可保持八個月的活力，可是即使在5℃下貯藏，該物質(zhì)在五個月內(nèi)即失效。Fargues等人，1983.J.Invert.Pathol.41，131-142探討了某些粘土的性質(zhì)對芽生孢子在土壤中活性擴(kuò)展的影響。可是，根據(jù)這些并不能生產(chǎn)出農(nóng)用制劑。Ward，1984.Pp.175-184inScher.AdvancesinPesticideFormulationTechnology.ACS.WashingtonDC.間接提到了選擇特殊的粘土配制昆蟲致病真菌的繁殖體。曾經(jīng)被描述過的施用到土壤的真菌制劑是用于害蟲防治目的外的，非芽生孢子形成的真菌的情況。例如Lewis&Papavizas，1987，PlantPathology36438-446描述的，通過藻酸鹽包囊的方法將木霉屬(Trichoderma)和膠霉屬(Gliocladium)的真菌混入顆粒劑中。Knudsen&Lin，1990.Phytopathology80724-727把營養(yǎng)物質(zhì)混入到這些類似的真菌制劑中，加入營養(yǎng)物質(zhì)會增加顆粒位點上菌絲的密度，但不能增加菌絲在土壤中擴(kuò)展的距離。由此可見，本發(fā)明的與土壤害蟲致病真菌的芽生孢子混合的并能使真菌在土壤中生長并繁殖的的農(nóng)用制劑對上述害蟲的生物防治具有相當(dāng)大的價值。因此本發(fā)明提供了一種顆粒組合物，其中包含以芽生孢子形式存在的，殺蟲活性量的真菌生物防治劑。除了芽生孢子之外，上述真菌芽生孢子的顆粒劑還包含選自菌絲體斷片，固體稀釋劑或支持物(本文下述稱為“填料”)和施用后使真菌生長和繁殖的復(fù)合營養(yǎng)源的其它成分。另外，顆粒劑可含有其它物質(zhì)如防腐劑，抗氧劑，鉺料或引誘劑，和滲透調(diào)節(jié)劑。真菌接種物的生產(chǎn)是用活的繁殖體接種到如Sabouraud’s葡萄糖肉湯液體培養(yǎng)基上，繁殖體由如白僵菌屬，綠僵菌屬，擬青霉菌屬，蛾霉屬，Tolypocladium屬，多毛菌屬或輪枝菌屬中的一種真菌的分生孢子，芽生孢子或菌絲體組成。培養(yǎng)基被放在如燒瓶或發(fā)酵桶的容器中。然后在適合真菌生長的條件下使培養(yǎng)物生長幾天，接著通過離心或過濾收集生物量的，由芽生孢子和菌絲斷片混合物組成的真菌。從制備物中還可以除去水，例如加壓除水。填料例如可以是礦物土如高嶺土(陶土)，蒙脫石，硅藻土，硅石，漂土，等等。在組合物中使用的營養(yǎng)物質(zhì)可以是細(xì)的植物粉，如以下實施例6中所例示的。營養(yǎng)物質(zhì)的選擇將根據(jù)在組合物中使用的真菌生物防治劑而變化。填料和營養(yǎng)物可按所需比例一起混合，例如通過攪拌混合，而且它們還可與生物量的真菌混合。攪拌所得混合物直到獲得均勻的混合物。將水，優(yōu)選去離子水加入混合物直到其稠度適合于擠出產(chǎn)物。然后在壓力下擠出糊狀物以形成顆粒。顆粒可以是球狀體。顆粒干燥后，例如在流動床或強(qiáng)氣流下干燥后，接著可在室溫下貯藏直到應(yīng)用，例如在真空下，在氮氣條件下，或在如硅膠的干燥劑存在下貯存?？蓪㈩w粒劑施用到土壤，或植物表面如玉米植株的輪生葉，此后在孢子形成前真菌借助菌絲的擴(kuò)展生長，以增加真菌與敏感宿主相遇的可能性。本發(fā)明的另一方面是提供了一種防治對真菌生物防治劑敏感的土壤寄居害蟲的方法，其中包含向土壤施用根據(jù)本發(fā)明的顆粒組合物。實施例1使用滅菌接種環(huán)，用事先已顯示出對黃瓜條葉甲(Diabroticabalteata)致病性的昆蟲致病真菌球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌株的分生孢子對盛于250ml錐形瓶中的50mlSabouraud’s葡萄糖肉湯接種。接錐形瓶放在開到200rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，在24℃的溫度下振蕩7天然后培養(yǎng)由芽生孢子和菌絲體斷片組成的混合物，其中含有大約95％的芽生孢子。在SorvallRC3C搖桶式旋轉(zhuǎn)器上以5000rpm，將生物量真菌離心10分鐘，然后在消毒蒸餾水中再次懸浮并再次離心兩次，在幾層手紙之間擠壓片狀沉淀物以除去過量的液體，使最終的含水量為75-85％。在杵和研罐中，以14∶5的重量比混合以制備由GTY粉(高嶺土)和Fulgel(漂土)組成的粘土混合物。然后以83∶17的重量比將其與芽生孢子/菌絲體的斷片的混合物一起研磨。以大約1∶5的重量比向混合物中加入去離子水，直到糊狀物的稠度適合擠出。加壓通過0.5mm的Endecoot篩擠出糊狀物。所得顆粒是球狀的，并在室溫下在流動床上使之干燥25分鐘，然后將其貯藏在存有硅膠的真空包封的干燥器中。顆粒活力的測定是通過在0.05％Tween80中使顆粒均漿，并懸浮放置于含有0.05g/l氯霉素的Sabouraud’s葡萄糖瓊脂上。令人驚奇地是，發(fā)現(xiàn)顆粒干燥后仍保持活力，回收了2×107群落形成單元(cfu)/g。Tween80是含有聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單油酸酯的表面活性劑的注冊商標(biāo)。實施例2如上所述通過使真菌在含有500ml培養(yǎng)肉湯的1升錐形瓶中生長六天而生產(chǎn)生物量的真菌。如實施例1中所述制備顆粒，只是在制造擠出糊狀物之前，通過以重量比50∶33∶17粘土混合物∶營養(yǎng)物∶生物量真菌混合粘土混合物和生物量真菌與營養(yǎng)物提供營養(yǎng)源。在通風(fēng)櫥中將顆粒風(fēng)干大約16小時。土壤菌落是通過在田間容量的松蓋的通用塑料容器中將1g干燥顆粒放置在兩層5g田間土壤中間而測定的。在24℃培育18天后測量從顆粒層的徑向生長，并且測評價孢子的形成。營養(yǎng)源特別是大豆粉的存在能夠促進(jìn)生長和孢子的形成。實施例3如實施例2所述的制備擠出顆粒，其含有或不含營養(yǎng)物(33％豆粉)并含有按重量計濃度為1.7％，10％或17％的菌絲斷片或芽生孢子。如實施例1中所述生產(chǎn)主要由芽生孢子組成的接種物。通過使真菌在同樣的培養(yǎng)基和同樣的溫度下生長，但不振蕩而生產(chǎn)主要由菌絲體組成的接種物。然后用去離子水沖洗菌絲體，在用Whatman1號濾紙過濾收集之前，均漿生成菌絲斷片。以按重量計1％或3％的劑量，向在塑料小盆中的土壤加入顆粒。土壤濕度調(diào)為23％。向8個盆中的每一盆播種一棵發(fā)芽的玉米種子，并同時用10個一齡的黃瓜條葉甲或玉米根葉甲(Dvirgifera)幼蟲侵染。將盆在20℃下保持10天，然后評價幼蟲的死亡率。結(jié)果示于表2，表明向顆粒中加入營養(yǎng)源后，會增加所有種的死亡率，此次試驗加入的是大豆粉。菌絲用Hy表示，芽生孢子用Bs表示。實施例4如實施例2中所述的生產(chǎn)主要由芽生孢子組成的接種物，除了真菌是生長在含有400ml培養(yǎng)基的1升燒杯中。接種物生長4天或7天。如實施例2中所述制備擠壓顆粒，擠壓后將顆粒在20℃的流化床干燥器上干燥8至30分鐘，若是最終水分含量＜3％的顆粒，則需要在20℃下干燥16分鐘并在30℃下干燥15分鐘。測定顆粒的水分含量，然后將顆粒真空包封在袋中并在實驗室溫度(20-25℃)下貯藏六個月。結(jié)果示于表3。盡管真空包封后仍發(fā)現(xiàn)在實驗的末期顆粒的水分含量已發(fā)生了變化，但很顯然干燥顆粒能夠提高貯藏穩(wěn)定性。有一些證據(jù)證明，對于干燥的顆粒生長7天的真菌比生長4天的真菌增加了穩(wěn)定性。實施例5如實施例4所述制備擠壓顆粒，其中含有按重量計33％的大豆粉，17％生物量真菌(生長3天)，45％的填料(GTY，CalfloE，CelitePF或Celite500)和5％粘著劑(Fulgel，Borrebond或PEG40000)。不含粘著劑的顆粒含有按重量計50％的填料。將顆粒風(fēng)干，然后如實施例3所述對黃瓜條葉甲進(jìn)行生測，不同之處是以1％的重量比將顆?；烊胪寥溃⑶以谇秩?天后測定死亡率。在土壤中真菌的種群，用cfu/g表示，它是通過在Doberski和Tribe，1980，TransactionsoftheBritishMycologicalSociety74，95-100的選擇培養(yǎng)基上輔覆土壤懸浮液的稀釋液而測定的。結(jié)果示于表4。由于各種填料/粘著劑混合物具有類似的作用，由此可推斷出，根據(jù)顆粒所需的物理性質(zhì)，各種填料和粘著劑可被代替。CalfloE，CelitePF和Celite500是從Celite(UK)Limited，LivingtouRoad，HassleNorthHumbersideHu13OEG得到的填料粉末產(chǎn)品的商品名。實施例6如實施例5中所述制備顆粒，以下述比例將營養(yǎng)物與顆粒的其它成分混合33％營養(yǎng)物，17％生物量真菌，45％GTY，5％Fulgel。測定了下述營養(yǎng)源葵花籽粉，杏仁粉，綠豆粉，蔬菜蛋白質(zhì)組織(TVP)粉，大麥片粉，蘋果和香蕉烤谷糠粉，黑麥粉，大豆粉，麥芽和Hijiki海藻粉。干燥后，如實施例3中所述，用黃瓜條葉甲對顆粒進(jìn)行生物測定。在盆中以土壤量的1％和0.5％加入顆粒，7天后測定死亡率，加入0.1％顆粒的處理，在12天后測定死亡率。如實施例5中所述在作評價時，對真菌的繁殖體計數(shù)。將顆粒在實驗室溫度下在部分真空條件下保存10個月，以研究貯藏穩(wěn)定性。結(jié)果示于表5和表6。從上述結(jié)果可以清楚地發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)源不同其作用效果和顆粒的貯藏穩(wěn)定性就不同。從效果殘效期的結(jié)合來看最好的營養(yǎng)源是葵花籽粉，杏仁粉和大豆粉。實施例7如實施例2中所述制備顆粒。在擠壓之前以按重量計33％的濃度將營養(yǎng)源加入到混合物中。測試的營養(yǎng)源是蕎麥粉，西谷粉，aduki豆粉，大麥片粉，鷹嘴豆粉，葵花籽粉，杏仁粉，黑米粉，角豆，細(xì)麥麩，全代蛋粉和全麥粗面粉。干燥后，通用塑料容器中，將1g的顆粒放在兩層5g的土壤中，調(diào)至田間容積(fieldcapacity)。在20℃培育31天后透過容器的透明壁評價徑向生長和孢子形成。根據(jù)0至4的設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)目測評價孢子的形成。應(yīng)用五種不同的土壤源評價不同土壤類型范圍的顆粒支持真菌生長和孢子形成的能力。結(jié)果示于表7。上述證明，為了使真菌在土壤中生長和形成孢子需要營養(yǎng)源。與其它供試的材料相比，葵花籽粉和杏仁粉明顯地優(yōu)越。實施例8根據(jù)實施例5中的方法制備顆粒，不同之處是如下所述進(jìn)行的變化，在擠壓混合物之前使生物量真菌生長四天。顆粒含按重量計17％生物量真菌，33％的營養(yǎng)源(大豆粉或葵花籽粉)。加入濃度為5％的其它成分(PEG4000(分子量4000的聚乙二醇)和植物油，如豆油，玉米油或花生油)，剩余部分由GTY粉組成。將顆粒在實驗室溫度下，在真空包封的干燥器中，貯藏12個月。貯藏后0，1，4，8和12個月測定活力。結(jié)果示于表8。在貯藏期間采用葵花籽粉制備的顆粒比用豆粉制備的顆粒穩(wěn)定。加入1％的葵花籽油，玉米油，花生油，或PEG會提高用豆粉制備的顆粒穩(wěn)定性。12個月后，如實施例3中所述，用黃瓜條葉甲對顆粒進(jìn)行生物測定。將按重量計0.5％和1％的顆?；烊胪寥乐校謩e在9天和8天后評價死亡率。結(jié)果示于表9。試驗證明在12個月的貯藏期結(jié)束時，所有的顆粒都保持一定的活性，采用葵花籽粉，大豆粉＋PEG，和大豆粉＋花生油的顆粒在試驗中活性最高。實施例9如實施例5中所述制備顆粒，不同的是生物量真菌生長五天，并且顆粒含17％生物量真菌，33％葵花籽粉，和50％GTY/Fulgel。用未過篩的田間土壤(WisboroughGreen淤泥肥土)填充二個大聚丙烯魚池，在魚池的底部鋪上一層粗砂和沖洗過的白砂以幫助排水。在每個池中耕出兩道大約8cm寬，6cm深，90cm長并間隔75cm的犁溝，在每個犁溝的底部播種二十顆甜玉米(品種Earliking)的種子。在未處理池中將從犁溝中移去的土直接放回，而在處理的池中每犁溝土與1.93g顆粒混合后放回，在與種子直接接觸土壤層中顆粒的濃度最大。在實驗過程中濕度保持在15-20％，播種一周后，每壟的幼苗數(shù)減至11。播種二周后在每池土壤的28個凹陷處每個放入5只新孵化的黃瓜條葉甲幼蟲。一周后，如上述再向土中放入70只幼蟲。播種后38天，測定植珠的高度，并從每個池子中移出土壤樣品。將土壤樣品暴露在60℃的溫度下18小時使菌絲和芽生孢子失活以確定孢子數(shù)。從14次重量樣品中計算孢子數(shù)，然后如實施例5中所述通過稀釋涂覆而測定。從土壤中移出植物，根據(jù)1-10的標(biāo)準(zhǔn)評價根損傷，10為損傷最嚴(yán)重。移出植物后，用聚乙烯膜覆蓋土壤，以使其中包含的黃瓜條葉甲的成蟲在17天內(nèi)羽化。將這些計算在內(nèi)并記錄下所有癥狀。結(jié)果示于表10。上述證實了，當(dāng)用商業(yè)上可接受的劑量向田間土壤中施用本顆粒時，本顆粒會導(dǎo)致真菌在土壤中建有效的種群，并在幾周內(nèi)保持該種群。實施例10如實施例5中所述制備顆粒，但有如下述的改變。真菌接種物生長兩或七天。在混合前，將生物量的真菌在去離子水，6摩爾山梨醇，40％W/V的PET4000，或甘露糖醇和氯化鎂的混合物(每升去離子水中分別為74g和27g)浸泡兩小時；在去離子水中沖洗四次共20分鐘，并與含有大豆粉的顆?；旌??？芍苯优渲撇缓袪I養(yǎng)源的顆粒，這種顆粒不需要與滲透調(diào)節(jié)劑接觸。將顆粒樣品在實驗室溫度下在干燥器中真空貯藏0、1、6和12個月。結(jié)果示于表11?？梢姰?dāng)培養(yǎng)兩天的生物量真菌與大豆粉一起配制時的差的貯藏穩(wěn)定性，可通過在配制制劑之前用滲透調(diào)節(jié)劑處理生物量的真菌，或通過延長以獲時間而克服。實施例11如實施例5中所述制備顆粒。在制備顆粒之前可用防腐劑抗壞血酸(0.5％)，生育酚(0.026％)或BHA/BHT(丁基化的羥基苯甲醚和丁基化的羥基甲苯1∶1的混合物(0.014％))改良豆粉的半成品。干燥后，或是將顆粒貯藏在真空包封的袋中或是貯藏在真空條件下硅膠存在的干燥器中。如實施例3中所述，制備后馬上和在實驗室溫度下貯藏六個月后用黃瓜條葉甲對顆粒進(jìn)行生物測定。加入的顆粒是土壤量的0.5％，并在土壤中培育三天使得在加入幼蟲前真菌生長和孢子形成。侵染七天后評價死亡率。結(jié)果示于表12?？梢?，加入防腐劑BHA/BHT可提高且最適條件下的貯藏穩(wěn)定性。表1</tables>表2表3表4對照死亡率8％表5<p>表6表7Champ.＝淤泥肥土Champaign，IL，USAPTM＝砂質(zhì)肥土PearTreeMeadow，Jealott’sHill，Berkshire，UKEA＝砂質(zhì)肥土EastAngliaFieldStation，Mildenhall，Suffolk，UKPent＝砂質(zhì)肥土PenfurzenField，Jealott’sHill，Berkshire，UKPeat＝市售泥炭堆肥RG=徑向生長(mm)Sp.＝孢子形成0＝孢子形成，4＝大量孢子形成表8表9對照死亡率(混入0.5％)＝0％對照死亡率(混入1.0％)＝5％表10表11表12在0月對照死亡率8％，在六個月6％權(quán)利要求1.一種顆粒組合物，其中包含殺蟲活性量的真菌生物防治劑，所述防治劑以芽生孢子的形式存在。2.根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒組合物可選擇地包含一種或多種其它成分，該成分選自真菌生物防治劑的菌絲體斷片，固體稀釋劑或支持物和吱持真菌生長和孢子形成的復(fù)合營養(yǎng)源。3.根據(jù)權(quán)利要求2的顆粒組合物另外還可含有選自防腐劑，抗氧劑，鉺料或引誘劑和滲透調(diào)節(jié)劑的一或多種其它成分。4.根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒組合物，其中真菌生物防治劑是昆蟲病原體。5.根據(jù)權(quán)利要求4的顆粒組合物，其中昆蟲病原體選自白僵菌屬(Beauveria)，輪枝菌屬(Verticillium)，蛾霉菌屬(Nomuraea)，多毛菌屬(Hirsutella)，Tolypocladium屬，擬青霉菌屬(Paecilomyces)和綠僵菌屬(Metarhizium)。6.根據(jù)權(quán)利要求5的顆粒組合物，其中昆蟲致病菌是球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。7.防治對真菌生物防治劑的作用敏感的土生有害昆蟲的方法，其中包含向害蟲存在或預(yù)期存在的土壤中施用根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒組合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中真菌生物防治劑是球孢白僵菌。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中的害蟲是葉甲屬(Diabroticaspp.)害蟲。全文摘要一種包含殺蟲活性量的真菌生物防治劑的顆粒組合物，所述的防治劑中存在有芽生孢子。文檔編號A01N63/04GK1121684SQ94191879公開日1996年5月1日申請日期1994年12月14日優(yōu)先權(quán)日1993年12月29日發(fā)明者D·J·羅斯,J·方德林,J·T·波特申請人:曾尼卡有限公司