專利名稱:一種生物除草劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用微生物防除農(nóng)田雜草的技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種利用真菌菌株防除農(nóng)田雜草的生物除草劑及該除草劑的制備方法，專用于農(nóng)田雜草馬唐、牛筋草和稗草等的防除。
背景技術(shù)：
隨著人們對化學(xué)除草殘留、環(huán)境污染以及耐藥和抗藥性雜草發(fā)展的認識、綠色食品和有機農(nóng)業(yè)的大力推廣，研制生物除草劑防除雜草已成為生產(chǎn)上的迫切需求，它具有投資少、研制周期短、專一性強、對環(huán)境安全、不產(chǎn)生污染等優(yōu)點。目前，商業(yè)化的生物除草劑品種有80年代初研制出的DeVine和Collego以及90年代末推出的Comperico和Biochon。這些除草劑在控制相對的目標雜草上起到了重要作用，如DeVine的持效性可以保證使用一次，2-3年無須再除草。有希望商業(yè)化的生物除草劑項目有數(shù)十項，其中防除稗草、野荸薺等雜草的生物除草劑品種具有十分誘人的前景。
單子葉雜草馬唐(Diditaria sanguinaris)是世界上公認的18種惡性雜草之一，廣泛分布于世界熱帶和溫帶地區(qū)，是玉米、高粱、大豆、花生等秋熟旱作物田的惡性雜草，對棉花、煙草、麻類、甘蔗等幼苗生長危害也十分嚴重，同時也是蔬菜田、果園、草坪和園藝作物田的優(yōu)勢雜草。在中國，馬唐的危害面積大約在6千萬公頃左右，由其引起的作物損失占秋熟旱作物田雜草總損失的一半以上。該雜草繁殖能力強，生長速度快，生長期長，消耗地力、遮光、耐藥性強，人工、機械防除比較困難。目前，化學(xué)防除雖然有效，但是，化學(xué)除草劑的長期使用引起抗性雜草的產(chǎn)生和嚴重的環(huán)境污染，導(dǎo)致土地退化。因此研制生物除草劑防除馬唐不僅可以有效防除該雜草，而且對環(huán)境安全性高。目前，關(guān)于馬唐真菌除草劑的研究，美國已申請了利用彎孢霉屬(Curvulariaintermedia Boedijn)菌株(國際真菌學(xué)會收藏，保藏號為361688(MT-5)，361689(CG-L)，375263(MT-6)，375264(MT-7))生物控制馬唐的專利，專利號為5,635,444和5,952,264。但該專利文獻在提出其使用技術(shù)與生產(chǎn)方法時，僅明確對大豆、棉花比較安全，而對玉米和水稻等單子葉作物的安全性及其使用并未提及。此外，國內(nèi)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)已申請了利用雙曲孢霉(Nakataea Hara)菌株QZ-2000(保藏號CGMCC NO.0640)生物控制馬唐的專利(ZL專利號01134002.9)，但其單菌株防效不理想，需由幾個單株的孢子按比例混合后噴施才能達到較好的防除效果，這就增加了生產(chǎn)的難度。同時，真菌除草劑的一個重要特點就是它對環(huán)境條件的要求較為苛刻，只有當在能充分滿足該菌劑對水分和溫度的要求條件下，才能保證該菌株對雜草的有效侵染，才能取得良好的防除效果，而對異地生態(tài)條件不一定能適應(yīng)，易具有一定的地域性，因此，為解決這一難題只有選擇對寄主侵染時所要求的環(huán)境條件較寬，易能滿足的寄生真菌菌株，才具有較寬廣的推廣應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是針對惡性雜草-馬唐，長期使用化學(xué)除草劑所帶來的弊病，和現(xiàn)有生物除草劑品種稀少、對異地生態(tài)條件不易適應(yīng)、使用麻煩、效果不佳的缺陷，提出一種由篩選獲得的真菌菌株制備而成，以防除馬唐為主，兼除狗尾草、稗草、牛筋草等雜草，對農(nóng)作物安全，尤其是對單子葉作物安全，應(yīng)用適應(yīng)性廣，成本低廉，無污染的生物除草劑；本發(fā)明的另一目的是提出該生物除草劑的制備方法。
本發(fā)明致病真菌的分離、篩選與鑒定從浙江省余姚采集到罹病馬唐葉片，剪取病健交界處葉片，用6％次氯酸鈉溶液進行表面消毒，然后置于PSA培養(yǎng)基上，在25℃恒溫箱中培養(yǎng)，一周后進行單菌分離純化，進而，進行單菌株產(chǎn)孢子量、防除馬唐等單子葉雜草效果試驗，從中篩選出高產(chǎn)高效菌株Mds0404，并在PSA培養(yǎng)基上觀察該病原菌的顯微形態(tài)和形態(tài)特征，按照真菌鑒定手冊進行鑒定菌株Mds0404屬半知菌類(Fungi Imperfecti)，叢梗孢目(Moniliales)，叢梗孢科(Moniliadeae)，彎孢霉屬(Curvularia Boedijn)；在含有蔗糖、葡萄糖和硝酸鉀基質(zhì)的PDA培養(yǎng)基中生長良好，菌落為灰褐色或灰綠色，以磷酸氫二銨和尿素為基質(zhì)時菌落為黃褐色，以甘油和檸檬酸三鈉為基質(zhì)時菌落為無色；該菌分生孢子梗分化明顯，單生或叢生，直立或彎，橄欖色或黑色，有隔膜，48-196×4-6um，單枝或偶爾在頂部分枝，細長；分生孢子連續(xù)形成，頂部產(chǎn)孢部分合軸式延伸，常作屈膝狀，新孢子生在前一個孢子下方生出的新枝頂端；孢子大小為24-36×8-15um，梭形或橢圓形，具3個隔膜，中隔居中或基本居中，直或彎向一側(cè)，兩端細胞小而鈍圓，無色或淡色，中部兩個細胞大，色深分生孢子褐色，寬紡錘形，3個隔膜，中隔居中，不彎曲或微彎，兩側(cè)對稱，大小為24-36um*10-18um。
該菌株已于2006年9月30日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏號No.1827。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種生物除草劑，以彎孢霉(Curvularia Boedijn)菌株Mds0404為產(chǎn)孢菌種，該除草劑的組分與各組分的重量百分比含量為
純孢子 80-95％化學(xué)除草劑 0-18％輔助劑 2-5％。
所述化學(xué)除草劑為阿特拉津、甲草胺、乙草胺、異丙甲草胺、丙草胺、異丙隆、綠麥隆、惡草靈、敵草隆、果爾或玉農(nóng)樂等；所述輔助劑為吐溫20、吐溫80、葡聚糖、植物油、纖維素、聚醚硅油等；一種制備所述生物除草劑的方法，按以下步驟進行(1)培養(yǎng)基的準備菌株Mds0404可用PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、麩皮培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、淀粉酵母培養(yǎng)基或Czapek培養(yǎng)基活化并誘導(dǎo)分生孢子的產(chǎn)生；(2)菌株Mds0404的活化培養(yǎng)挑取少許保存的該菌菌絲塊至步驟(1)任一平皿培養(yǎng)基中，28℃恒溫暗培養(yǎng)，活化菌株；(3)菌株種子液的培養(yǎng)挑取少許步驟(2)培養(yǎng)的菌塊，接入盛有步驟(1)任一培養(yǎng)液(不含瓊脂)的三角瓶中，28℃，150rpm，振蕩培養(yǎng)3-5天至產(chǎn)生豐富菌絲球，待用；(4)菌種孢子的生產(chǎn)培養(yǎng)與收集可以采用固體或液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)的方法，在無菌條件下，將Mds0404菌絲塊或液體培養(yǎng)的菌絲球接種于裝有半熟麥粒的茄子瓶中，置于25-28℃黑暗培養(yǎng)6-8天，待菌絲長滿固體培養(yǎng)基后，將麥粒搗散，平鋪于平板上，控制至40-65％的濕度，12小時間隔黑光燈光照2天，即可得孢子，用孢子振篩機或孢子收集器收集孢子，備用；(5)將按配方秤取的純孢子、化學(xué)除草劑和輔助劑，混合成生物除草劑，分裝，密封，即成產(chǎn)品。
上述彎孢霉菌株Mds0404除草劑用于防除雜草的方法為
可用濃度為3-50g/L的彎孢霉菌株Mds0404的純分生孢子水懸浮液對雜草進行葉面噴施或種子處理；或?qū)⒃摼姆稚咦蛹右愿黝愝o助劑配成水懸浮液使用；或分生孢子與輔助劑的混合物與5-20％常規(guī)用量的化學(xué)除草劑混合水懸浮液使用；或者與其他雜草上分離得到的致病性菌株聯(lián)合使用，其配合使用方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的常規(guī)技術(shù)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果如下1、菌株Mds0404對小麥、大豆、棉花、豇豆、向日葵、玉米、花生、水稻等作物的小苗都安全，對狗尾草、稗草、牛筋草等雜草有部分感染，而對馬唐是是嚴重感染，一周后的控制效果在85％以上，該菌的寄主范圍相對專一，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是安全的(見表2)；故采用本發(fā)明馬唐彎孢霉菌劑不僅可用于防除大豆、棉花、花生等雙子葉作物田塊雜草，也可用于防除水稻、玉米和麥子等單子葉作物田塊雜草，這明顯優(yōu)于幾乎不能在單子葉作物與單子葉雜草間進行選擇的常規(guī)防除單子葉雜草的化學(xué)除草劑，因此，也就優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的美國專利。
2、與相關(guān)輔助劑配合使用，該菌劑對目標雜草馬唐的控制效果可以達到85％-100％，特別是3葉齡以下的植株。
3、本發(fā)明篩選獲得的菌株Mds0404，作為制備菌劑的生產(chǎn)用種，其對培養(yǎng)條件適應(yīng)性廣，在10-40℃，pH5-10均可生長，培養(yǎng)基原料易得，成本低廉，利用常用的農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)產(chǎn)品即可進行大批量生產(chǎn)，孢子產(chǎn)量高(2.0×107個孢子/克干重麥粒)；而作為防除雜草的感病菌劑，其在田間致病條件較寬，10-40℃孢子均可萌發(fā)，失活溫度為55℃，容易感染防除對象，研究顯示該菌有較大的潛力開發(fā)成商品化生物除草劑，可用于大多數(shù)作物田控制雜草馬唐。
4、本發(fā)明生物除草劑是利用活的生物本身，出自于所使用的環(huán)境，其降解產(chǎn)物均為可循環(huán)有機物，不會因使用導(dǎo)致污染，因此對環(huán)境安全，可用于生產(chǎn)綠色或有機農(nóng)產(chǎn)品。
因此，本發(fā)明利用彎孢霉菌株Mds0404發(fā)展生物除草劑控制馬唐，該菌株對主要農(nóng)作物安全性高，不感染禾本科作物和闊葉植物，應(yīng)用范圍廣，因而該生物除草劑具有極為顯著的經(jīng)濟和社會效益。
具體實施方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但這并不對本發(fā)明構(gòu)成任何意義上的限定。
實施例1(防除馬唐高效菌株Mds0404的篩選)從自然發(fā)生于浙江余姚地區(qū)的野外馬唐病害植株上，采集馬唐的病葉，用PDA培養(yǎng)基進行病原真菌的分離培養(yǎng)，從中分離出數(shù)種真菌菌株，并對它們的致病性進行了如下試驗；在顯微鏡下挑取各菌株的單孢子，分別接種在PDA培養(yǎng)基上，于黑暗、28℃下培養(yǎng)，觀察病原真菌純培養(yǎng)的菌落特征；另取直徑6mm的各菌落圓片接種在PDA平板中央，分別于7天后測量各菌落直徑；將各菌株配制成濃度為1×106個/ml的孢子懸浮液噴施2葉1心馬唐植株上，處理4天后，觀察各菌株的致病特性(見表1)，從中選擇出發(fā)病死亡率最強的彎孢霉屬菌株Mds0404，保存；馬唐罹病植株葉片病斑初為圓點狀，后擴大為大小不等的扁橢圓形或梭形病斑，病斑中央為褐色，周圍為紫色或紫紅色，外圍有黃色暈圈，兩端有壞死線，嚴重時多個病斑聯(lián)合，致使整個葉片呈焦枯狀皺縮卷曲；受該菌株侵染的馬唐病斑中央可見黑色子實體，做病葉鏡檢可見少量與培養(yǎng)條件相同的分生孢子。
表1馬唐病原真菌菌落特征及其對馬唐致病率的比較
實施例2(菌株Mds0404寄主范圍的測定)經(jīng)寄主范圍測定明確，菌株Mds0404對棉花、向日葵、大豆、豇豆、花生、玉米、小麥及水稻等作物安全；稗草、牛筋草及狗尾草有感染，而馬唐為嚴重感染(見表2)，一周后的控制效果在85％以上。
表2馬唐彎孢霉屬菌株Mds0404的寄主范圍測定
注NS表示沒反應(yīng)；LS表示有感染；HS表示嚴重感染實施例3(本發(fā)明一種生物除草劑及其制備方法1)按配方稱取菌株Mds0404純孢子83克、阿特拉津15克、吐溫2克，混合成生物除草劑100克。該劑的制備方法按以下步驟進行(1)培養(yǎng)基的準備菌株Mds0404可用以下任一種培養(yǎng)基活化并誘導(dǎo)分生孢子的產(chǎn)生
PDA培養(yǎng)基馬鈴薯150g，葡萄糖10g，瓊脂18g，水1L；PSA培養(yǎng)基馬鈴薯150g，蔗糖10g，瓊脂18g，水1L；麩皮培養(yǎng)基麩皮50g，瓊脂18g，水1L；玉米粉培養(yǎng)基玉米粉50g，瓊脂18g，水1L；淀粉酵母培養(yǎng)基淀粉10g，酵母粉2g，瓊脂18g，水1L；Czapek培養(yǎng)基KNO32g；K2HPO41g；KCl 0.5g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO40.01g；蔗糖30g；瓊脂18g；水1L。
(2)菌株Mds0404的活化培養(yǎng)挑取少許保存的該菌菌絲塊至步驟(1)PDA平皿培養(yǎng)基中，28℃恒溫暗培養(yǎng)，活化菌株；(3)菌株種子液的培養(yǎng)挑取少許步驟(2)培養(yǎng)的菌塊，接入盛有步驟(1)PD培養(yǎng)液(PDA培養(yǎng)基不加瓊脂即成)的三角瓶中，28℃，150rpm，振蕩培養(yǎng)3-5天至菌液產(chǎn)生豐富菌絲球，待用；(4)菌種孢子的生產(chǎn)培養(yǎng)與收集可以采用固體或液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)的方法；在無菌條件下，將Mds0404菌絲塊或液體培養(yǎng)的菌絲球接種于裝有半熟麥粒的茄子瓶中，置于25-28℃黑暗培養(yǎng)6-8天，待菌絲長滿固體培養(yǎng)基后，將麥粒搗散，平鋪于平板上，控制至40％-65％的濕度，12小時間隔黑光燈(20W，垂直光照距離為25cm)光照2天，即可得孢子，干燥后用孢子振篩機或孢子收集器收集孢子，備用；(5)將按配方稱取的純孢子、阿特拉津、吐溫，混合成生物除草劑，分裝，密封，即成產(chǎn)品。
實施例4(本發(fā)明生物除草劑及其制備方法2)按配方稱取菌株Mds0404純孢子95克、植物油5克，混合成生物除草劑100克；該劑的制備方法同于實施例3。
實施例5(本發(fā)明生物除草劑及其制備方法3)按配方稱取菌株Mds0404純孢子90克、甲草胺7克、聚醚硅油3克，混合成生物除草劑100克；該劑的制備方法同于實施例3。
實施例6(純孢子防除馬唐草效果試驗)將菌株Mds0404在PDA培養(yǎng)基，28℃，黑暗培養(yǎng)8天后，刷除表面菌絲，用黑光燈12小時間隔照射1天后，用無菌水沖洗通過紗布過濾，收集濾液并鏡檢孢子濃度(1×106個/ml)，用手持噴霧器噴施濾液，接種到1葉1心至3葉1心期的馬唐上，保濕12小時，處理5天后，對該草的控制效果達到90％以上。這種孢子接種在馬唐上的致病癥狀為葉片最初出現(xiàn)紫紅色病斑，圓點狀，隨后擴大為近圓形或梭形褐色病斑，數(shù)量多時連接成片，最后葉大片或整片干枯。幼小植株葉片上為透明的圓斑，嚴重時整個植株很快死亡。病葉上可見黑色子實體。經(jīng)觀察，病葉表面的孢子與所噴施的彎孢霉屬Mds0404孢子一樣。以上實驗條件下的發(fā)病癥狀與自然病癥相似。
實施例7(孢子+輔助劑除馬唐草效果試驗)按實施例4方法，先配制出孢子懸浮液后，再添加輔助劑吐溫、植物油、纖維素、淀粉或聚醚硅油，處理馬唐，結(jié)果明顯提高殺草速度和效率。(見表3)。
表3輔助劑對Mds0404接種效果的影響
每列中數(shù)據(jù)跟不同小寫字母表示有顯著差異(P≤0.05)。
實施例8(孢子+輔助劑+5-20％常規(guī)用量的化學(xué)除草劑除馬唐草效果試驗)按實施例3或5方法，先配制出添加有輔助劑的孢子懸浮液，再添加常規(guī)用量5-20％的阿特拉津、甲草胺、乙草胺、異丙甲草胺、丙草胺、異丙隆、綠麥隆、惡草靈、敵草隆、果爾或玉農(nóng)樂，均勻噴施在2.5-3.5葉齡期的馬唐上，分別保濕12小時和不保濕兩組處理；處理后4天，保濕一組的馬唐被控制100％，未保濕一組的馬唐被控制70-90％(見表4)。
表4阿特拉津與Mds0404混配接種效果
實施例9(純孢子防除馬唐草種子效果試驗)設(shè)置鋪有濾紙的培養(yǎng)皿高壓滅菌后，每皿中放50粒馬唐種子，將按實施例6方法生產(chǎn)出的孢子濃度達(1×106個/ml)的孢子懸浮液施于培養(yǎng)皿中，每皿2毫升，重復(fù)5次；另設(shè)無菌水處理皿中馬唐種子作為對照；4天后，對照馬唐萌發(fā)及長勢均正常，而菌液處理的馬唐種子剛萌發(fā)即被侵染全部死亡。
權(quán)利要求
1.彎孢霉(Curvularia Boedijn)Mds0404菌株，其菌株保藏號為CGMCCNO.1827。
2.一種生物除草劑，其特征在于該除草劑以彎孢霉(Curvularia Boedijn)Mds0404菌株CGMCC NO.1827為菌種，其組分與各組分的重量百分比含量為純孢子 80-95％化學(xué)除草劑 0-18％輔助劑 2-5％。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的生物除草劑，其特征在于所述的化學(xué)除草劑為阿特拉津、甲草胺、乙草胺、異丙甲草胺、丙草胺、異丙隆、綠麥隆、惡草靈、敵草隆、果爾或玉農(nóng)樂。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的生物除草劑，其特征在于所述的輔助劑為吐溫20、吐溫80、葡聚糖、植物油、纖維素或聚醚硅油。
5.一種制備權(quán)利要求
2所述生物除草劑的方法，其特征在于該方法按以下步驟進行(1)培養(yǎng)基的準備菌株Mds0404可用PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、麩皮培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、淀粉酵母培養(yǎng)基或Czapek培養(yǎng)基活化并誘導(dǎo)分生孢子的產(chǎn)生；(2)菌株Mds0404的活化培養(yǎng)挑取少許保存的該菌菌絲塊至步驟(1)任一平皿培養(yǎng)基中，28℃恒溫暗培養(yǎng)，活化菌株；(3)菌株種子液的培養(yǎng)挑取少許步驟(2)培養(yǎng)的菌塊，接入盛有步驟(1)任一不含瓊脂培養(yǎng)液的三角瓶中，28℃，150rpm，振蕩培養(yǎng)3-5天至產(chǎn)生豐富菌絲球，待用；(4)菌種孢子的生產(chǎn)培養(yǎng)與收集采用固體或液體—固體聯(lián)合培養(yǎng)的方法，在無菌條件下，將Mds0404菌絲塊或液體培養(yǎng)的菌絲球接種于裝有半熟麥粒的茄子瓶中，置于25-28℃黑暗培養(yǎng)6-8天，待菌絲長滿固體培養(yǎng)基后，將麥粒搗散，平鋪于平板上，控制至40-65％的濕度，12小時間隔黑光燈光照2天，即可得孢子，用孢子振篩機或孢子收集器收集孢子，備用；(5)將按配方秤取的純孢子、化學(xué)除草劑和輔助劑，混合成生物除草劑，分裝，密封，即成產(chǎn)品。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種生物除草劑及其制備方法，屬于利用微生物防除農(nóng)田雜草的技術(shù)領(lǐng)域：
。該除草劑以彎孢霉(Curvularia Boedijn)Mds0404菌株CGMCCNO.1827為菌種，其組分與各組分的重量百分比含量為純孢子80－95％，化學(xué)除草劑0－18％，輔助劑2－5％；經(jīng)培養(yǎng)基的準備，菌株Mds0404的活化與種子液的培養(yǎng)，菌種孢子的生產(chǎn)培養(yǎng)與收集及各組分的混合等步驟制備而成。該劑以防除馬唐為主，兼除狗尾草、稗草、牛筋草等雜草，具有對農(nóng)作物安全，尤其是對單子葉作物安全，應(yīng)用適應(yīng)性廣，成本低廉，無污染等特點?？稍隈R唐等雜草危害地區(qū)推廣應(yīng)用。
文檔編號A01P13/00GK1994092SQ200610155473
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月26日
發(fā)明者杜新法, 邱海萍, 柴榮耀, 毛雪琴, 張震, 王艷麗, 王教瑜, 孫國昌 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan