專(zhuān)利名稱(chēng):擴(kuò)繁植物雄性不育系的高效種子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種擴(kuò)繁植物雄性不育系的新方法，該方法利用細(xì)胞核雄性不育基因、控制籽粒特殊形狀(如大小、長(zhǎng)短、寬窄、薄厚等)基因及轉(zhuǎn)基因技術(shù)擴(kuò)繁植物雄性不育系，屬于植物遺傳育種及種子生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于雜種優(yōu)勢(shì)的存在，使得雜交種的生物量、抗病蟲(chóng)能力、耐脅迫(干旱、高溫、低溫、鹽堿等)能力較其雙親有相當(dāng)?shù)奶嵘?，如雜交玉米、雜交水稻的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純合的雙 親。生產(chǎn)雜交種通常采用的方法為將雌性親本和雄性親本種在一起，將雌性親本的雄穗去除，而保留雄性親本的雄穗，雌性親本收獲的種子即為雜交種。
自然界中的植物存在自花授粉、異花授粉及常異花授粉三種類(lèi)型，自花授粉指一株植物的花粉，對(duì)同一個(gè)體的雌蕊進(jìn)行授粉的現(xiàn)象。在兩性花的植物中，又可分為同一花的雄蕊與雌蕊間進(jìn)行授粉的同花授粉(菜豆屬)和在一個(gè)花序(個(gè)體)中不同花間進(jìn)行授粉的鄰花授粉，以及同株不同花間進(jìn)行授粉的同株異花授粉。有的植物雄蕊和雌蕊不長(zhǎng)在同一朵花里，甚至不長(zhǎng)在同一棵植株上，無(wú)法自花授粉，它們的雌蕊只能得到其他花的花粉，這叫做異花授粉。將天然雜交率高于50%且自交衰退的一類(lèi)作物歸為常異花授粉作物，如玉米。
玉米為雌雄同株，并且雌雄花位于植株的不同部位，玉米既可通過(guò)自花授粉也可通過(guò)異花授粉繁衍后代，自然條件下，當(dāng)風(fēng)將花粉從雄穗吹到雌穗的花絲上時(shí)即完成了天然授粉。
在玉米育種中首先應(yīng)開(kāi)發(fā)出純合的玉米自交系，然后將兩個(gè)自交系進(jìn)行雜交，對(duì)雜交的后代進(jìn)行產(chǎn)量、抗逆性等進(jìn)行評(píng)估，以確定其是否具有商業(yè)化潛力。其中每個(gè)自交系都可能具有另一個(gè)自交系所缺乏的一種或多種優(yōu)良性狀，或補(bǔ)充另一個(gè)自交系的一種或多種不良性狀。兩個(gè)自交系雜交的第一代種子為Fl代種子，F(xiàn)l代的種子發(fā)芽后獲得Fl代植株，F(xiàn)l代植株較兩個(gè)自交系親本(父母本)更健壯，同時(shí)擁有更多的生物量。
可以通過(guò)對(duì)母本人工去雄來(lái)生產(chǎn)雜交種，即將未散粉的母本(其可與父本在田間間隔播種，如播種5行母本，一行父本)雄穗去除，保留父本雄穗。隨后，只要對(duì)外來(lái)玉米花粉進(jìn)行隔離，母本雌穗只能接受父本的花粉，得到的種子即為雜交種(Fl)，該雜交種即可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
在生產(chǎn)雜交種的過(guò)程中由于環(huán)境的變化可能導(dǎo)致去雄完成后植株又雄穗化，或去雄不完全，以上兩種情況均能導(dǎo)致母本自交授粉，致使生產(chǎn)的雜交種中混雜了母本自交系的種子，母本自交系的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于雜交種的產(chǎn)量，這樣的種子為不合格產(chǎn)品，即會(huì)影響農(nóng)民收入又會(huì)影響制種公司信譽(yù)，嚴(yán)重的將導(dǎo)致制種公司承擔(dān)相應(yīng)的賠償責(zé)任。
也可采用機(jī)器對(duì)母本進(jìn)行去雄，機(jī)器去雄和手工去雄的可靠性基本相同，但更快并且成本更低。然而，較之手工去雄，大多數(shù)去雄機(jī)器會(huì)對(duì)植株造成更大的破壞，因此，目前沒(méi)有令人完全滿(mǎn)意的去雄手段，人們?nèi)栽趯ふ页杀靖?，去雄更徹底的替換方法。[0009]穩(wěn)定的雄性不育系統(tǒng)提供了簡(jiǎn)單高效的手段，通過(guò)使用核-質(zhì)互作雄性不育(CMS)自交系，可以在一些基因型中得以避免繁重的去雄工作。該手段包括三個(gè)主要材料，即不育系雄性不育材料，保持系可以為不育系提供花粉，使不育系的后代仍為不育系，恢復(fù)系可以恢復(fù)不育系的育性。不育系與恢復(fù)系雜交產(chǎn)生F1，即用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的雜交種。更具體的說(shuō)，核-質(zhì)互作不育型，表現(xiàn)為核-質(zhì)互作遺傳。不但需要細(xì)胞質(zhì)有不育基因S，而且需要細(xì)胞核里有純合的不育基因(rfrf)，二者同時(shí)存在，方能使植株表現(xiàn)為雄性不育。如胞質(zhì)基因?yàn)榭捎齆，則不論核基因是可育(RfRf)還是不育(rfrf)，都表現(xiàn)為雄性可育。同樣，如核里具有可育基因(RfRf)或(Rfrf)，則不論胞質(zhì)基因是可育N還是不育S，也都表現(xiàn)為雄性可育。這種由核-質(zhì)互作形成的雄性不育系，其遺傳組成為S(rfrf)，不能產(chǎn)生正常的花粉，但可作為雜交母本。由于能找到保持系N(rfrf)[用它與不育系雜交，所產(chǎn)生的Fl仍能保持雄性不育，即S(rfrf)(早)XN(rfrf) — S (rfrf)(不育)]并能接受恢復(fù)系S(RfRf)或N(RfRf)[用它們與不育系雜交，所產(chǎn)生的Fl都是可育的，S卩S(rfrf)(早)X S (RfRf) — S (Rfrf) (Fl)(可育)，或 S (rfrf)(早)XN(RfRf) — S (Rfrf) (Fl)(可 育)]的花粉，使Fl恢復(fù)為雄性可育，F(xiàn)l植株自交產(chǎn)生F2，所以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可以廣泛應(yīng)用。雄性不育系可以免除人工去雄，節(jié)約人力，降低種子成本，還可保證種子的純度。目前水稻、玉米、高粱、洋蔥、蓖麻、甜菜和油菜等作物已經(jīng)利用核質(zhì)互作雄性不育進(jìn)行雜交種子的生產(chǎn)；對(duì)其他作物的核_質(zhì)互作雄性不育系，也正在進(jìn)行廣泛的研究。
CMS也有它的缺陷，一是觀察到個(gè)別CMS材料容易感病，二是恢復(fù)系比較難尋找，這些問(wèn)題阻礙了 CMS系統(tǒng)在制種中的廣泛應(yīng)用。
Brar et al的美國(guó)專(zhuān)利4654465和4727219中公開(kāi)了一種類(lèi)型的遺傳不育性。但是，這種類(lèi)型的遺傳不育需要在基因組內(nèi)的多個(gè)不同位點(diǎn)保持相應(yīng)的基因型，需要每代對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行分子標(biāo)記跟蹤檢測(cè)。Patterson還描述了一種可能有用的染色體易位基因系統(tǒng)，但該系統(tǒng)更為復(fù)雜(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 3861709和3710511)。
人們一直在嘗試對(duì)雄性不育系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化,例如,Fabijanski,et al.開(kāi)發(fā)了使植物雄性不育的方法(EP0 89/3010153. 8公開(kāi)號(hào)329308和作為WO 90/08828公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/CA90/00037)。主要是通過(guò)以下兩種途徑抑制植株的雄花育性，一種方法是將雄性組織特意表達(dá)的啟動(dòng)子與細(xì)胞毒素基因相連轉(zhuǎn)入植株中，使雄花不能正常散粉同時(shí)不影響其他性狀；另一種是通過(guò)基因干擾手段，將已經(jīng)克隆的控制植株雄花育性的基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因的手段將其干擾，從而使其不能正常行使功能。還有通過(guò)一些基因調(diào)控元件來(lái)抑制基因表達(dá)，從而影響植株育性的手段(W090/08829)。
在多數(shù)情況下，只有控制雄性不育的核基因隱性純合(msms)植株才會(huì)表現(xiàn)為雄性不育，由于雄性不育植株無(wú)法自交，因此只能通過(guò)雜合植株(Msms)與其雜交，才會(huì)得到雄性不育植株(msms)。并且在同一果穗上雄性不育籽粒(msms)與可育的雜合籽粒(Msms)同時(shí)存在，通過(guò)籽粒無(wú)法分辨哪些是不育籽粒，哪些是可育籽粒，只能通過(guò)播種后，植株散粉時(shí)才可分辨。
近年來(lái)，也有利用轉(zhuǎn)基因的手段來(lái)保持雄性不育植株的不育性(US6743968)。該方法將花粉致死基因與雄性生育能力恢復(fù)基因構(gòu)建在一個(gè)載體中，導(dǎo)入雄性不育植株中，轉(zhuǎn)基因后代表現(xiàn)為可育，但只能產(chǎn)生不含恢復(fù)基因的花粉。當(dāng)這樣的植株與雄性不育植株雜交，便保持了隱性不育植株的純合隱性狀態(tài)。其首先構(gòu)建一個(gè)轉(zhuǎn)基因載體，該載體含有一個(gè)花粉細(xì)胞致死基因，同時(shí)該載體還含有一個(gè)恢復(fù)植株育性的顯性基因。將該載體轉(zhuǎn)入雄性不育植株，并且該載體在轉(zhuǎn)基因植株中以雜合狀態(tài)存在，由于恢復(fù)育性基因的存在使得植株可育，當(dāng)其與雄性不育植株雜交，由于含有恢復(fù)基因的花粉(Msms)同時(shí)含有致死基因，使得花粉敗育，因此只有不含恢復(fù)基因的花粉(ms)才能與雄性不育植株雌配子(ms)進(jìn)行雜交，后代均為隱性純合個(gè)體(msms)。
如前文所述，采用雄性不育系統(tǒng)制種的很多工作的一個(gè)重要問(wèn)題在于如何利用雄性不育基因及如何分辨雄性不育種子及可育種子，同時(shí)還需要考慮如何將不育個(gè)體的不育性保持下來(lái)。
在玉米中已經(jīng)鑒定了多種雄性不育突變體(Skibbe et al. 2005)，具體見(jiàn)下表
表一由核基因引起的雄性不育突變體
權(quán)利要求
1. 一種方法，用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)，所述方法包括 (a)提供第一植株，其包含使植物雄性不育的純合隱性等位基因； (b)提供第二植株，該植株包含同第一植株相同使植物雄性不育的純合隱性等位基因，并且含有下述構(gòu)建體，所述構(gòu)建體在植株中以雜合狀態(tài)存在，所述構(gòu)建體包含 ·1.第一核苷酸序列，當(dāng)在第一植株中表達(dá)時(shí)將恢復(fù)其雄性生育力； ii.第二核苷酸序列，當(dāng)其以雜合狀態(tài)存在時(shí)即可影響籽粒特殊形狀(如大小、長(zhǎng)短、寬窄、薄厚等)，通過(guò)肉眼或儀器可以分辨含有該構(gòu)建體的籽粒和不含有該構(gòu)建體的籽粒； iii.第一核苷酸序列與第二核苷酸序列緊密相連，這兩個(gè)核苷酸序列在植株中同時(shí)存在。
(c)用所述第二植株的雄性配子與第一植株的雌性配子受精，以產(chǎn)生保持了所述第一植株純合隱性狀態(tài)的后代。
2.—種DNA構(gòu)建物，該構(gòu)建物如權(quán)利要求
I所述的構(gòu)建物。
3.—種植物,該植物如權(quán)利要求
I所述的第二植株。
4.一種植物，利用權(quán)利要求
I所述方法產(chǎn)生的純合隱性的雄性不育植株。
5.利用權(quán)利要求
I所述方法產(chǎn)生的純合隱性雄性不育植株在生產(chǎn)雜交種中的用途。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效的種子標(biāo)記方法，利用該方法可以擴(kuò)繁植物雄性不育種子，為雜交制種帶來(lái)便利。進(jìn)一步，本發(fā)明利用控制植物雄性生育能力、籽粒特殊形狀(如大小、長(zhǎng)短、寬窄、薄厚等)的核苷酸序列及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，發(fā)明了一種高效擴(kuò)繁植物雄性不育系的新方法。本發(fā)明將控制雄性生育能力的野生型核苷酸序列和籽粒形狀的核苷酸序列連在一起轉(zhuǎn)入常規(guī)玉米，然后回交到純合隱性雄性不育系植株，利用獲得的轉(zhuǎn)基因植株與純合隱性不育系雜交后，可以同時(shí)得到大量的不育系和保持系種子。由于控制籽粒形狀核苷酸序列的作用，可以通過(guò)籽粒形狀區(qū)分不育系和保持系。其中形狀正常的種子為不育系(不含轉(zhuǎn)基因序列)，形狀異常(如籽粒變小)的種子為保持系。
文檔編號(hào)C12N15/63GKCN102960234SQ201210406155
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年10月23日
發(fā)明者賴(lài)錦盛, 趙海銘, 宋偉彬, 崔陽(yáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan