技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及絨山羊繁殖
技術(shù)領域：
，特別涉及一種絨山羊冷凍精液稀釋液配方。
背景技術(shù)：
：：近年來，山羊人工授精在家畜養(yǎng)殖上得到愈來愈普遍的應用，尤其是對于規(guī)模化、集約化、專業(yè)化養(yǎng)殖，人工授精技術(shù)發(fā)揮了重要作用。精液冷凍保存技術(shù)保證了人工授精對精液的需求不受時間和地域的限制。冷凍保存技術(shù)使得采精和受精在時間和空間上產(chǎn)生了分離，延長了精子的體外儲存時間，便于長途運輸，促進了遺傳資源跨地區(qū)、跨國界的交流和共享，加快了畜群品種改良步伐，使得優(yōu)秀畜種得到大范圍的推廣。精子的冷凍保存是一個復雜的過程，為了獲得令人滿意的凍存結(jié)果，在冷凍過程中需要平衡多種因素。需要適宜的稀釋劑、抗凍劑及其他添加劑，平衡溫度和平衡時間、降溫速率及解凍速率都是至關(guān)重要的，其每一項都有可能影響精液質(zhì)量。在精液冷凍保存中，冷凍保護劑是精子超低溫凍貯成功與否的關(guān)鍵。它主要作用是減少冷凍和解凍過程中細胞滲透性損傷和減少冰晶形成，細胞得以在超低溫條件下保存。目前，冷凍保護劑主要分為滲透性冷凍保護劑(如甘油、乙二醇等)和非滲透性冷凍保護劑(如單糖、卵黃、白蛋白等)。一般認為卵黃由于富含卵磷脂，能提高細胞外滲透壓，穩(wěn)定精子細胞膜，防止頂體外膜破裂作用，近期研究還證實，在非冷凍條件下，卵黃能促進精子與卵透明帶結(jié)合，從而提高頂體反應率。然而由于卵黃和尿道球腺分泌物之間存在著有害的相互作用，會使復溫后精子存活率下降。我國對山羊精液冷凍保存技術(shù)的研究始于20世紀80年代，起步晚。到20世紀80年代中后期，開始嘗試應用于生產(chǎn)實踐。凍融后的山羊精子受胎率較低，一般不超過50％，實際生產(chǎn)價值較低，成為制約山羊精液冷凍的瓶頸。因此，我們有必要對冷凍精液的稀釋液配方進行研究和改進。技術(shù)實現(xiàn)要素：：鑒于此，有必要設計一種絨山羊冷凍精液稀釋液配方以提高山羊凍精的受胎率；同時，還要給出一種絨山羊冷凍精液稀釋液配制方法。一種絨山羊冷凍精液稀釋液配方，所述配方由葡萄糖2.7～3.3g、乳糖5.1～5.7g、檸檬酸鈉1.1～1.4g、卵黃7～12％、發(fā)情山羊血清17～23％、乙二醇4～6％、及將上述物質(zhì)定溶至100ml的純水組成，上述百分比均為體積百分比。優(yōu)選的，葡萄糖3g、乳糖5.5g、檸檬酸鈉1.3g、卵黃10％、發(fā)情山羊血清20％、乙二醇5％。一種絨山羊冷凍精液稀釋液配制方法，包括以下步驟：步驟一、稱量葡萄糖2.7～3.3g、乳糖5.1～5.7g、檸檬酸鈉1.1～1.4g，充分溶解到50ml純水中，此液為溶液i；步驟二、取新鮮雞蛋一枚，用注射器吸出卵黃，并用45微米無菌濾器過濾，取7～12ml加入溶液i；步驟三、絨山羊集中發(fā)情期間，離心法制備發(fā)情山羊血清，取17～23ml加入溶液i；步驟四、取乙二醇4～6ml加入溶液i，并用純水將上述物質(zhì)定溶至100ml；步驟五、用22微米無菌濾器過濾除菌，并4℃保存待用，現(xiàn)配現(xiàn)用，保存期不超過7天。優(yōu)選的，葡萄糖3g、乳糖5.5g、檸檬酸鈉1.3g、卵黃10％、發(fā)情山羊血清20％、乙二醇5％。發(fā)情山羊血清在細胞培養(yǎng)過程中為細胞提供營養(yǎng)與生長因子，對維持細胞活性有重要作用。本發(fā)明通過在絨山羊卵母細胞體外受精培養(yǎng)液中要添加一定量的發(fā)情山羊血清并適當降低卵黃含量，促進精卵結(jié)合，從而提高受胎率。具體實施方式：一、絨山羊冷凍精液稀釋液的配制：1、稱量葡萄糖3g、乳糖5.5g、檸檬酸鈉1.3g、充分溶解到50ml純水中，此液為溶液i；2、取新鮮雞蛋一枚，用注射器吸出卵黃，并用45微米無菌濾器過濾，取10ml加入溶液i；3、絨山羊集中發(fā)情期間，離心法制備發(fā)情山羊血清，取20ml加入溶液i；4、取乙二醇5ml加入溶液i，并用純水將上述物質(zhì)定溶至100ml；5、用22微米無菌濾器過濾除菌，并4℃保存待用，現(xiàn)配現(xiàn)用，保存期不超過7天。二、精液準備：1、取絨山羊種公羊精液1ml加入9ml前述配制的絨山羊冷凍精液稀釋液，混勻，800g離心5分鐘，去上清；2、精子沉淀中加入1ml前述配制的絨山羊冷凍精液稀釋液，靜置10分鐘，待精子上浮后，取上清液(含活精子)裝管或滴板，保證每管或每滴含有1×107個以上的精子。三、顆粒凍精制備：本實施方案使用顆粒凍精法冷凍精子。將上一步準備好的精液4℃平衡3小時，在液氮表面1.5厘米處隔空滴板，5分鐘后投入液氮。四、凍精顆粒解凍：從液氮中取出凍精顆粒后，放入40℃預熱的無菌管中解凍1分鐘。五、解凍精液品質(zhì)檢測：1、精子活率測定：用精子活力檢測試劑盒測定精子活率。2、精子生存指數(shù)的檢測：在37℃水浴中保存解凍的精液，每隔1小時進行1次活力檢測，直至4小時。精子生存指數(shù)為2次檢查精子活力的平均數(shù)與間隔(小時)時間的乘積之和。3、精子頂體完整率的檢測：凍精顆粒解凍后制作抹片，經(jīng)福爾馬林磷酸鹽液固定、姬姆薩染液染色后，在1000倍油鏡下觀察精子頂體的完整和受損情況，統(tǒng)計頂體完整型精子率。六、本實施例的結(jié)果：用本實施例的稀釋液配方制作的山羊顆粒凍精的品質(zhì)檢測結(jié)果見下表。精子活率(％)生存指數(shù)頂體完整率(％)64.12±0.576.6753.24±0.46七、冷凍精液人工授精試驗：用本發(fā)明配方制作的凍精對100只發(fā)情正常的阿爾巴斯絨山羊進行人工授精實驗，經(jīng)統(tǒng)計人工授精受胎率為79％。由此可見，該配方制作的冷凍精液具有較好的實際應用效果。技術(shù)特征：技術(shù)總結(jié)一種絨山羊冷凍精液稀釋液配方，所述配方由葡萄糖2.7～3.3g、乳糖5.1～5.7g、檸檬酸鈉1.1～1.4g、卵黃7～12％、發(fā)情山羊血清17～23％、乙二醇4～6％、及將上述物質(zhì)定溶至100ml的純水組成，上述百分比均為體積百分比；本發(fā)明還提供一種絨山羊冷凍精液稀釋液配制方法。本發(fā)明通過在絨山羊卵母細胞體外受精培養(yǎng)液中要添加一定量的發(fā)情山羊血清并適當降低卵黃含量，促進精卵結(jié)合，從而提高受胎率。技術(shù)研發(fā)人員：吳海青;郭俊;勿都巴拉;李玉榮;趙存發(fā);馬躍軍;劉斌;高娃受保護的技術(shù)使用者：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院技術(shù)研發(fā)日：2017.03.17技術(shù)公布日：2017.08.01