本發(fā)明公開了一種抑制蚜蟲共生菌的新方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明涉及共生菌防治在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：動物體內(nèi)存在多種微生物，這些微生物長期與動物共生，參與了宿主的多種生理生化反應(yīng)。例如昆蟲體內(nèi)的共生菌具有協(xié)助宿主營養(yǎng)代謝、逃避天敵攻擊和增強(qiáng)抗藥性等功能。研究發(fā)現(xiàn)這些共生菌可以協(xié)助宿主營養(yǎng)代謝，能夠合成宿主食物中缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)，如多種必需氨基酸；可以分泌抗菌肽、毒素等物質(zhì)增強(qiáng)昆蟲對外源寄生物的防御能力；共生菌也可以增強(qiáng)宿主抗逆性，調(diào)控植物生理反應(yīng)，抑制植物對宿主的不利影響；另外有些微生物參與了昆蟲與天敵的相互作用。。目前，國內(nèi)外對微生物與害蟲方面的研究主要集中在病原微生物對昆蟲的毒殺作用，而對害蟲有益共生菌進(jìn)行生物防治的研究還很少，到目前為止未見相關(guān)報道。蚜蟲是一種重要的極具破壞性的農(nóng)業(yè)害蟲之一。它們通過針狀刺吸口器吸食植株的汁液，抑制植株正常生長，嚴(yán)重時導(dǎo)致植株萎蔫枯死。另外，蚜蟲可以傳播多種植物病毒病，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大損失。蚜蟲體內(nèi)含有多種共生菌，除了主要共生菌Bunchnera外，還有多種兼性寄生菌，這些共生菌有的可以為其提供營養(yǎng)物質(zhì)，有些則在蚜蟲的生理生態(tài)方面發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，蚜蟲的主要共生菌Bunchnera缺失會導(dǎo)致蚜蟲生長受抑制，對熱敏感，繁殖力大大降低。因此蚜蟲共生菌對蚜蟲防治具有重要意義。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種抑制蚜蟲共生菌生長的新方法，為蚜蟲防治提供了新思路。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明包括以下內(nèi)容：本發(fā)明研究了蚜蟲體內(nèi)可以在體外培養(yǎng)的微生物類型；并提供了一種利用蛋白酶抑制劑控制蚜蟲共生菌的新方法。有益效果本發(fā)明公開了一種抑制蚜蟲共生菌生長的新方法。該方法為蚜蟲防治提供了一種新思路，也為昆蟲中的首次報道。該方法也可應(yīng)用于其他具有共生菌的害蟲防治技術(shù)中。下面將引用非限定性實例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。具體實施方式實例1蚜蟲體內(nèi)可以培養(yǎng)的微生物鑒定及蛋白酶抑制劑的抑制效果：將成熟蚜蟲使用次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒。消毒10分鐘后，用清水洗滌三次。加入適量PBS進(jìn)行研磨，勻漿液涂布在不含任何抗生素的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。實驗組LB培養(yǎng)基上先涂布100ug/ml的一種來自線蟲共生菌的蛋白酶抑制劑PI，對照組涂布PBS溶液。實驗設(shè)置三個對照。設(shè)置多個實驗梯度。觀察實驗組和對照組培養(yǎng)基上細(xì)菌的形態(tài)，并挑取單克隆進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)過夜后，分別提取細(xì)菌的基因組DNA。以細(xì)菌通用的16SRNA為引物，以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。純化以上步驟所得PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產(chǎn)物連接到pESTY-T1載體上，后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，37℃平板培養(yǎng)，挑取陽性菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)液中，200rpm/min培養(yǎng)9小時，以M13通用引物對陽性克隆子進(jìn)行PCR檢測鑒定，并送去測序。測序結(jié)果通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，對菌株進(jìn)行鑒定。經(jīng)過鑒定結(jié)果如表1。表1.蚜蟲體內(nèi)可以培養(yǎng)的共生菌鑒定結(jié)果表明，本實驗蚜蟲體內(nèi)可以培養(yǎng)的共生菌主要有兩類，Staphylococcussciuri和Staphylococcusepidermidis。這兩種菌株在經(jīng)過蛋白酶抑制劑處理后，含量降低，在LB培養(yǎng)基上未見菌斑。說明該蛋白酶抑制劑對蚜蟲體內(nèi)可以培養(yǎng)的共生菌有抑制作用。實例2蛋白酶抑制劑對蚜蟲體內(nèi)不可培養(yǎng)的主要共生菌的抑制作用：隨機(jī)挑選4齡蚜蟲180頭于人工飼料上進(jìn)行培養(yǎng)。實驗設(shè)置對照組和2個處理組。實驗設(shè)置3個重復(fù)。其中處理組人工飼料中分別添加100ug/ml和500ug/ml的蛋白酶抑制劑，培養(yǎng)四天后，計算蚜蟲死亡率。提取蚜蟲DNA。以蚜蟲EF1α基因作為內(nèi)參，蚜蟲體內(nèi)主要共生菌Bunchnera的含量使用16sRNA基因表達(dá)量代替。利用熒光定量PCR絕對定量的方法，檢測蚜蟲體內(nèi)主要共生菌Bunchnera16sRNA的表達(dá)量。用蚜蟲EF1α基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并將處理組與對照組進(jìn)行比對。實驗結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。試驗結(jié)果見表2。將蚜蟲死亡率與蚜蟲主要共生菌含量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)R為0.8714，相關(guān)性高，說明蚜蟲主要共生菌與蚜蟲死亡率具有相關(guān)性。表2.蛋白酶抑制劑對蚜蟲主要共生菌的抑制作用蛋白酶抑制劑濃度(ug/ml)共生菌Bunchnera16sRNA含量(相對對照)01.1135895±0.1042881a1000.7261588±0.1103905a5000.5395272±040.12828b結(jié)果表明：500ug/ml的蛋白酶抑制劑處理的蚜蟲相比對照共生菌含量顯著減少。該研究結(jié)果顯示蛋白酶抑制劑可以顯著降低蚜蟲主要共生菌Bunchnera含量。綜上所述，本發(fā)明公開了一種抑制蚜蟲共生菌的新方法。該方法為蛋白酶抑制劑抑制蚜蟲共生菌的首次報道，在害蟲生物防治領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。當(dāng)前第1頁1 2 3