一個(gè)水稻抗旱相關(guān)基因OsDT11及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種能夠提高水稻對(duì)抗干旱能力的OsDT11基因以及該基因在水稻抗旱遺傳改良中的應(yīng)用，所述的OsDT11基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明通過(guò)在水稻中超量表達(dá)OsDT11基因，可以提高轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)抗干旱性狀的能力，本發(fā)明證實(shí)了該基因的功能及應(yīng)用途徑。為植物抗旱研究及干旱育種提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)基因，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說(shuō)明】-個(gè)水稻抗旱相關(guān)基因OsDT11及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水稻基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種能夠提高水稻對(duì)抗干旱能力的 OsDTll基因以及該基因在水稻抗旱遺傳改良中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是最主要的三大糧食作物之一，其播種面積占糧食播種面積的1/5,全世界二 分之一以上的人口以水稻為主食，同時(shí)也是我國(guó)最主要的栽培作物之一。
[0003] 各種生物和非生物脅迫是影響水稻生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要因素，發(fā)覺(jué)能夠改善水稻抵 抗逆境脅迫能力的基因?qū)榛蚬こ谈牧妓拘缕贩N打下基礎(chǔ)。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物 在分子、細(xì)胞、生理和生物化學(xué)水平上發(fā)展出多種機(jī)制應(yīng)對(duì)逆境脅迫。基因工程技術(shù)通過(guò)改 變一個(gè)或幾個(gè)基因的活性來(lái)體高植物的抗逆性，它是在基因水平上進(jìn)行的，具有精確性和 穩(wěn)定性，提高了育種的高效性，極大地加快了育種速度，對(duì)于我們了解抗逆植物復(fù)雜的性狀 以及相關(guān)機(jī)制也是非常必要的。隨著分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的日趨成熟和迅猛發(fā)展， 通過(guò)基因工程手段改良作物的抗性已經(jīng)收到越來(lái)越廣泛的關(guān)注和重視。
[0004] 干旱一直是限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要因素，并隨著全球環(huán)境惡化、氣候異常等 變化將日益危害著我國(guó)的糧食生產(chǎn)安全。通過(guò)超量表達(dá)逆境應(yīng)答過(guò)程中的重要基因可以顯 著提高作物的抗逆性。
[0005] 植物抗旱性屬多基因控制的數(shù)量性狀，通過(guò)常規(guī)育種方法改良作物抗旱性的效 果往往不理想。借助基因工程手段改良作物，利用植物抗旱相關(guān)基因是提高植物抗旱性的 有效途徑。目前越來(lái)越多的抗旱相關(guān)基因已經(jīng)被克隆和用來(lái)提高植物抗旱性。按照抗旱基 因的功能，可以把植物抗旱相關(guān)基因分為兩大類：第一類屬于功能基因，其編碼在植物抗 性中直接起保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。如參與滲透調(diào)節(jié)的脯氨酸合成基因，其編碼的脯氨酸能聚 集與滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白，避免或減少因細(xì)胞脫水引起的蛋白質(zhì)變性。第二類屬于調(diào)節(jié) 基因，其編碼在信號(hào)傳導(dǎo)和逆激基因表達(dá)過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)因子。如DREB、MYC/ MYB、bZIP、WRKY和NAC類轉(zhuǎn)錄因子，其在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的一系列抗旱相關(guān)基因的表達(dá)， 可以有效地提高植物的耐旱性，如堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABF/AREBs 能夠激活含有ABRE元件的基因表達(dá)，普遍存在于受ΑΒΑ、生長(zhǎng)素、茉莉酸、水楊酸誘導(dǎo)的基 因中，例如在水稻中組成型超量表達(dá)0sbZIP23基因，對(duì)ABA敏感性增加，但可以顯著提高 水稻在苗期和孕穗期對(duì)干旱的抗性（Xiang等，Characterization of 0sbZIP23as a key player of the basic leucine zipper transcription factor family for conferring abscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance in rice. Plant Physiol. 2008. 148(4) :1938-1952)。
[0006]因?yàn)樗臼侵匾募Z食作物和模式植物，在極端氣候條件頻發(fā)的今天，培育抗逆 性增強(qiáng)的水稻具有重要的意義。因此，從水稻中分離OsDTll基因，并鑒定它在提高水稻抗 逆性方面所發(fā)揮的功能，對(duì)于培育抗逆水稻新品種將具有非常重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)現(xiàn)有針對(duì)水稻抗旱基因的研究現(xiàn)狀，提供了一個(gè)從水稻中分 離和克隆的OsDTll基因，該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 2中所示，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì) 干旱的抗性明顯增強(qiáng)，表達(dá)量顯著降低的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì)干旱的抵抗能力明顯減弱，證明 OsDTll基因在水稻抗旱中發(fā)揮著重要作用，因此證實(shí)了超量表達(dá)OsDTll基因可以賦予植 物對(duì)由干旱所引起的性狀產(chǎn)生抗性，獲得抗旱植株。
[0008] 發(fā)明人首先提供了一個(gè)從水稻中花11中分離克隆出的的OsDTll基因，其核苷酸 序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2中所示。
[0009] 具體的方法如下：
[0010] 發(fā)明人首先獲得了水稻中花11基因，之后通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增水稻中花11 基因獲得目標(biāo)基因，其中所述的引物包括引物1，5< -AGGCAATGGCGAGCACTA-3'其序列如 序列表SEQ ID NO. 3所示，引物2,5< -ACGCAGGACGTGAAGAGCHV其序列如序列表SEQ ID NO. 4所示；
[0011] 為了驗(yàn)證其功能，發(fā)明人利用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)和基于RNA干擾（RNA interference, RNAi)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將OsDTll基因的超量表達(dá)載體和RNAi載體轉(zhuǎn)入水稻品種中花 11，超量及抑制水稻中OsDT 11基因的表達(dá)，結(jié)果表明OsDT 11基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn) 化水稻對(duì)干旱的抗性明顯增強(qiáng)，表達(dá)量顯著降低的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì)干旱的抵抗能力明顯減 弱，證明OsDTll基因在水稻抗旱中發(fā)揮著重要作用。
[0012] 采用上述的方法，主要是可以將克隆的抗旱相關(guān)基因轉(zhuǎn)入抗性弱的植物，有助于 產(chǎn)生新的抗旱植物。特別是可以用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物中累加多個(gè)抗旱基因，而不會(huì)產(chǎn)生 傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的連鎖基因組序列。
[0013] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了一個(gè)從水稻中分離克隆出的抗旱相關(guān)基因 完整編碼區(qū)段的DNA片段，并命名為0sDT11，并驗(yàn)證了該基因的功能，利用其功能最終發(fā)現(xiàn) 采用超量表達(dá)之后可以賦予植物對(duì)由干旱所引起的性狀產(chǎn)生抗性，獲得抗旱植株。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為用定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PEG8000處理水稻中花11后OsDTll基因的表達(dá) 模式結(jié)果示意圖；
[0015] 圖中黑色柱形圖表示水處理后基因的表達(dá)，白色的柱形圖表示的是PEG8000處理 后基因的表達(dá)，可以看到在處理〇、3、6、24h后取樣的檢測(cè)結(jié)果，以水處理為對(duì)照，可見(jiàn)在 PEG8000處理6小時(shí)的時(shí)候，OsDTll基因表達(dá)量與對(duì)照相比有明顯的提高；
[0016] 圖2為遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0017] 圖3為遺傳轉(zhuǎn)化載體dsl301RNAi機(jī)制示意圖；
[0018] 圖4熒光定量RT-PCR檢測(cè)超量表達(dá)和抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因T2代植株中OsDTll基因 的表達(dá)量結(jié)果示意圖；
[0019] 圖中縱坐標(biāo)為OsDTll基因在每份水稻材料中的相對(duì)表達(dá)量（對(duì)照材料的表達(dá)量 定為1)
[0020]圖5為超量表達(dá)和抑制表達(dá)OsDTll基因的T2代遺傳轉(zhuǎn)化水稻植株受干旱脅迫表 型彩圖；
[0021] 圖中，超量表達(dá)T2代遺傳轉(zhuǎn)化植株（CD11ZH-1、CD11ZH-2、CD11ZH_3)在受到干旱 脅迫17天后的表型，可以看到其葉片仍能保持綠色，只發(fā)生了卷曲，而野生型中花11植株 的葉片已經(jīng)失綠枯黃，萎蔫卷曲，抑制表達(dá)株系（⑶12ZH-1、⑶12ZH-2、⑶12ZH-3)表現(xiàn)的比 野生型更加敏感。并且在恢復(fù)澆水7天后，超量表達(dá)的株系基本恢復(fù)到正常植株的表型，而 對(duì)照和抑制株系基本上已枯死。說(shuō)明在水稻中超量表達(dá)OsDTll基因能夠顯著改善水稻抵 御干旱脅迫的能力。
[0022] 圖6為超量表達(dá)和抑制表達(dá)OsDTll基因的T2代遺傳轉(zhuǎn)化水稻植株失水率統(tǒng)計(jì) 的示意圖；可以看到超量表達(dá)OsDTll基因的植株失水率比野生型的明顯低，而抑制表達(dá) OsDTll基因的植株失水率明顯比野生型高。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下實(shí)施例中定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在克隆包含有OsDTll基因完整編 碼區(qū)段的DNA片段，以及驗(yàn)證OsDTll基因功能的方法。根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可 以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采 用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0024] 實(shí)施例I =OsDTll基因超量表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體的構(gòu)建以及遺傳轉(zhuǎn)化
[0025] 1.超量表達(dá)載體的構(gòu)建
[0026] 超量表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下：首先根據(jù)核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank AK059202得到 OsDTll基因序列，發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)為714bp，沒(méi)有內(nèi)含子，編碼88個(gè)氨基酸，以此為參考設(shè) 計(jì)引物，用來(lái)擴(kuò)增OsDTll基因；
[0027] 提取水稻品種中花11的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用正向引物-引物3 (5' -ATGGGTACCAGGCAATGGCGAGCACTA-3'，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶KpnI識(shí)別位點(diǎn)， 其序列如序列表SEQ ID NO. 5所示）和反向引物-引物6 C -ATGGGATCCACGCAGGACGTGAA GAGC-3'，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn)，其序列如序列表SEQ ID NO. 6所 示）；
[0028] 反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94 °C 3min，變性94 °C 30s，退火54 °C 30s，延伸 72°C 45s (lkb/min速度），反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，后延伸72°C 7min，結(jié)束后，用康為公司的DNA回 收試劑盒回收并純化擴(kuò)增片段，用Kpn I和BamH I雙酶切PCR產(chǎn)物及載體pU1301 (如圖 2所示），酶切完全后在75°C水浴IOmin滅活限制性內(nèi)切酶，利用乙醇沉淀純化回收，并用 T4DNA連接酶將純化回收的產(chǎn)物和純化回收pU1301載體連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆提質(zhì)粒，并用相同的酶進(jìn)行酶切檢測(cè)，電泳檢測(cè)酶切結(jié)果正確，測(cè) 序由華大基因完成，測(cè)序結(jié)果表明載體構(gòu)建成功。命名為PU1301: :0sDTll，作為超量表達(dá) 載體。
[0029] 2.抑制表達(dá)載體的構(gòu)建
[0030] 抑制表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下：用水稻中花11的基因組為模板擴(kuò)增，用引物 5(5' -AAGACTAGTGGTACCTGGCGAGCACTAAGATGG-3'，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶 SpeI 和 KpnI識(shí)別位點(diǎn)，其序列如序列表SEQ ID NO. 7所示）和引物6(5' -AAGGAGCTCGGATCCTAGGG ACCGAACGCAGAA-3\帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI識(shí)別位點(diǎn)，其序列如序列 表SEQ ID NO. 8所示）擴(kuò)增基因組；
[0031] PCR反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94°C 3min，變性94°C 30s，退火54°C 30s，延伸 72°C 45s(lkb/min速度），反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，后延伸72°C 7min，結(jié)束后，用康為公司的DNA回 收試劑盒回收并純化擴(kuò)增片段，用康為公司的DNA回收試劑盒回收并純化擴(kuò)增片段。
[0032] 構(gòu)建OsDTll基因片段第一重復(fù)鏈，用Kpn I和BamH I雙酶切PCR產(chǎn)物及載體 dsl301 (如圖3所示），酶切完全后在75°C水浴IOmin滅活限制性內(nèi)切酶，利用乙醇沉淀純 化回收，并用T4DNA連接酶將純化回收的PCR產(chǎn)物和純化回收的dsl301載體連接。轉(zhuǎn)化大 腸桿菌E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆提質(zhì)粒，并用相同的酶進(jìn)行酶切檢測(cè)，電泳檢 測(cè)酶切結(jié)果正確，測(cè)序由華大基因完成，測(cè)序結(jié)果表明第一重復(fù)鏈載體構(gòu)建成功。
[0033] 構(gòu)建OsDTll基因片段第二重復(fù)鏈，用Spe I和Sac I雙酶切PCR產(chǎn)物和上述構(gòu)建 成功的第一重復(fù)鏈載體，酶切完全后在75°C水浴IOmin滅活限制性內(nèi)切酶，利用乙醇沉淀 純化回收，并用T4DNA連接酶將純化回收的PCR產(chǎn)物和純化回收的第一重復(fù)鏈載體連接。轉(zhuǎn) 化大腸桿菌E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆提質(zhì)粒，并用相同的酶進(jìn)行酶切檢測(cè)，電 泳檢測(cè)酶切結(jié)果正確，測(cè)序由華大基因完成，測(cè)序結(jié)果表明第二重復(fù)鏈載體構(gòu)建成功。命名 為dsl301 : :0sDTll，作為抑制表達(dá)載體。
[0034] 3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
[0035] 將構(gòu)建好的超量和抑制表達(dá)載體pU1301::0sDTll和dsl301::0sDTll電轉(zhuǎn)化農(nóng) 桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105,保存菌株用作農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化。
[0036] 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法（Lin和Zhang,Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice，2005， Plant Cell Rep. 23 :540-547)將超量和抑制表達(dá)載體導(dǎo)入水稻品種中花11中。獲得的超量和抑制表達(dá) 遺傳轉(zhuǎn)化植株分別被命名為CDllZH和CD12ZH。本發(fā)明分別獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株23株和40 株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽(yáng)性鑒定后，得到13株超量植株，命名為CDl 1ZH1-13和26株抑制植 株,命名為CD12ZH1-26。
[0037] 本實(shí)施例的具體農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化主要步驟和試劑如下：
[0038] (1)電轉(zhuǎn)化：將構(gòu)建好的超量和抑制表達(dá)載體pU1301::0sDTll和dsl301:: OsDTll，用1800v電壓，電轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105菌株，涂到帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的常用的LA 培養(yǎng)基上篩選出陽(yáng)性克隆，用于下述轉(zhuǎn)化愈傷。
[0039] (2)愈傷誘導(dǎo)：將成熟的水稻種子中花11去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分 鐘，0. 15%氯化汞（HgC12)種子表面消毒15分鐘；用滅菌水洗種子4-5次；將消毒過(guò)的種子 放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25 ± I °C。
[0040] (3)愈傷繼代：挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗 下培養(yǎng)2周，溫度25±1°C。
[0041] (4)預(yù)培養(yǎng)：挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周， 溫度 25±1°C。
[0042] (5)農(nóng)桿菌培養(yǎng)：在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105兩天， 培養(yǎng)溫度28°C ;將所述的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。
[0043] (6)農(nóng)桿菌侵染：將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液 至0D6000. 8-1. O ;將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸 干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20°C。
[0044] (7)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)：滅菌水洗滌愈傷至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；浸泡在含400ppm羧 芐青霉素（CN)的滅菌水中30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培 養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。（第一次羧芐青霉素篩選濃度為400ppm，第二次及以后為 250ppm，潮霉素濃度為250ppm)。
[0045] (8)分化：將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng) 的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26 °C。
[0046] (9)生根：剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3 周，溫度26°C。
[0047] (10)移栽：洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最 初的幾天保持水分濕潤(rùn)。
[0048] 上述試劑和溶液均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，具體可參考"采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 方法（Lin 和 Zhang，Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice，2005，Plant Cell Rep. 23:540-547)"中記載的方案，在 此不再贅述。
[0049] 實(shí)施例2 :0sDTll基因在水稻中的表達(dá)模式分析
[0050] 為了證實(shí)OsDTll基因受干旱脅迫的誘導(dǎo)，參與抗旱反應(yīng)。本發(fā)明采用熒光定量 RT-PCR技術(shù)分析了 OsDTll基因在PEG8000處理水稻品種中花11后的表達(dá)模式。采用15% (w/v)的PEG8000處理成株期的水稻，用水處理的作為對(duì)照組。分別在0、3、6、24小時(shí)時(shí)剪 取水稻的根，并提取總RNA，參照Z(yǔ)hou(Zhc)U等，2002)的方法，使用oligo (dT) 15寡聚引物 和SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用iQTM5定量PCR儀（Bio-Rad 公司）、SYBR Green熒光嵌入染料做定量RT-PCR分析，水稻內(nèi)源肌動(dòng)蛋白基因Actin的表達(dá) 量用于RNA樣品的均一化評(píng)價(jià)，利用2^ Λετ相對(duì)定量的方法比較分析基因表達(dá)量（Qiu等， 2007)，比較各時(shí)間點(diǎn)處理組和對(duì)照組中OsDTll基因的表達(dá)量變化；
[0051] OsDTll 基因的定量 RT-PCR 反應(yīng)引物是 OsDTlIF (5' -TGTGTGACGCCGTGCAAT-3'， 其序列如序列表SEQ ID NO. 9所示）和OsDTllRC -CCAGGGCCGGAAGCTAGA-3\其序列如 序列表SEQ ID NO. 10所示）；
[0052] 水稻內(nèi)源肌動(dòng)蛋白基因Actin的定量RT-PCR反應(yīng)引物是actinF(5' -TGCTATGTA CGTCGCCATCCAG-3/其序列如序列表SEQIDN0·ll所示）和actinR(5 /-AATGAGTAACCACG CTCCGTCA-3/，其序列如序列表SEQIDN0·12所示） ；
[0053] 分析結(jié)果顯示與水處理對(duì)照組相比，在PEG8000處理6小時(shí)后，OsDTll基因就明 顯的受到誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)（如圖1所示），說(shuō)明OsDTll基因參與抗旱反應(yīng)的調(diào)控。
[0054] 實(shí)施例3 =OsDTll轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定和抗旱性鑒定
[0055] 選用T2代轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)、抑制表達(dá)和野生型中花11的種子，催芽后播種于盛有 育苗基質(zhì)的盒子內(nèi)，培養(yǎng)條件為光照/黑暗為16/8h，光照條件25°C，黑暗條件23°C，光強(qiáng) 300001X。利用熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中OsDTll基因的表達(dá)量（如圖4所 示）。從圖中看出，超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中OsDTll的表達(dá)量明顯高于野生型中花11植株 (如圖4A所示），抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株OsDTll基因的表達(dá)明顯低于野生型中花11植株 (如圖4B所示）。
[0056] 在水稻長(zhǎng)至成株期時(shí)，分別選取3組來(lái)自不同轉(zhuǎn)基因株系的超量和抑制表達(dá)植 株，每組10棵，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)?？梢钥吹皆诟珊堤幚?7天后，超量表達(dá)植株明顯好于野 生型和抑制表達(dá)植株，而抑制表達(dá)植株對(duì)干旱最敏感，表現(xiàn)為葉片全部枯黃，在恢復(fù)澆水7 天后，可以看到只有超量表達(dá)植株能恢復(fù)到了正常的水稻植株表型（如圖5所示）。
[0057] 失水率的檢測(cè)，分別選取野生型中化11、超量表達(dá)、抑制表達(dá)株系生長(zhǎng)勢(shì)相同的植 株，在干旱脅迫處理前稱重一次，重量為wl，干旱脅迫處理后稱重一次，重量為w2,根據(jù)公 式：失水率=(wl_w2)/Vl計(jì)算失水率，可以看到超量表達(dá)OsDTll基因的植株失水率比野 生型的明顯低，而抑制表達(dá)OsDTll基因的植株失水率明顯比野生型高（如圖6所示）。因 此，與野生型植株相比，OsDTl 1超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株最耐旱，而抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株對(duì) 干旱敏感，水稻中超量表達(dá)OsDTll基因能夠顯著改善水稻抵御干旱脅迫的能力，在水稻抗 逆育種中具有重要價(jià)值。
【權(quán)利要求】
1. 一個(gè)從水稻中分離和克隆的抗旱相關(guān)基因，該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2中所示。
2. 權(quán)利要求1所述的OsDTll基因在水稻抗旱遺傳改良中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104357455SQ201410536028
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】丁新華, 儲(chǔ)昭輝, 韓慧培, 李寧 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)