明日葉葉片組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種明日葉葉片組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，選取明日葉葉片，用流水沖洗,75％酒精溶液浸泡，無(wú)菌水沖洗，放入0.1％升汞溶液中消毒，之后再用無(wú)菌水沖洗；切塊；種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30天葉片切口處長(zhǎng)出愈傷組織團(tuán)；再將愈傷組織團(tuán)切塊,轉(zhuǎn)接至愈傷組織增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30天對(duì)愈傷組織增殖；將增殖的愈傷組織切塊，轉(zhuǎn)接于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)30天分化產(chǎn)生叢生芽；將叢生芽基部的愈傷組織切除，分割為單個(gè)芽，將芽接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天得到再生植株幼苗；馴化練苗一周后移栽入滅菌處理的椰殼土中直至幼苗成活。本發(fā)明的有益效果是明日葉葉片做繁殖材料，成本低，材料來(lái)源廣。
【專利說(shuō)明】明日葉葉片組織培養(yǎng)快繁技術(shù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物培育【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及明日葉葉片組織培養(yǎng)快繁技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 明日葉藥食兩用，尤其在藥用方面的價(jià)值更是被各界公認(rèn)為極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d 蔬菜。我國(guó)20多年前從日本引進(jìn)明日葉，目前國(guó)內(nèi)僅有少數(shù)幾家公司剛引種，栽培面積很 小，原料在國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格很高，需求量大。在生產(chǎn)過(guò)程中，明日葉植株通常在種植后1-2年 即進(jìn)入繁殖期，開花結(jié)實(shí)后立即死亡。明日葉花期持續(xù)較長(zhǎng)，果實(shí)結(jié)實(shí)率較低，在采收時(shí)種 子成熟度不一，并且其果實(shí)為雙懸果，造成明日葉的種子發(fā)芽率極低，不易大規(guī)模栽培。如 今明日葉種苗的繁育及栽培技術(shù)已成為制約明日葉及其加工品發(fā)展的瓶頸，而文獻(xiàn)中關(guān)于 明日葉的種苗繁育及栽培報(bào)道甚少，導(dǎo)致市場(chǎng)上明日葉及其產(chǎn)品的價(jià)格居高不下。
[0003] 為擴(kuò)大明日葉的工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，曾先后有一些關(guān)于明日葉組織培養(yǎng)方面的研究 報(bào)道。目前，已發(fā)表的研究結(jié)果分為三種：一是李佳等研究發(fā)現(xiàn)明日葉的葉柄和葉片均不適 宜作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，只是利用帶芽莖段進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)及分化等培養(yǎng)；二 是呂秀立等報(bào)道利用明日葉種子獲取無(wú)菌苗進(jìn)而分化增殖的培養(yǎng)方法；三是郭志友等報(bào)道 了利用葉柄及葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的方法。
[0004] 本研究和上述三者的研究相比，雖然同為利用組織培養(yǎng)的手段構(gòu)建明日葉的繁育 體系，但是卻和三者有著極大的區(qū)別。首先，和李佳等的研究相比，本研究打破了葉片不能 作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)的結(jié)論，且?guī)а壳o段和本研究所選用的葉片相比，材料有極大的限制 性；其次，和呂秀立等研究相比，本研究的材料受:限性大大降低；最后，和郭志友等的研究 結(jié)果相比，雖然取材相似，但本研究結(jié)果顯示MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基效果較好，而郭志友的報(bào) 道卻認(rèn)為N 6基礎(chǔ)培養(yǎng)基適合進(jìn)行培養(yǎng)效果明顯，因此兩者選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有著極大的不 同。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種明日葉葉片組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，解決了明日葉種子發(fā) 芽率低，市場(chǎng)上原材料不足、價(jià)格昂貴的問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是按照以下步驟進(jìn)行：
[0007] (1)選取明日葉葉片，用流水沖洗，放入無(wú)菌操作臺(tái)上備用；
[0008] (2)用75 %酒精溶液浸泡，無(wú)菌水沖洗3次，放入0. 1 %升汞溶液中消毒滅菌，之后 再用無(wú)菌水沖洗5次；
[0009] (3)用無(wú)菌濾紙吸干葉片的水，然后切割；
[0010] (4)將葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于24°C培養(yǎng)箱中20001x光強(qiáng)下培 養(yǎng)，光照條件為每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)20-30天葉片切口處長(zhǎng)出愈傷組織團(tuán)；
[0011] (5)再將愈傷組織團(tuán)切塊，轉(zhuǎn)接至愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25°C，光照條 件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lx，培養(yǎng)20-30天對(duì)愈傷組織增殖；
[0012] (6)將增殖的愈傷組織切塊，轉(zhuǎn)接于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 25°C，光照條件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lx，培養(yǎng)30天分化產(chǎn)生叢生芽；
[0013] (7)將叢生芽基部的愈傷組織切除，分割為單個(gè)芽，將芽接種于生根培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)溫度25°C，光照條件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lx，培養(yǎng)20天得到再生植 株幼苗；
[0014] (8)選取健壯幼苗于組培瓶中，移至自然環(huán)境條件下3天，打開組培瓶蓋3天馴化 練苗，經(jīng)過(guò)馴化煉苗一周后移栽入滅菌處理的椰殼土中，上覆薄膜，澆水，保持空氣濕度，1 周后逐漸打開薄膜，直至幼苗成活。
[0015] 進(jìn)一步，所述步驟3、步驟5、步驟6切塊為1cm2。
[0016] 進(jìn)一步，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+lmg/L6-BA+3mg/LNAA ;所述愈傷組 織增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2mg/L+2, 4-Dlmg/L ;所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BAlmg/ L+NAAO. 5mg/L ;所述生根培養(yǎng)基為 1/2MS+0. 02mg/LNAA。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是明日葉葉片做繁殖材料，成本低，材料來(lái)源較廣。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0019] 本發(fā)明采用MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配置不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)的組合：
[0020] 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+lmg/L6-BA+3mg/LNAA ;
[0021] 愈傷組織增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA2mg/L+2, 4-Dlmg/L ;
[0022] 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BAlmg/L+NAAO. 5mg/L ;
[0023] 生根誘導(dǎo)：l/2MS+0. 〇2mg/LNAA。
[0024] 本發(fā)明按照以下步驟進(jìn)行：
[0025] (1)以葉片為外植體，葉片優(yōu)選上端的，稍微幼嫩的葉片，但避免采集新葉，用流水 沖洗15-20min后，放入無(wú)菌操作臺(tái)上備用。
[0026] (2)在接種室，超凈工作臺(tái)上用75%酒精溶液浸泡植物材料30s后取出，無(wú)菌水沖 洗3次，放入0. 1 %升汞溶液中消毒7min，無(wú)菌水沖洗7次。
[0027] (3)用無(wú)菌濾紙吸干葉片的水，然后切成1cm2大小。
[0028] (4)將葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于24°C培養(yǎng)箱中20001x光強(qiáng)下培 養(yǎng)，光照條件為每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)20-30天至葉片切口處長(zhǎng)出愈傷組織團(tuán) 并增大。
[0029] (5)再將愈傷組織團(tuán)均勻切割為1cm2,轉(zhuǎn)接至愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度 25°C左右，光照條件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lx，培養(yǎng)20-30天愈傷組織 可增殖至6cm 2左右。
[0030] (6)將增殖的愈傷組織切割為1cm2大小，轉(zhuǎn)接于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度25°C左右，光照條件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lx，培養(yǎng)15-20天后 愈傷組織再分化產(chǎn)生叢生芽，30天后叢生芽生長(zhǎng)良好。
[0031] (7)將叢生芽基部的愈傷組織切除，分割為單個(gè)芽，將芽接種于生根培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)溫度25°C左右，光照條件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lx，培養(yǎng)20天后芽基 部分化產(chǎn)生根，生長(zhǎng)良好，得到再生植株幼苗。
[0032] (8)選取健壯幼苗于組培瓶中，移至自然環(huán)境條件下3天，打開組培瓶蓋3天馴化 練苗，經(jīng)過(guò)馴化煉苗一周后移栽入滅菌處理的椰殼土中，上覆薄膜，注意澆水，保持空氣濕 度，1周后逐漸打開薄膜，并減少澆水頻率，成活率可達(dá)94%以上。
[0033] 本發(fā)明通過(guò)葉片組織培養(yǎng)構(gòu)建明日葉的新型繁育體系，打破了由于種子發(fā)芽率低 而造成的生產(chǎn)瓶頸，為規(guī)?；a(chǎn)提供了條件。
[0034] 以上所述僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施方式而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限 制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施方式所做的任何簡(jiǎn)單修改，等同變化與修飾，均 屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 明日葉葉片組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行： (1) 選取明日葉葉片，用流水沖洗，放入無(wú)菌操作臺(tái)上備用； (2) 用75%酒精溶液浸泡，無(wú)菌水沖洗，放入0. 1 %升汞溶液中消毒，之后再用無(wú)菌水 沖洗； (3) 用無(wú)菌濾紙吸干葉片的水，然后切塊； (4) 將葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于24°C培養(yǎng)箱中20001x光強(qiáng)下培養(yǎng)，光 照條件為每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)20-30天葉片切口處長(zhǎng)出愈傷組織團(tuán)； (5) 再將愈傷組織團(tuán)切塊，轉(zhuǎn)接至愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25°C，光照條件為 16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lx，培養(yǎng)20-30天對(duì)愈傷組織增殖； (6) 將增殖的愈傷組織切塊，轉(zhuǎn)接于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光 照條件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lx，培養(yǎng)30天分化產(chǎn)生叢生芽； (7) 將叢生芽基部的愈傷組織切除，分割為單個(gè)芽，將芽接種于生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫 度25°C，光照條件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lx，培養(yǎng)20天得到再生植株幼 苗； (8) 選取健壯幼苗于組培瓶中，移至自然環(huán)境條件下3天，打開組培瓶蓋3天馴化練苗， 經(jīng)過(guò)馴化煉苗一周后移栽入滅菌處理的椰殼土中，上覆薄膜，澆水，保持空氣濕度，1周后逐 漸打開薄膜，直至幼苗成活。
2. 按照權(quán)利要求1所述明日葉葉片組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，其特征在于：所述步驟3、步驟 5、步驟6切塊為lcm2。
3. 按照權(quán)利要求1所述明日葉葉片組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，其特征在于：所述愈傷組 織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+lmg/L6-BA+3mg/LNAA ;所述愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2mg/ L+2, 4-Dlmg/L ;所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BAlmg/L+NAA0. 5mg/L ;所述生根培養(yǎng)基為 1/2MS+0. 02mg/LNAA。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104145817SQ201410369167
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】羅充, 辛柯, 姚紅艷, 馮曉英, 陳顯剛, 吳濤, 羅開源, 趙敏 申請(qǐng)人:貴州師范大學(xué)