大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：(1)植物外植體的選擇及無(wú)菌處理；(2)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)增殖培養(yǎng)；(4)壯苗培養(yǎng)；(5)生根培養(yǎng)。所述培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均為特定的培養(yǎng)基。本發(fā)明的大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，優(yōu)點(diǎn)在于：無(wú)菌條件下莖尖剝離，選用配方合理的培養(yǎng)基，在特定的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)出的大薯組培苗可脫除病毒，生根率高，移栽成活率高，可有效恢復(fù)優(yōu)良品種的特性。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)大薯脫毒種苗，產(chǎn)量大，成本低，周期短，可快速有效地繁殖大薯脫毒組培苗。
【專利說(shuō)明】大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及通過組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)植物種苗的方法，具體涉及一種大薯脫毒組培 苗的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 大薯為多年生纏繞草質(zhì)藤本，隸屬于薯蕷科薯蕷屬；原產(chǎn)于亞洲熱帶地區(qū)，主要分 布在福建、廣東、廣西、海南、臺(tái)灣等地。大薯耐旱，耐熱，產(chǎn)量潛力高，且淀粉含量較高，生育 期短，營(yíng)養(yǎng)豐富，色澤鮮艷，口感俱佳，食用、藥用兼?zhèn)?，具有良好的市?chǎng)開發(fā)前景和推廣價(jià) 值。
[0003] 目前，大薯主要通過地下塊莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，種子材料消耗大，且這種自留種的栽 培形式會(huì)使其種性退化，品質(zhì)降低，產(chǎn)量下降。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了對(duì)大薯的初步研究， 包括化學(xué)成分，藥理活性，人工種植等方面。而有關(guān)大薯的生物技術(shù)方法的研究較少，組織 培養(yǎng)的研究主要集中在組織誘導(dǎo)、基本培養(yǎng)條件篩選和理化因子的考查等方面。
[0004] 目前還沒有找到一個(gè)切實(shí)有效的培養(yǎng)技術(shù)用以解決大薯脫毒苗誘導(dǎo)、增殖生根培 養(yǎng)中存在的疑點(diǎn)和難點(diǎn)，從而影響了大薯的深入研究和應(yīng)用。因此，研究大薯的脫毒培養(yǎng)技 術(shù)，使得大薯快速繁殖大量的脫毒種苗得以實(shí)現(xiàn)，且為大薯的良種繁育及實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化顯得 十分重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，為克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了一種繁殖速度快的 大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0008] (1)植物外植體的選擇及無(wú)菌處理：選擇大薯帶芽莖段為外植體，用水沖洗干凈， 切取頂芽，將頂芽組織置于超凈工作臺(tái)中，用75%酒精（體積百分?jǐn)?shù)）消毒30?60秒，再 用質(zhì)量濃度為5%?10%次氯酸鈉溶液消毒6?10分鐘，消毒后，取出頂芽，無(wú)菌水沖洗 3?5次，最后用無(wú)菌濾紙吸干無(wú)菌水，無(wú)菌條件下用解剖鏡剝?nèi)∏o尖；
[0009] (2)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述剝?nèi)〉那o尖接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生 芽，培養(yǎng)期為40天，得叢生芽；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組份組成為：MS+BA 1. 5?2. Omg/ L+GA30. 1 ?0· 5mg/L+NAA 0· 1 ?0· 5mg/L+ 蔗糖 20 ?30g/L+ 瓊脂 4 ?6g/L( S卩：向 MS 培 養(yǎng)基中加入終濃度為1. 5?2. Omg/L的ΒΑ、0. 1?0. 5mg/L的GA3、0. 1?0. 5mg/L的NAA、 20?30g/L的蔗糖以及4?6g/L的瓊脂而成；該表述方式為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員慣用的表 述方式；下同）；
[0010] (3)增殖培養(yǎng)：將上述誘導(dǎo)出的叢生芽接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，30天 繼代一次，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次，培養(yǎng)期為120天；所述增殖培養(yǎng)基的組份組成為：MS+BA 2. 0? 3. Omg/L+NAA 0· 2 ?0· 5mg/L+ 鹿糖 20 ?30g/L+ 瓊脂 4 ?6g/L ;
[0011] (4)壯苗培養(yǎng)：將上述增殖培養(yǎng)出的叢生芽切成單芽或者小叢芽，接種到壯苗培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)期為20天；所述壯苗培養(yǎng)基的組份組成為：MS+BA 0. 5?1. Omg/L+IBA 0. 1? 0· 6mg/L+ 鹿糖 20 ?30g/L+ 瓊脂 4 ?6g/L ;
[0012] (5)生根培養(yǎng)：將上述壯苗培養(yǎng)后的開葉的小苗接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)期為 35天，即得大薯脫毒組培苗；所述生根培養(yǎng)基的組份組成為：1/2MS+IBA 0. 1?0. 5mg/L+蔗 糖20?30g/L+瓊脂4?6g/L(l/2MS是指基礎(chǔ)培養(yǎng)基中各物質(zhì)的濃度為MS培養(yǎng)基的一 半）。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中，用水清洗干凈的具體操作方式為：先用自來(lái)水沖洗干 凈，再用蒸餾水沖洗。
[0014] 優(yōu)選的，所述步驟（2)?（5)中，培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度23?27°C，光照時(shí)間 10?16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度2000?30001X。
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟（2)中，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組份組成優(yōu)選為：MS+BA 2. Omg/ L+GA30. lmg/L+NAA 0· 5mg/L+ 鹿糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5. 5 ?5. 8 (各組分混合混勻 后，若pH不在此范圍內(nèi)，則通過氫氧化鈉溶液或鹽酸調(diào)整pH至該范圍內(nèi)；下同）。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中，增殖培養(yǎng)基的組份組成優(yōu)選為：MS+BA 2. 5mg/L+NAA 0· 5mg/L+ 鹿糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5. 5 ?5. 8。
[0017] 優(yōu)選的，所述步驟（4)中，壯苗培養(yǎng)基的組份組成優(yōu)選為：MS+BA 0. 5mg/L+IBA 0· 5mg/L+ 鹿糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5· 5 ?5· 8。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟（5)中，生根培養(yǎng)基的組份組成優(yōu)選為：1/2MS+IBA 0. lmg/L+蔗 糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5. 5 ?5. 8。
[0019] 本發(fā)明的大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，優(yōu)點(diǎn)在于：無(wú)菌條件下莖尖剝離，選用配方 合理的培養(yǎng)基，在特定的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)出的大薯組培苗可脫除病毒，生根率高，移栽成 活率高，可有效恢復(fù)優(yōu)良品種的特性。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)大薯脫毒種苗，產(chǎn)量大，成本低， 周期短，可快速有效地繁殖大薯脫毒組培苗。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0021] 實(shí)施例1大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法
[0022] 步驟如下：
[0023] (1)外植體的選擇及無(wú)菌處理：選擇大薯（種質(zhì)資源來(lái)自海南儋州八一農(nóng)場(chǎng)）生 長(zhǎng)優(yōu)良植株的帶芽莖段為外植體，用自來(lái)水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗，切取頂芽，將頂芽 組織置于超凈工作臺(tái)中，用75 %酒精消毒60秒，再用10%次氯酸鈉溶液消毒8分鐘，無(wú)菌 水沖洗5次，最后用無(wú)菌濾紙吸干無(wú)菌水，無(wú)菌條件下剝?nèi)∏o尖；
[0024] (2)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將剝?nèi)〉那o尖接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA 2. Omg/ L+GA30. lmg/L+NAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L中誘導(dǎo)叢生芽，培養(yǎng)期為40天，接種第 15天莖尖變綠膨大，開始形成綠色愈傷組織，30天叢生芽明顯伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)較快，40天時(shí)叢生 芽的誘導(dǎo)率為100%，如表1所示；
[0025] 表 1
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 植物外植體的選擇及無(wú)菌處理：選擇大薯帶芽莖段為外植體，用水沖洗干凈，切取 頂芽，頂芽用75%酒精消毒30?60秒，再用濃度為5%?10%次氯酸鈉溶液消毒6?10 分鐘，消毒后，取出頂芽，無(wú)菌水沖洗3?5次，最后用無(wú)菌濾紙吸干無(wú)菌水，無(wú)菌條件下剝 取莖尖； (2) 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述剝?nèi)〉那o尖接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽， 培養(yǎng)期為40天，得叢生芽；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組份組成為：MS+BA 1. 5?2. Omg/ L+GA30. 1 ?0· 5mg/L+NAA 0· 1 ?0· 5mg/L+ 鹿糖 20 ?30g/L+ 瓊脂 4 ?6g/L ; (3) 增殖培養(yǎng)：將上述誘導(dǎo)出的叢生芽接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，30天繼代 一次，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次，培養(yǎng)期為120天；所述增殖培養(yǎng)基的組份組成為：MS+BA 2. 0?3. Omg/ L+NAA 0· 2 ?0· 5mg/L+ 鹿糖 20 ?30g/L+ 瓊脂 4 ?6g/L ; (4) 壯苗培養(yǎng)：將上述增殖培養(yǎng)出的叢生芽切成單芽或者小叢芽，接種到壯苗培養(yǎng) 基中，培養(yǎng)期為20天；所述壯苗培養(yǎng)基的組份組成為：MS+BA 0. 5?1. Omg/L+IBA 0. 1? 0· 6mg/L+ 鹿糖 20 ?30g/L+ 瓊脂 4 ?6g/L ; (5) 生根培養(yǎng)：將上述壯苗培養(yǎng)后的開葉的小苗接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)期為35天， 即得大薯脫毒組培苗；所述生根培養(yǎng)基的組份組成為：1/2MS+IBA 0. 1?0. 5mg/L+蔗糖 20 ?30g/L+ 瓊脂 4 ?6g/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟（1)中， 用水清洗干凈的具體操作方式為：先用自來(lái)水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟（2)? (5)中，培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度23?27°C，光照時(shí)間10?16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度2000? 30001x。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟（2) 中，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組份組成優(yōu)選為：MS+BA 2. 0mg/L+GA3 0. lmg/L+NAA 0. 5mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5· 5 ?5· 8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟（3)中， 增殖培養(yǎng)基的組份組成優(yōu)選為：MS+BA 2. 5mg/L+NAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L，pH值 為 5. 5 ?5. 8。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟（4)中， 壯苗培養(yǎng)基的組份組成優(yōu)選為：MS+BA 0. 5mg/L+IBA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L，pH值 為 5· 5 ?5· 8。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟（5)中， 生根培養(yǎng)基的組份組成優(yōu)選為：1/2MS+IBA 0· lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L，pH值為5. 5? 5. 8。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104041419SQ201410336067
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】王曉娟 申請(qǐng)人:無(wú)錫中農(nóng)科生物育種技術(shù)研究院有限公司