一種與植物木質(zhì)化相關(guān)的microRNA857及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種與植物木質(zhì)化相關(guān)的microRNA857及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用。該應(yīng)用為如下任一所述生物材料在降低植物木質(zhì)化程度中的應(yīng)用：(1)miR857；(2)miR857的編碼基因；(3)表達(dá)miR857的重組載體。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，過(guò)量表達(dá)miR857導(dǎo)致莖干平均直徑減小和機(jī)械強(qiáng)度減弱，木質(zhì)素含量降低。本發(fā)明為木本植物以及有關(guān)農(nóng)作物木質(zhì)化程度的改變等提供了更多的有效途徑。本發(fā)明為根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要來(lái)培育木質(zhì)素含量低的植物品種，提供了一種全新的并且簡(jiǎn)單有效的方法。
【專利說(shuō)明】-種與植物木質(zhì)化相關(guān)的micr〇RNA857及其相關(guān)生物材料 與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種與植物木質(zhì)化相關(guān)的microRNA857及其 相關(guān)生物材料與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物的木質(zhì)化與人類生活息息相關(guān)，木質(zhì)化形成的木材是制漿造紙、建筑業(yè)以及 紡織業(yè)的原材料，在人類的生產(chǎn)和生活中起著重要的作用。木質(zhì)化是木質(zhì)素在特化細(xì)胞的 細(xì)胞壁中沉積的過(guò)程，如木質(zhì)部導(dǎo)管分子和厚壁組織細(xì)胞壁的加厚等，在維持植物正常結(jié) 構(gòu)、輸導(dǎo)水分和養(yǎng)料、防御機(jī)體不受病原菌侵害方面發(fā)揮著重要的作用。其中，木質(zhì)素是植 物體內(nèi)比重僅次于纖維素的高分子化合物，與某些農(nóng)藝形狀和實(shí)際生產(chǎn)密切相關(guān)。譬如，木 質(zhì)素的含量和組分與作物的抗倒伏相關(guān)；作為黏合劑和各種添加劑已廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè) 中；木質(zhì)素具有高熱能，分子中的碳?xì)浜扛哌_(dá)70-80%，其內(nèi)蘊(yùn)含豐富的能量，將來(lái)可能 作為燃料替代品等。然而，木質(zhì)素的存在也會(huì)產(chǎn)生一些負(fù)面效應(yīng)，例如它是造紙工業(yè)廢水污 染產(chǎn)生的主要源頭物質(zhì)，飼料植物中木質(zhì)素含量及單體分布比例直接影響到牲畜的消化和 吸收等。因此，利用分子生物學(xué)手段根據(jù)實(shí)際需要調(diào)控木質(zhì)素的含量，進(jìn)而改變植物的木質(zhì) 化程度，具有潛在的應(yīng)用前景。
[0003] MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源的長(zhǎng)約20?24核苷酸的非編碼RNA，它是一類新 型的調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA。miRNA通過(guò)與靶基因 mRNA分子互補(bǔ)配對(duì)來(lái)識(shí)別并指導(dǎo) 靶基因的切割或抑制靶基因的翻譯等方式，特異地對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而調(diào)節(jié)真 核生物的生長(zhǎng)發(fā)育。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)miRNAs幾乎參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的所有重要 過(guò)程，包括調(diào)控植物器官的發(fā)生發(fā)育（Yoon et al.，2010;Vidal et al.，2010;Wang et al. ,2011)、參與激素應(yīng)答途徑（Gutierrez et al.，2009;Yoon et al.，2010;Navar;ro et al.，Scho_er et al·，2008)、參與逆境響應(yīng)途徑（Navarro et al·，2006 ;Zhao et al·，2007)、參與對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素吸收的調(diào)控（Zhao et al·，2011 ;Kawashima et al·，2009; Bari et al.，2006)及其對(duì)自身合成代謝的反饋調(diào)節(jié)（Rajagopalan et al.2006)等。此 夕卜，大量miRNA的靶基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的蛋白（Jones-Rhoades et al.，2006)。
[0004] 以上實(shí)例均表明miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的發(fā)揮了重要的作用。如果能夠利用 miRNA這種新型的調(diào)控分子來(lái)研究植物木質(zhì)化過(guò)程及其生物學(xué)特性，對(duì)于改良植物中木材 性狀以及改變木材生長(zhǎng)量具有十分重要的意義。然而，到目前為止，關(guān)于miRNA參與對(duì)植物 木質(zhì)化調(diào)控的研究未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與植物木質(zhì)化程度相關(guān)的micr〇RNA857及其相關(guān) 生物材料在降低植物木質(zhì)化程度中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的應(yīng)用為如下任一所述生物材料在降低植物木質(zhì)化程度中的應(yīng)用 或在抑制植物中LAC7基因轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用：
[0007] (l)miR857 ；
[0008] (2)miR857 的編碼基因；
[0009] (3)表達(dá)miR857的重組載體。
[0010] 上述應(yīng)用中，所述miR857的序列如SEQ ID No. 2所示；
[0011] 上述應(yīng)用中，所述miR857的編碼基因的序列如SEQ ID No. 1所示；
[0012] 上述應(yīng)用中，所述表達(dá)miR857的重組載體是將SEQ ID No. 1所示DNA插入植物表 達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)得到的。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述降低植物木質(zhì)化程度為降低植物莖干的木質(zhì)化程度。
[0014] 上述應(yīng)用中，所述降低植物木質(zhì)化程度體現(xiàn)在如下方面中的至少一種：
[0015] (1)降低木質(zhì)素含量；
[0016] (2)降低植物莖干的機(jī)械強(qiáng)度；
[0017] (3)降低植物莖干的直徑；
[0018] (4)降低植物莖干的鮮重；
[0019] (5)降低厚壁細(xì)胞占植物莖干橫切面的比例；
[0020] (6)降低植物單個(gè)維管束中木質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目；
[0021] (7)使植物木質(zhì)部細(xì)胞排列更加松散。
[0022] 上述應(yīng)用中，所述植物為草本植物或木本植物；所述草本植物具體為擬南芥。
[0023] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0024] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：使受體植物中過(guò)表達(dá) miR857,得到木質(zhì)化程度低于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物。
[0025] 上述方法中，所述使受體植物中過(guò)表達(dá)miR857的方法為：向受體植物中導(dǎo)入 miR857的編碼基因。
[0026] 上述方法中，所述木質(zhì)化程度為植物莖干的木質(zhì)化程度。
[0027] 上述方法中，所述木質(zhì)化程度體現(xiàn)在如下方面中的至少一種：
[0028] (1)木質(zhì)素含量；
[0029] (2)植物莖干的機(jī)械強(qiáng)度；
[0030] ⑶植物莖干的直徑；
[0031] (4)植物莖干的鮮重；
[0032] (5)厚壁細(xì)胞占植物莖干橫切面的比例；
[0033] (6)植物單個(gè)維管束中木質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目；
[0034] (7)植物木質(zhì)部細(xì)胞排列狀況。
[0035] 上述方法中，所述植物為草本植物或木本植物；所述草本植物具體為擬南芥。
[0036] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，過(guò)量表達(dá)miR857導(dǎo)致莖干平均直徑減小和機(jī)械強(qiáng)度減弱， 木質(zhì)素含量降低。本發(fā)明為木本植物以及有關(guān)農(nóng)作物木質(zhì)化程度的改變等提供了更多的有 效途徑。本發(fā)明為根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要來(lái)培育木質(zhì)素含量低的植物品種，提供了一種全新的 并且簡(jiǎn)單有效的方法。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為AtMIR857基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定。
[0038] 圖2為重組質(zhì)粒pBI121-35S-miR857載體示意圖。
[0039] 圖3為35S:MIR857過(guò)表達(dá)植株中靶基因 AtLAC7的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。
[0040] 圖4為35S:MIR857過(guò)表達(dá)植株木質(zhì)素含量測(cè)定。
[0041] 圖5為35S:MIR857過(guò)表達(dá)植株木質(zhì)化特性分析圖。
[0042] 圖6為35S:MIR857過(guò)表達(dá)植株莖部解剖結(jié)構(gòu)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0044] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045] 實(shí)施例1 :植物表達(dá)載體pBI121-35S-miR857的構(gòu)建。
[0046] 1、DNA的提取。采用CTAB法提取野生型擬南芥的基因組DNA。
[0047] 2、引物的設(shè)計(jì)。在上下游引物的5'端分別引入BamH I和EcoR I的酶切位點(diǎn)（下 劃線）以及保護(hù)堿基。引物序列如下：
[0048] miR857-F: 5' -GCGGATCCTTCGACTCCTACAACAAACTTTC-3' ；
[0049] miR857-R: 5' ~GCGAATTCTCCGATTCCTACAATACACCTTC~3,。
[0050] 3、目的基因的擴(kuò)增。以野生型擬南芥基因組DNA為模版，采用miR857-F和 miR857-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為377bp的目的基因片段。
[0051] PCR反應(yīng)結(jié)束后，取2 μ L反應(yīng)液進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，擴(kuò)增出 的約377bp的AtMIR857基因特異條帶如圖1所示。PCR產(chǎn)物回收連入Τ載體后測(cè)序，結(jié)果 正確。
[0052] 4、載體的構(gòu)建。用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對(duì)表達(dá)載體pBI121和上述PCR 純化產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切，連接，得到重組表達(dá)載體pBI121-35S-miR857，
[0053] 圖2為重組質(zhì)粒pBI121-35S-miR857的構(gòu)建示意圖。測(cè)序表明，連入pBI121的基 因序列如SEQ ID No. 1所示。該載體在植物體內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物為miR857，miR857序列如SEQ ID No. 2 所示。
[0054] 實(shí)施例2 :轉(zhuǎn)基因植株的獲得及Real-time PCR分析
[0055] -、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。
[0056] 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，采用活體植株農(nóng)桿菌浸花法進(jìn)行 轉(zhuǎn)化，通過(guò)農(nóng)桿菌浸染野生型擬南芥植株，將目的片段插入到擬南芥基因組DNA中。具體步 驟如下：
[0057] 1、挑取農(nóng)桿菌單菌落接種到5-10mL含抗生素（Rif+Gen+Kan)的LB液體培養(yǎng)基 中，在28°C、250rpm條件下，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期。
[0058] 2、以1:50比例轉(zhuǎn)接至新鮮的抗生素（Rif+Gen+Kan)LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件下 培養(yǎng)至00600為1-2左右。6000印111離心收集菌體，用5%蔗糖洗兩遍，然后用適量浸花液 (5%蔗糖，0· 02% silwet L-77)重懸到 0D600 為 0· 8。
[0059] 3、選取四周左右剛開(kāi)花的擬南芥植株，剪去果莢，然后將整個(gè)花序浸泡在上述浸 花液中15s，同時(shí)不停攪動(dòng)。
[0060] 4、農(nóng)桿菌浸染后的擬南芥放于陰暗環(huán)境下保濕培養(yǎng)24h，然后將擬南芥移到培養(yǎng) 室中正常培養(yǎng)，7d后再浸泡轉(zhuǎn)化一次。
[0061] 二、轉(zhuǎn)基因植株篩選
[0062] 1、將收獲成熟的種子放到10mL的離心管中，加入5mL消毒液[0. 5 % (v/v) NaClO+O.Ol% (v/v)Triton X-100]表面消毒 10_15min，期間不停顛倒混勻。
[0063] 2、倒掉消毒液，加入5mL滅菌水，洗3-4次。
[0064] 3、將消毒好的種子鋪到含有卡那霉素（50 μ g/mL)的1/2MS固體平板上。
[0065] 4、將平板在4°C低溫處理3d，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：22°C，16h光 照/8h黑暗。
[0066] 5、挑取抗性植株移入土中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0067] 6、采用CTAB法從轉(zhuǎn)基因植株的葉片中提取DNA。
[0068] 7、以轉(zhuǎn)基因植株葉片的基因組DNA為模板，以野生型擬南芥基因組DNA為陰性對(duì) 照，以pBI121-35S-miR857重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以質(zhì)粒上35S啟動(dòng)子的5'端為上游引物， 以AtMIR857基因的3'端為下游引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。引 物如下：
[0069] F :5, -AGGCCATGGAGTCAAGATTCAAATAGAGG-3,；
[0070] R : 5 ' -GCGAATTCTCCGATTCCTACAATACACCTTC-3 '。
[0071] 此后，將T1代種子進(jìn)行篩選，獲得純合體植株。
[0072] 三、靶基因 AtLAC7轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的檢測(cè)。
[0073] 提取純合體植株的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以所獲得的cDNA為模板，采用 LAC7qPCR_F 和 LAC7qPCR_R 引物，通過(guò) Real-time PCR 檢測(cè) miR857 靶基因 AtLAC7 轉(zhuǎn)錄水平 表達(dá)量的變化。引物序列如下：
[0074] LAC7qPCR-F:5,-GCAATCCCGTAACACTTTGGCTGTCCC-3,；
[0075] LAC7qPCR-R: 5 ' -GCTATTATTGTTGTTTATGCATGAAAC-3 '。
[0076] 分析方法采用比較CT法，以Tubulin作為內(nèi)參基因，未經(jīng)處理的野生型樣品作為 對(duì)照。通過(guò)2- Λ Λ CT法計(jì)算AtLAC7基因表達(dá)量變化差異。各基因表達(dá)量用均值土標(biāo) 準(zhǔn)差表示。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中，靶基因 AtLAC7轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量與野生型相比下降了 40% (圖 3)。靶基因 AtLAC7 的 genbank 號(hào)為 AT3G09220?；?AtLAC7 是編碼 genbank 號(hào) 為NP_187533. 1的蛋白序列。
[0077] 實(shí)施例3 :轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量的測(cè)定。
[0078] 利用傅里葉紅外光譜測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株和野生型中木質(zhì)素的含量，取生長(zhǎng)6周的擬 南芥莖部組織，先用PBS洗滌3次，再用雙蒸水洗滌3次。置于BaF2晶片上，室溫干燥。采 用MAGNA750FTIR光譜儀進(jìn)行紅外光譜分析，并配備同一公司的顯微鏡，MCT檢測(cè)器，光譜分 辨率8CHT 1，掃描次數(shù)為128次，代表木質(zhì)素的吸收峰大約在1356CHT1處。通過(guò)統(tǒng)計(jì)1356CHT1 處的吸收光譜表明，轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素含量低于野生型，（圖4A為野生型植株的光譜圖， 圖4B是轉(zhuǎn)基因植株的光譜圖，而圖4C是轉(zhuǎn)基因植株的光譜圖與野生型光譜圖之間的差譜 圖，峰值在橫坐標(biāo)以下可以反映轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素含量低于野生型）。
[0079] 實(shí)施例4 :轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)化特性的測(cè)定。
[0080] 用電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)來(lái)測(cè)定生長(zhǎng)6周左右的擬南芥莖部的機(jī)械強(qiáng)度。用拉伸氣 動(dòng)夾具來(lái)測(cè)定其莖部的力學(xué)性能，測(cè)力計(jì)的基本參數(shù)為500N和5N。用掃描儀和統(tǒng)計(jì)分析軟 件得到莖部的平均直徑和高度。通過(guò)萬(wàn)分之一天平稱重得到莖部的平均鮮重。
[0081] 結(jié)果表明：與野生型相比，植株的高度變化不大，但轉(zhuǎn)基因植株莖干的機(jī)械強(qiáng)度顯 著降低，莖干的平均直徑和鮮重也有所減?。▓D5)。
[0082] 實(shí)施例5 :轉(zhuǎn)基因植株解剖結(jié)構(gòu)的觀察。
[0083] 鑒于轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)化的相關(guān)參數(shù)有所變化，我們通過(guò)進(jìn)行半薄切片對(duì)其解剖 結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，步驟如下：
[0084] 1、配制2. 5%戊二醛固定液（pH7. 0磷酸緩沖液），分別選取生長(zhǎng)6周的野生型和 過(guò)表達(dá)擬南芥相同部位的莖段和根段，投入固定液中，用真空泵抽氣，4°C放置過(guò)夜。
[0085] 2、在緩沖液中清洗 3 次，每次 lOmin，依次經(jīng)：30%、50%、60%、70%、80%、90%、 95 %、100 %、100 %系列乙醇脫水，每級(jí)20min。
[0086] 3、材料依次經(jīng)：無(wú)水乙醇：L. R. White樹(shù)脂比例為2:1、無(wú)水乙醇：L. R. White樹(shù)脂 比例為1:1和無(wú)水乙醇：L. R. White樹(shù)脂比例為1:2,每級(jí)3h。最后在純L. R. White樹(shù)脂中 滲透ld，期間更換1次。
[0087] 4、6〇°C 烘箱包埋 24h。
[0088] 5、取L. R. White包埋后的組織塊于超薄切片機(jī)上，切取厚度為1 μ m的半薄切片， 將其移到加水滴的載玻片上，然后于烘片機(jī)上加熱烘干。
[0089] 6、將1 %硼砂甲苯胺藍(lán)染液滴在切片上，約0.5min左右，用洗瓶沖洗切片上多余 的染液，濾紙吸干水分，自然干燥，即可鏡檢。
[0090] 結(jié)果顯示，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的厚壁組織細(xì)胞面積明顯減少（圖6A)，在 野生型中厚壁組織所占莖部橫切面總面積的 21. 3%，而轉(zhuǎn)基因植株中厚壁組織僅占莖部橫 切面總面積的13.9% (圖6B)。進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)部細(xì) 胞排列更為松散（圖6A)，次生木質(zhì)部細(xì)胞數(shù)目較少（圖6C)。
【權(quán)利要求】
1. 如下任一所述生物材料在降低植物木質(zhì)化程度中的應(yīng)用： (1) miR857 ； (2) miR857的編碼基因； (3) 表達(dá)miR857的重組載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述miR857的序列如SEQ ID No. 2所示； 所述miR857的編碼基因的序列如SEQ ID No. 1所示； 所述表達(dá)miR857的重組載體是將SEQ ID No. 1所示DNA插入植物表達(dá)載體的多克隆 位點(diǎn)得到的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述降低植物木質(zhì)化程度為降低植 物莖干的木質(zhì)化程度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述降低植物木質(zhì)化程度體現(xiàn)在 如下方面中的至少一種： (1) 降低木質(zhì)素含量； (2) 降低植物莖干的機(jī)械強(qiáng)度； (3) 降低植物莖干的直徑； (4) 降低植物莖干的鮮重； (5) 降低厚壁細(xì)胞占植物莖干橫切面的比例； (6) 降低植物單個(gè)維管束中木質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目； (7) 使植物木質(zhì)部細(xì)胞排列更加松散。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為草本植物或木本植物； 所述草本植物具體為擬南芥。
6. -種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：使受體植物中過(guò)表達(dá)miR857,得到木 質(zhì)化程度低于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述使受體植物中過(guò)表達(dá)miR857的方法 為：向受體植物中導(dǎo)入miR857的編碼基因。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述木質(zhì)化程度為植物莖干的木質(zhì) 化程度。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述木質(zhì)化程度體現(xiàn)在如下方面 中的至少一種： (1) 木質(zhì)素含量； (2) 植物莖干的機(jī)械強(qiáng)度； (3) 植物莖干的直徑； (4) 植物莖干的鮮重； (5) 厚壁細(xì)胞占植物莖干橫切面的比例； (6) 植物單個(gè)維管束中木質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目； (7) 植物木質(zhì)部細(xì)胞排列狀況。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物為草本植物或木本植 物；所述草本植物具體為擬南芥。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104232639SQ201410309033
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】林金星, 趙媛媛, 林森 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)