一種利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，在柳枝稷第4個(gè)節(jié)完全露出時(shí)，取柳枝稷幼穗作為誘導(dǎo)外植體；將外植體消毒后，在兩端各切下0.5cm，并縱向?qū)⑼庵搀w切為兩半，切面向下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；30～40天后獲得穗芽，對(duì)獲得的穗芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)，進(jìn)一步擴(kuò)大穗芽的數(shù)量；將繼代后的穗芽從芽塊分離成單個(gè)個(gè)體種植到培養(yǎng)基質(zhì)中，約7天后即可生根，發(fā)育成為新的植株，此時(shí)可將幼苗連同培養(yǎng)基質(zhì)栽植于溫室或大田。本發(fā)明中的無(wú)性繁殖方法，以柳枝稷幼穗為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)，能夠獲得大量基因型完全一致的后代。
【專利說(shuō)明】一種利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于柳枝稷組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種柳枝稷無(wú)性繁殖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]柳枝稷(英文名Switchgrass,拉丁名Panicum virgatum Linn)為禾本科黍?qū)俣嗄晟荼局参?，原生于北美地區(qū)，具有栽培簡(jiǎn)單、抗逆性強(qiáng)、生物學(xué)產(chǎn)量高等特點(diǎn)。20世紀(jì)80年代，柳枝稷被確定為模式生物能源植物，并于20世紀(jì)90年代被我國(guó)科研工作者引入國(guó)內(nèi)。在化石燃料日益緊缺的今天，人們對(duì)柳枝稷的研究愈加重視，近幾年來(lái)，國(guó)際上公開(kāi)發(fā)表的關(guān)于柳枝稷的科研論文每年都超過(guò)300篇。
[0003]柳枝稷為異花授粉植物，具有很強(qiáng)的自花不親和性，因此，有性繁殖獲得的后代個(gè)體基因型多數(shù)存在差異。與有性繁殖方式相比，無(wú)性繁殖是由植物營(yíng)養(yǎng)器官直接發(fā)育成新個(gè)體的過(guò)程，整個(gè)過(guò)程不涉及染色體的分離和重組，所產(chǎn)生的后代與親本具有完全一致的基因型，在柳枝稷優(yōu)良基因型保持及生物技術(shù)研究過(guò)程中具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種直接將柳枝稷幼穗誘導(dǎo)成穗芽的方法，該方法涉及植物器官逆向發(fā)育過(guò)程，為柳枝稷無(wú)性繁殖提供一條新的途徑。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0006]一種利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，包括以下操作:
[0007]1)待柳枝稷生長(zhǎng)發(fā)育至第4個(gè)節(jié)完全露出、幼穗已形成時(shí)，從靠近地面處將柳枝稷分蘗剪下，從下向上剝?nèi)チ︷⒎痔Y上的葉片至節(jié)間長(zhǎng)度小于Icm時(shí)停止，距該節(jié)間上端莖節(jié)上下各1.2~1.5cm切下，獲得包含幼穗的外植體；
[0008]2)將外植體消毒并用無(wú)菌水漂洗；
[0009]3)無(wú)菌環(huán)境下，將外植體兩端各切去0.2~0.5cm,將外植體縱向切為兩半，切口向下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；接種后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)30~40天至穗芽形成；
[0010]所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加6-BA、瓊脂粉和蔗糖；
[0011]4)將形成的穗芽沿基部2~3mm處切除，并再次接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，待新生芽生長(zhǎng)至1.2~1.5cm，重復(fù)繼代培養(yǎng)3~4次，獲得擴(kuò)繁后的穗芽；
[0012]5)在不損害生長(zhǎng)點(diǎn)的情況下，將穗芽從基部自芽塊上拆分下來(lái)，將穗芽單獨(dú)直接扦插到培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)7天后，待單獨(dú)的穗芽生根并發(fā)育成獨(dú)立的幼苗，將幼苗連同培養(yǎng)基質(zhì)栽植于溫室或大田。
[0013]所述的外植體中包含有2cm左右長(zhǎng)度的幼穗，具有正常花原基組織。
[0014]所述的外植體的消毒處理為:先用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒I~2min，然后用體積分?jǐn)?shù)5~8%的次氯酸鈉溶液消毒2~3min ；
[0015]消毒完成后并用滅菌水漂洗3次。
[0016]所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.43g/L，3mmol/L的6_BA、7.5g/L的瓊脂粉和30g/L的蔗糖。
[0017]所述在恒溫光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其培養(yǎng)溫度為20~25°C、每天光照20h、黑夜4h0
[0018]所述，在進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，采用上次培養(yǎng)的新生芽進(jìn)行接種，接種時(shí)新生芽的長(zhǎng)度為 1.0cm。
[0019]以體積比計(jì)，所述的培養(yǎng)基質(zhì)的組份為栽培土:腐葉土:河沙=I:3:1，栽植前一天在基質(zhì)中加水，直到吸水飽和。
[0020]所述的幼苗為相同基因型的幼苗。
[0021]本發(fā)明提出的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，是一種以柳枝稷幼穗為外植體進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，其基于高的可操作性和重復(fù)性的植物組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，再通過(guò)涉及植物器官發(fā)育調(diào)控的柳枝稷幼穗誘導(dǎo)穗芽培養(yǎng)，可以將正常條件下發(fā)育成花的花原基組織最終誘導(dǎo)成穗芽，以體外培養(yǎng)的方式最終誘導(dǎo)成穗芽(即由幼穗誘導(dǎo)形成的再生芽)，從而獲得基因型完全一致的后代。本發(fā)明所提出的柳枝稷幼穗誘導(dǎo)穗芽的過(guò)程，將正常條件下發(fā)育成花的花原基組織最終誘導(dǎo)成穗芽，通過(guò)該方法這種植物器官逆向發(fā)育現(xiàn)象可能為植物器官發(fā)育研究提供一條新的思路。
[0022]本發(fā)明提供的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，以柳枝稷幼穗為材料，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，最終可獲得較大規(guī)模的穗芽，并取得良好的繁殖效果；與已有的柳枝稷無(wú)性繁殖方法相比，本發(fā)明拓寬了柳枝稷無(wú)性繁殖材料范圍，為快速獲得大量基因型一致后代提供了新的方法。
[0023]本發(fā)明提供的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法誘導(dǎo)再生效率高，每個(gè)單獨(dú)的幼穗一次培養(yǎng)可以誘導(dǎo)出穗芽30個(gè)左右，經(jīng)繼代培養(yǎng)可誘導(dǎo)100個(gè)以上。對(duì)于分蘗數(shù)目本身較多的柳枝稷來(lái)講，單株增殖效率可以達(dá)到幾千倍。
[0024]本方法提供的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法所使用的外植體材料為柳枝稷幼穗，這在之前是未報(bào)道過(guò)的，拓寬了柳枝稷無(wú)性繁殖外植體材料的選擇范圍。
[0025]本方法提供的柳枝稷幼穗誘導(dǎo)穗芽方法與已有的柳枝稷組織培養(yǎng)途徑獲得再生芽方法相比，首次誘導(dǎo)所得基數(shù)更大，可以有效減少繼代次數(shù)，從而使再生芽誘導(dǎo)成本進(jìn)一步降低。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為柳枝稷幼穗誘導(dǎo)前的形態(tài)；
[0027]圖2為由柳枝稷幼穗誘導(dǎo)的穗芽；
[0028]圖3為栽植前的柳枝稷穗芽。

【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0030]本發(fā)明提供的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，通過(guò)對(duì)柳枝稷幼穗進(jìn)行體外誘導(dǎo)進(jìn)行無(wú)性繁殖，繁殖效果良好，具有材料新穎，增殖效率高，成本低等特點(diǎn)。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0031]參見(jiàn)圖1~圖3，一種利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，包括以下操作:
[0032]I)選擇適宜生長(zhǎng)期的誘導(dǎo)外植體材料
[0033]a.柳枝稷生長(zhǎng)發(fā)育至第4個(gè)節(jié)完全露出時(shí)取材為宜，此時(shí)幼穗已有2cm左右。
[0034]b.從靠近地面處將柳枝稷分蘗剪下，保證所需材料部位無(wú)損害。
[0035]c.從下向上剝?nèi)チ︷⒎痔Y上的葉片，在靠近頂端幼穗時(shí)，節(jié)間越來(lái)越短，當(dāng)發(fā)現(xiàn)節(jié)間長(zhǎng)度小于Icm時(shí)停止，距該節(jié)間上端莖節(jié)上下各1.2~1.5cm切下，即為誘導(dǎo)外植體(內(nèi)已含2cm左右長(zhǎng)度的幼穗，具有正常花原基組織)。
[0036]2)外植體消毒
[0037]a.將外植體置于滅菌空培養(yǎng)皿中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒Imin.
[0038]b.用體積分?jǐn)?shù)為8%的次氯酸鈉溶液(有效氯0.5% )消毒3min，期間輕輕搖動(dòng).
[0039]c.用滅菌水漂洗3次。
[0040]3)接種及誘導(dǎo)
[0041]a.用無(wú)菌鑷子和手術(shù)刀將兩端各切去0.5cm左右,然后將外植體縱向切為兩半，切口向下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
[0042]b.誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Murashige and Skoog Basal Medium,美國(guó)Sigma公司生產(chǎn))4.43g/L添加3mmol/L的6-BA (6-芐基腺嘌呤)、7.5g/L的瓊脂粉、30g/L的蔗糖。
[0043]c.接種后將培養(yǎng)皿置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為溫度25°C、每天光照20h、黑夜4h。30~40天后，穗芽逐漸形成。
[0044]4)繼代擴(kuò)大培養(yǎng)
[0045]a.將誘導(dǎo)出已生長(zhǎng)至0.5~1.5cm的穗芽沿基部2~3mm切除。
[0046]b.將處理后的穗芽再次接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
[0047]c.待新生芽生長(zhǎng)至1.2~1.5cm，重復(fù)切除培養(yǎng)3~4次，獲得大量的穗芽。
[0048]5)栽植
[0049]a.準(zhǔn)備培養(yǎng)基質(zhì)，以體積比計(jì)，具體成分為栽培土 2份，腐葉土 6份，河沙2份。
[0050]b.將穗芽塊分離成單獨(dú)的穗芽，直接扦插到預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基質(zhì)中。7天左右每一個(gè)單獨(dú)的穗芽均已生根，并將生長(zhǎng)發(fā)育成一棵獨(dú)立的幼苗。將幼苗連同培養(yǎng)基質(zhì)栽植于溫室或大田。
[0051]藉此，可以大規(guī)模培養(yǎng)獲得具有相同基因型的柳枝稷幼苗。
[0052]實(shí)施例:
[0053]柳枝稷栽培品種Alamo利用幼穗無(wú)性繁殖的方法，包括以下操作:
[0054]I)選擇適宜生長(zhǎng)期的誘導(dǎo)外植體材料
[0055]a.在溫室里選擇第4個(gè)節(jié)完全露出的Alamo分蘗，從靠近地面處剪下。
[0056]b.從下向上剝?nèi)チ︷⒎痔Y上的葉片，在靠近頂端幼穗時(shí)，節(jié)間越來(lái)越短，當(dāng)發(fā)現(xiàn)節(jié)間長(zhǎng)度小于Icm時(shí)停止，距該節(jié)間上端莖節(jié)上下各1.5cm切下，即為外植體(內(nèi)已含2cm左右長(zhǎng)度的幼穗，具有正?；ㄔM織)。
[0057]2)外植體消毒
[0058]a.將外植體置于滅菌空培養(yǎng)皿中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒Imin.
[0059]b.用8%的次氯酸鈉消毒3min，期間輕輕搖動(dòng).
[0060]c.用滅菌水漂洗3次。
[0061]3)接種及誘導(dǎo)
[0062]a.用無(wú)菌鑷子和手術(shù)刀將兩端各切去0.5cm左右，然后在中心位置將外植體縱向切為兩半，切口向下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
[0063]b.誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Murashige and Skoog Basal Medium,美國(guó)Sigma公司生產(chǎn))4.43g/L添加3mmol/L的6_BA、7.5g/L的瓊脂粉、30g/L的鹿糖。
[0064]c.接種后將培養(yǎng)皿置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為溫度25°C，每天光照20h、黑夜4h。30~40天后，穗芽逐漸形成。
[0065]4)繼代擴(kuò)大培養(yǎng)
[0066]a.將誘導(dǎo)出已生長(zhǎng)至0.5~1.5cm的穗芽沿基部2~3mm切除。
[0067]b.將處理后的穗芽再次接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
[0068]c.重復(fù)切除培養(yǎng)3~4次，獲得大量的穗芽。
[0069]5)栽植
[0070]a.準(zhǔn)備培養(yǎng)基質(zhì)，具體成分為栽培土 2份，腐葉土 6份，河沙2份。
[0071]b.將穗芽塊分離成單獨(dú)的穗芽，直接扦插到預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基質(zhì)中。7天左右每一個(gè)單獨(dú)的穗芽均已生根，并將生長(zhǎng)發(fā)育成一棵棵獨(dú)立的幼苗。將每棵幼苗連同培養(yǎng)基質(zhì)栽植于溫室或大田。
【權(quán)利要求】
1.一種利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，其特征在于，包括以下操作: 1)待柳枝稷生長(zhǎng)發(fā)育至第4個(gè)節(jié)完全露出、幼穗已形成時(shí)，從靠近地面處將柳枝稷分蘗剪下，從下向上剝?nèi)チ︷⒎痔Y上的葉片至節(jié)間長(zhǎng)度小于Icm時(shí)停止，距該節(jié)間上端莖節(jié)上下各1.2~1.5cm切下，獲得包含幼穗的外植體； 2)將外植體消毒并用無(wú)菌水漂洗； 3)無(wú)菌環(huán)境下，將外植體兩端各切去0.2~0.5cm,將外植體縱向切為兩半,切口向下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；接種后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)30~40天至穗芽形成； 所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加6-BA、瓊脂粉和蔗糖； 4)將形成的穗芽沿基部2~3_處切除，并再次接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，待新生芽生長(zhǎng)至1.2~1.5cm，重復(fù)繼代培養(yǎng)3~4次，獲得擴(kuò)繁后的穗芽； 5)在不損害生長(zhǎng)點(diǎn)的情況下，將穗芽從基部自芽塊上拆分下來(lái)，將穗芽單獨(dú)直接扦插到培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)7天后，待單獨(dú)的穗芽生根并發(fā)育成獨(dú)立的幼苗，將幼苗連同培養(yǎng)基質(zhì)栽植于溫室或大田。
2.如權(quán)利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，其特征在于，所述的外植體中包含有2cm左右長(zhǎng)度的幼穗，具有正常花原基組織。
3.如權(quán)利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，其特征在于，所述的外植體的消毒處理為:先 用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒I~2min，然后用體積分?jǐn)?shù)5~8%的次氯酸鈉溶液消毒2~3min ； 消毒完成后并用滅菌水漂洗3次。
4.如權(quán)利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.43g/L，3mmol/L的6_BA、7.5g/L的瓊脂粉和30g/L的蔗糖。
5.如權(quán)利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，其特征在于，所述在恒溫光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其培養(yǎng)溫度為20~25°C、每天光照20h、黑夜4h。
6.如權(quán)利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，其特征在于，在進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，采用上次培養(yǎng)的新生芽進(jìn)行接種，接種時(shí)新生芽的長(zhǎng)度為1.0cm0
7.如權(quán)利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，其特征在于，以體積比計(jì)，所述的培養(yǎng)基質(zhì)的組份為栽培土:腐葉土:河沙=I:3:1，栽植如一天在基質(zhì)中加水，直到吸水飽和。
8.如權(quán)利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法，其特征在于，所述的幼苗為相同基因型的幼苗。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104067934SQ201410249960
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】奚亞軍, 王勇鋒, 李毛 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)