微生物菌劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種微生物菌劑及其制備方法與應(yīng)用。該微生物菌劑由微黃白鏈霉菌SY-FX-14得到；所述的微黃白鏈霉菌（Streptomyces?albidoflavus）SY-FX-14，保藏日期為2013年12月25日，保藏編號為CGMCC?No.8613。本發(fā)明將首次從牛糞土中分離得到微黃白鏈霉菌SY-FX-14作為活性成分制備微生物菌劑，實驗結(jié)果表明，微黃白鏈霉菌（Streptomyces?albidoflavus）SY-FX-14對白香瓜瓜腐、辣椒枯萎、番茄早疫、黃瓜炭疽、棉花黃萎、黃瓜灰霉、水稻惡苗、番茄青枯、水稻紋枯、煙草黑脛、小麥根腐、水稻稻瘟、小麥赤霉、油菜菌核、大豆根腐、番茄灰霉、黃瓜褐斑、黃瓜霜霉病原菌均具有明顯的抑制生長作用。該微生物菌劑制備工藝簡單、發(fā)酵周期短、并能夠快速在土壤和植物體定殖，具有較好的應(yīng)用前景。
【專利說明】微生物菌劑及其制備方法與應(yīng)用
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種微生物菌劑及其制備方法與應(yīng)用。【【背景技術(shù)】】
[0002]微生物農(nóng)藥由于其綠色環(huán)保，不易產(chǎn)生抗藥性的特性，在防治作物病蟲害方面得到越來越廣泛的重視和應(yīng)用。微生物農(nóng)藥的推廣和應(yīng)用技術(shù)正逐漸趨于成熟，國家在生物防治領(lǐng)域的政策支持力度逐年加大，微生物農(nóng)藥的使用能克服化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的污染并減少在農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥的殘留，提升農(nóng)副產(chǎn)品的品質(zhì)和價格，既具有環(huán)境效益又具有經(jīng)濟效益。
[0003]目前，市場上推廣的主要微生物農(nóng)藥品種集中在芽孢桿菌屬和假單胞菌屬。鏈霉菌屬是一類能產(chǎn)生抗生素的微生物菌屬，作為農(nóng)用殺真菌類在美國和歐洲登記的種為Streptomyces griseoviridis和Streptomyces Iydicus,鏈霉菌屬有望成為繼芽抱桿菌屬和假單胞菌屬后另一類在生物防治領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的微生物農(nóng)藥。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004]本發(fā)明的首要目的在于提供一種微生物菌劑。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供所述的微生物菌劑的制備方法。
[0006]本發(fā)明的再一目的在于提供所述的微生物菌劑的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):一種微生物菌劑，由微黃白鏈霉菌SY-FX-14得到；所述的微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14,保藏日期為2013年12月25日，保藏編號為CGMCC N0.8613，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);保藏單位地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號(100101)。
[0008]所述的微黃白鏈霉菌SY-FX-14，分離自遼寧鐵嶺地區(qū)牛糞土，其具有以下生物學(xué)特性:(I)在保藏培養(yǎng)基生長，菌絲乳黃色，隨著培養(yǎng)時間延長，菌絲顏色加深變灰；(2)在種子培養(yǎng)基生長，菌絲乳白色，菌落與培養(yǎng)基結(jié)合處出現(xiàn)茶色色素；(3)在發(fā)酵培養(yǎng)基生長菌絲淺灰色，后逐漸變?yōu)橥咙S色，在液體培養(yǎng)中后期呈較大的淺黃色菌絲團。
[0009]所述的微黃白鏈霉菌SY-FX-14采用以下方法進行培養(yǎng):將微黃白鏈霉菌置于保藏培養(yǎng)基中，于25-33°C活化12-24h后置于種子培養(yǎng)基中，于25-33°C、100-150r/min培養(yǎng)1-2天，得到種子液；將所述種子液以體積比4-8%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25-33°C、100-150r/min振蕩培養(yǎng)2_4天，得到微黃白鏈霉菌SY-FX-14。
[0010]所述的保藏培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，水 1L, ρΗ7.4-7.6。
[0011]所述的種子培養(yǎng)基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g, K2HPO4Ig,水 1L。
[0012]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉20g,鹿糖10g,蛋白胨2g,淀粉5g,酵母膏2g,NaC12g,K2HPO40.5g, MgSO40.5g, CaCO3Ig,水 1L。
[0013]所述的微生物菌劑通過如下方法制備得到:將微黃白鏈霉菌置于保藏培養(yǎng)基中，于25-33°C活化12-24h后置于種子培養(yǎng)基中，于25_33°C、100_150r/min培養(yǎng)1_2天，得到種子液；將所述種子液以體積比4-8%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25-33°C、100-150r/min振蕩培養(yǎng)2-4天，得到微黃白鏈霉菌SY-FX-14 ;將得到的微黃白鏈霉菌SY-FX-14與基質(zhì)混合，得到微生物菌劑。
[0014]所述的保藏培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，水 1L, ρΗ7.4-7.6。
[0015]所述的種子培養(yǎng)基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g, K2HPO4Ig,水 1L。
[0016]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉20g,鹿糖IOg,蛋白胨2g,淀粉5g,酵母膏2g,NaC12g,K2HPO40.5g, MgSO40.5g, CaCO3Ig,水 1L。
[0017]所述的基質(zhì)為草炭土、膨潤土或微粉碳酸鈣。
[0018]所述的微生物菌劑的有效活菌數(shù)可為5*109cfu/g，pH值為6.0-8.0。 [0019]所述的微生物菌劑具有廣譜殺菌活性，可用于防治植物病害；
[0020]所述的植物病害為白香瓜瓜腐(Choanephora cucurhtarum)、辣椒枯萎(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum(Atk.)Synder et Hansen)、番爺早疫(AlternariasoIan1.)、黃瓜炭疽(Colletotrichum orbiculare)、棉花黃萎(Verticilliumdahliae)、黃瓜灰霉(bocrytis Cinerea Pers.)、7_K 稻惡苗(Fusarium moniIiformeSheld.)、番爺青枯(Pseudomanas solanacearumSmith)、7_K 稻紋枯(Thanatephoruscucumeris (Frank) Donk)、煙草黑胚(Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker)、小麥根腐(Cochliobolus sat1-vu (Ito et Kurib.)Drechsl.)、水稻稻痕(hyriculariagrisea (Cooke) Sacc.)、小麥赤霉(Fusarium graminearum Schw.)、油菜菌核(SclerotiniascIerotiorumCLib.)de Bary)、大豆根腐(Fusarium orthoceras Appel.Et Wollenweber)、番爺灰霉(Botrytis cinerea)、黃瓜褐斑(Corynespora cassiicola)和黃瓜霜霉(Pseudoperonospora cubensis (Berk.Et Curt.) Rostov)中的至少一種。
[0021]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及有益效果:
[0022]本發(fā)明將首次從牛糞土中分離得到微黃白鏈霉菌SY-FX-14作為活性成分制備微生物菌劑，實驗結(jié)果表明，微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus)SY-FX_14對白香瓜瓜腐、辣椒枯萎、番茄早疫、黃瓜炭疽、棉花黃萎、黃瓜灰霉、水稻惡苗、番茄青枯、水稻紋枯、煙草黑脛、小麥根腐、水稻稻瘟、小麥赤霉、油菜菌核、大豆根腐、番茄灰霉、黃瓜褐斑、黃瓜霜霉病原菌均具有明顯的抑制生長作用。該微生物菌劑制備工藝簡單、發(fā)酵周期短、并能夠快速在土壤和植物體定殖，具有較好的應(yīng)用前景。
【【具體實施方式】】
[0023]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0024]實施例1
[0025]微黃白鏈霉菌(Streptomycesalbidoflavus) SY-FX-14 的分離和鑒定:[0026](I)微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14 的分離
[0027]從遼寧鐵嶺地區(qū)牛糞土采集土壤10g，加入內(nèi)裝IOOmL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，于120r/min搖床上振蕩30min，振蕩結(jié)束后靜置lh，取上清0.5mL加入4.5mL無菌水中，渦旋混合，依次稀釋10_2、10_3、10_4倍，分別取150 μ L稀釋液涂布于高氏一號培養(yǎng)基平板上，每個梯度涂布3個平行，在28°C培養(yǎng)3d，挑取培養(yǎng)基上的單菌落進行平板劃線純化，獲得微黃白鏈霉菌菌株。
[0028](2)微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14 的鑒定
[0029]16S rRNA基因序列測序結(jié)果表明SY-FX-14菌株的16S rRNA基因序列為序列表I中核苷酸序列。根據(jù)測序結(jié)果與Genbank中鏈霉菌16S rRNA基因序列進行同源性比較，結(jié)果表明SY-FX-14菌屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)中的微黃白鏈霉菌(Streptomycesalbidoflavus)。
[0030]實施例2
[0031]含有微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14活性成分菌劑的制備:
[0032](I)培養(yǎng)基的配制 [0033]保藏培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，F(xiàn)eSO4.7H200.01g, MgSO4.7H200.5g，水 1L，pH7.4-7.6 ；
[0034]種子培養(yǎng)基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g，K2HPO4Ig,水 IL ；
[0035]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉20g,鹿糖IOg,蛋白胨2g,淀粉5g,酵母膏2g, NaC12g,K2HPO40.5g, MgSO40.5g, CaCO3Ig,水 1L。
[0036]將上述培養(yǎng)基于121 °C高壓蒸汽滅菌20min，待用。
[0037](2)菌種活化
[0038]將微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14轉(zhuǎn)接種子斜面培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 °C培養(yǎng)24h。
[0039](3)種子培養(yǎng)
[0040]選擇生長良好的活化斜面菌種接種于裝有步驟(1)中制得的種子培養(yǎng)基三角瓶(250mL三角瓶內(nèi)裝IOOmL培養(yǎng)基)中，于28°C、120r/min振蕩培養(yǎng)48h。
[0041](4)發(fā)酵培養(yǎng)
[0042]將步驟(1)的發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，在121°C條件下滅菌20min，滅菌完成后待冷卻至室溫時接入4%預(yù)先活化好的種子菌液。此時控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為120r/min，通氣量為1:1-1:1.2，溫度為28°C，培養(yǎng)72h，培養(yǎng)過程中自動添加0.05%有機硅油消泡劑。將發(fā)酵液用草炭吸附成可濕性粉劑菌劑。通過顯微觀察，平板計數(shù)檢測菌劑中的有效活菌數(shù)為5*109cfu/g ;測定 pH 值為 7.1。
[0043]實施例3
[0044]含有微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14活性成分菌劑的制備:
[0045](I)培養(yǎng)基的配制
[0046]保藏培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，F(xiàn)eSO4.7H200.01g, MgSO4.7H200.5g，水 1L，pH7.4-7.6 ；
[0047] 種子培養(yǎng)基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g，K2HPO4Ig,水 IL ；
[0048]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉20g，蔗糖10g，蛋白胨2g，淀粉5g，酵母膏2g，NaC12g,K2HPO40.5g, MgSO40.5g, CaCO3Ig,水 1L。
[0049]將上述培養(yǎng)基于121 °C高壓蒸汽滅菌20min，待用。
[0050](2)菌種活化
[0051]將微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14轉(zhuǎn)接種子斜面培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中，25°C培養(yǎng)18h。
[0052](3)種子培養(yǎng)
[0053]選擇生長良好的活化斜面菌種接種于裝有步驟(1)中制得的種子培養(yǎng)基三角瓶(250mL三角瓶內(nèi)裝IOOmL培養(yǎng)基)中，于25°C、130r/min振蕩培養(yǎng)48h。
[0054](4)發(fā)酵培養(yǎng)
[0055]將步驟(1)的發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，在121°C條件下滅菌20min，滅菌完成后待冷卻至室溫時接入6%預(yù)先活化好的種子菌液。此時控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為130r/min，通氣量為1:1-1:1.2，溫度為25°C，培養(yǎng)96h，培養(yǎng)過程中自動添加0.05%有機硅油消泡劑。將發(fā)酵液用草炭吸附成可濕性粉劑菌劑。通過顯微觀察，平板計數(shù)檢測菌劑中的有效活菌數(shù)為5*109cfu/g ;測定 pH 值為 7.1。
[0056]實施例4
[0057]含有微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14活性成分菌劑的制備:
[0058](I)培養(yǎng)基的配制
[0059]保藏培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，F(xiàn)eSO4.7H200.01g, MgSO4.7H200.5g，水 1L，pH7.4-7.6 ；
[0060]種子培養(yǎng)基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g，K2HPO4Ig,水 IL ；
[0061]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉20g,鹿糖IOg,蛋白胨2g,淀粉5g,酵母膏2g, NaCl 2g,K2HPO40.5g, MgSO40.5g, CaCO3Ig,水 1L。
[0062]將上述培養(yǎng)基于121 °C高壓蒸汽滅菌20min，待用。
[0063](2)菌種活化
[0064]將微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14轉(zhuǎn)接種子斜面培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中，33°C培養(yǎng)12h。
[0065](3)種子培養(yǎng)
[0066]選擇生長良好的活化斜面菌種接種于裝有步驟(1)中制得的種子培養(yǎng)基三角瓶(250mL三角瓶內(nèi)裝IOOmL培養(yǎng)基)中，于33°C、110r/min振蕩培養(yǎng)36h。
[0067](4)發(fā)酵培養(yǎng)
[0068]將步驟(1)的發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，在121°C條件下滅菌20min，滅菌完成后待冷卻至室溫時接入8%預(yù)先活化好的種子菌液。此時控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為llOr/min，通氣量為1:1-1:1.2，溫度為33°C，培養(yǎng)48h，培養(yǎng)過程中自動添加0.05%有機硅油消泡劑。將發(fā)酵液用草炭吸附成可濕性粉劑菌劑。通過顯微觀察，平板計數(shù)檢測菌劑中的有效活菌數(shù)為5*109cfu/g ;測定 pH 值為 7.1。
[0069]實施例5
[0070]微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus)SY-FX_14菌劑對病原真菌的抑菌活性的檢測:
[0071]采用平板對峙生長法，微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14菌劑用無菌水充分溶解后，使菌體濃度達到108-109CFU/mL，在平板直徑兩端距離平板邊緣1.0-1.5cm處點接于PDA培養(yǎng)基上。供試真菌在PDA平板活化培養(yǎng)形成菌落，用打孔器(5mm)制取菌餅，將菌絲面朝下接菌于PDA平板中央。將接種好的平板置于28°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14與病原菌間形成明顯的抑菌帶。拮抗作用強弱以“ + ”，表示。“+++”:拮抗活性很強，抑菌帶寬度大于8.0mm ;“++”:拮抗活性中等強度，抑菌帶寬度在3.0mm和8.0mm之間；“ + ”:拮抗活性弱或無活性，抑菌帶寬度小于3.0mm或者無抑菌帶,病菌正常生長，而且可覆蓋微黃白鏈霉菌(Streptomycesalbidoflavus) SY-FX-14?
[0072]微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus)SY-FX_14菌劑對供試病原真菌的抑制作用結(jié)果如表1所示。 [0073]表1微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus)SY_FX_14菌劑對供試病原真菌
的抑制作用
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種微生物菌劑，其特征在于，由微黃白鏈霉菌SY-FX-14得到；所述的微黃白鏈霉菌(Streptomyces albidof lavus) SY-FX-14,保藏日期為 2013 年 12 月 25 日，保藏編號為CGMCC N0.8613。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物菌劑，其特征在于，所述的微黃白鏈霉菌SY-FX-14采用以下方法進行培養(yǎng):將微黃白鏈霉菌置于保藏培養(yǎng)基中，于25-33°C活化12-24h后置于種子培養(yǎng)基中，于25-33°C、100-150r/min培養(yǎng)1_2天，得到種子液；將所述種子液以體積比4-8%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25-33°C、100-150r/min振蕩培養(yǎng)2_4天，得到微黃白鏈霉菌SY-FX-H0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于，所述的保藏培養(yǎng)基的成分如下:可溶性淀粉 20g, KNO3Ig, NaCl0.5g, K2HPO4.3Η200.5g, FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，水1L, ρΗ7.4-7.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基的成分如下:鹿糖 30g，蛋白胨 5g，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g，K2HPO4Ig,水 IL0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分如下:玉米粉 20g，蔗糖 10g，蛋白胨 2g，淀粉 5g，酵母膏 2g，NaC12g，K2HPO40.5g,MgSO40.5g, CaCO3Ig,水1L。
6.權(quán)利要求1所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于，所述的微生物菌劑通過如下方法制備得到:將微黃白鏈霉菌置于保藏培養(yǎng)基中，于25-33°C活化12-24h后置于種子培養(yǎng)基中，于25-33°C、100-150r/min培養(yǎng)1_2天，得到種子液；將所述種子液以體積比4-8%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 于25-33°C、100-150r/min振蕩培養(yǎng)2_4天，得到微黃白鏈霉菌SY-FX-14 ;將得到的微黃白鏈霉菌SY-FX-14與基質(zhì)混合，得到微生物菌劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于，所述的基質(zhì)為草炭土、膨潤土或微粉碳酸鈣。
8.權(quán)利要求1所述的微生物菌劑應(yīng)用于防治植物病害。
9.權(quán)利要求1所述的微生物菌劑的有效活菌數(shù)為5*109cfu/g，pH值為6.0-8.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物菌劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物病害為白香瓜瓜腐、辣椒枯萎、番茄早疫、黃瓜炭疽、棉花黃萎、黃瓜灰霉、水稻惡苗、番茄青枯、水稻紋枯、煙草黑脛、小麥根腐、水稻稻瘟、小麥赤霉、油菜菌核、大豆根腐、番茄灰霉、黃瓜褐斑和黃瓜霜霉中的至少一種。
【文檔編號】A01P1/00GK103981126SQ201410152644
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】胥維昌, 李秀穎, 戴速航, 孫慧, 王宇, 李旭 申請人:中國中化股份有限公司, 沈陽化工研究院有限公司