一種以花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物快速繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，旨在提供一種以花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法。該種方法包括步驟：材料采取、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配置、外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo)、小植株再生、小植株的繼代培養(yǎng)、小植株的出瓶種植。本發(fā)明突出具有污染率低、愈傷誘導(dǎo)率高、愈傷團(tuán)塊大、愈傷胚性好、再生能力強(qiáng)、增殖率高的特點(diǎn)，特別對于本發(fā)明以花梗為外植體，污染率可降低為0，可獲得高達(dá)100%的愈傷誘導(dǎo)率，愈傷團(tuán)塊再生率達(dá)100%，胚性高，每段1cm花梗外植體可獲得60-80株小植株。
【專利說明】一種以花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于植物快速繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種以花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]百合胚性愈傷組織再生體系相比其他再生體系如芽再生體系，具有最高的增殖率和擴(kuò)繁率，對優(yōu)良種質(zhì)的保存有重要意義。此外，百合胚性愈傷組織再生體系也是百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的決定性基礎(chǔ)，進(jìn)而影響百合的基因工程改良。
[0003]目前建立百合愈傷再生體系多以田間鱗莖的鱗片為外植體，其缺陷是鱗莖由于長期處于土壤環(huán)境中，攜帶病菌多，使組織培養(yǎng)消毒要求嚴(yán)格，污染率較高。此外，當(dāng)需要建立野生百合種質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室離體體系時，以鱗莖為外植體，只能采用花期后挖取種球，其突出的不足有二:首先，野生百合位置的確定和種類的辨認(rèn)很大程度是依靠醒目的花器官及其特征，花期后野生百合地上部分已全部或部分枯萎，尤其是花器官的衰敗和花被片脫落使其種類難以辨認(rèn)，易造成種質(zhì)資源的混淆；其次，挖取種球等同于對野生資源完全的采集，對于珍稀瀕危種類更是難以回復(fù)的破壞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種污染率低、愈傷誘導(dǎo)率高、愈傷團(tuán)塊大、愈傷胚性好、再生能力強(qiáng)、增殖率高，且對種質(zhì)資源的破壞小的建立百合胚性愈傷再生體系的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0005]提供一種以花梗為`外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一:材料采取:
[0007]在百合花期，取百合長0.5~2.0cm的(幼嫩)花蕾，花蕾帶長I~1.5cm的花梗，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏I周后，再進(jìn)行后續(xù)操作；
[0008]步驟二:愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配置:
[0009]愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即采用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還含有 30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~1.5mg/L 的 2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2, 4-D),愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8 ；
[0010]將配置好的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進(jìn)行分裝，即將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液倒入(玻璃或塑料)培養(yǎng)皿中，待愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液凝固成愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿包裹好，放在無菌潔凈環(huán)境(如組培室)下存放；
[0011]步驟三:外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo):
[0012]將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5~30min，再在流水下沖洗0.5~2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進(jìn)行消毒接種；
[0013]消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v的次氯酸鈉溶液，將清洗干凈的花蕾進(jìn)行表面消毒8~15min，然后用無菌水沖洗3遍；
[0014]消毒后進(jìn)行接種:用鑷子和解剖刀將花蕾上的花梗切下，將長Icm的花梗接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，花梗需先切掉其端部褐化部分產(chǎn)生新鮮切口，然后用解剖刀在其表面處理出劃痕、切口或創(chuàng)傷后接種，并使創(chuàng)傷面接觸培養(yǎng)基表面；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、黑暗條件下培養(yǎng)8~40天，完成愈傷組織的誘導(dǎo)，出現(xiàn)愈傷組織團(tuán)塊；
[0015]步驟四:小植株再生:
[0016]外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)40~70天后，開始分化再生出小植株，然后將外植體轉(zhuǎn)接到新鮮的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在照度為18001ux、12h光照/12h黑暗的光照條件下，培養(yǎng)90~120天后，在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團(tuán)塊上分離下來，轉(zhuǎn)入繼代培
養(yǎng)基培養(yǎng);
[0017]小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后(平均直徑達(dá)到Icm以上)，可進(jìn)行步驟六中的出瓶種植，或者不出瓶，進(jìn)行步驟五中的繼代以維持百合離體鱗莖再生體系，再進(jìn)行步驟六中的出瓶種植；
[0018]所述繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基中添加有4 .43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊月旨、O ~0.2mg/L6-節(jié)氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)，繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8 ; ( α-萘乙酸不是必需的，但一定濃度的萘乙酸將有利于小植株根系生長，6-芐氨基腺嘌呤不是必需的，但一定濃度的6-芐氨基腺嘌呤將有利于小植株增殖)
[0019]步驟五:小植株的繼代培養(yǎng):
[0020]步驟四中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后(平均直徑達(dá)到Icm以上)，不出瓶，進(jìn)行繼代的方法是:小植株在繼代培養(yǎng)基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉(zhuǎn)綠后，進(jìn)行小植株的轉(zhuǎn)接；轉(zhuǎn)接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉(zhuǎn)接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上，繼續(xù)步驟四的培養(yǎng)；
[0021]步驟六:小植株的出瓶種植:
[0022]出瓶前進(jìn)行低溫鍛煉，將組培容器中的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)的小植株，在I~5攝氏度、黑暗條件下進(jìn)行30~50天的低溫處理；低溫處理后，將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15~30min,然后種入育苗專用介質(zhì)(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗專用介質(zhì)中的深度在I~2cm范圍內(nèi)，即小鱗莖頂端距土表一球高左右，進(jìn)行栽培管理，即完成百合胚性愈傷再生體系的建立。
[0023]本發(fā)明步驟三中，誘導(dǎo)獲得的愈傷組織團(tuán)塊切下或用鑷子夾下來，作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的受體，經(jīng)農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)染或基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，經(jīng)過篩選和鑒定，并在再生培養(yǎng)基上分化生根、煉苗、移栽獲得百合的轉(zhuǎn)基因植株；
[0024]再生培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升再生培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，再生培養(yǎng)基中還含有30~60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊脂、O~
2.0mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),再生培養(yǎng)基的 pH 值為 5.8 ~6.0。
[0025]本發(fā)明提供的上述方法可以用于百合愈傷組織再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系中，具體為:對上述方法獲得的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)后分切成小塊，接種到相應(yīng)繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；用該愈傷組織在再生培養(yǎng)基上分化生根，煉苗、移栽即可獲得百合的組織培養(yǎng)植株；或?qū)⒃撚鷤M織作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的受體，在再生培養(yǎng)基上分化生根，煉苗、移栽即可獲得百合的轉(zhuǎn)基因植株。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0027]本發(fā)明以百合花梗為外植體，具有污染率低、材料易得的特點(diǎn)，其突出的優(yōu)勢在于體系高效率、外植體幼嫩、少病毒。對于野生百合的種質(zhì)資源保存來說，在百合花期取得適量花梗用于建立實(shí)驗(yàn)室愈傷再生體系，而不是花期后挖取種球，以花梗特點(diǎn)更容易確認(rèn)野生百合的種類，并極大地減少了對野生種質(zhì)資源的破壞。本發(fā)明還突出具有污染率低、愈傷誘導(dǎo)率高、愈傷團(tuán)塊大、愈傷胚性好、再生能力強(qiáng)、增殖率高的特點(diǎn)，特別對于本發(fā)明以花梗為外植體,污染率可降低為0，可獲得高達(dá)100%的愈傷誘導(dǎo)率，愈傷團(tuán)塊再生率達(dá)100%，胚性高，每段Icm花梗外植體可獲得60-80株小植株。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:
[0029]一種以花梗為外植體 建立百合胚性愈傷再生體系的方法，包括以下步驟:
[0030]步驟一:材料采取:
[0031]在百合花期，取百合長0.5~2.0cm的幼嫩花蕾，花蕾帶長I~1.5cm的花梗，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏I周后，再進(jìn)行后續(xù)操作。
[0032]步驟二:愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配置:
[0033]愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即采用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還含有 30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~1.5mg/L 的 2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2, 4-D);愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8。
[0034]將配置好的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進(jìn)行分裝，即將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液倒入玻璃或塑料的培養(yǎng)皿中，待愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液凝固成愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿包裹好，放在組培室或其他無菌潔凈環(huán)境下存放。
[0035]步驟三:外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo):
[0036]將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5~30min，再在流水下沖洗0.5~2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進(jìn)行消毒接種；
[0037]消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v的次氯酸鈉溶液，將清洗干凈的花蕾進(jìn)行表面消毒8~15min，然后用無菌水沖洗3遍；
[0038]消毒后進(jìn)行接種:用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將長Icm的花梗接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，花梗需先切掉其端部褐化部分產(chǎn)生新鮮切口，然后用解剖刀在其表面處理出劃痕、切口或創(chuàng)傷后接種，并使創(chuàng)傷面接觸培養(yǎng)基表面；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、黑暗條件下培養(yǎng)8~40天，完成愈傷組織的誘導(dǎo)，出現(xiàn)愈傷組織團(tuán)塊。
[0039]步驟四:小植株再生:
[0040]外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長40~70天后，開始分化再生出小植株，轉(zhuǎn)接到新鮮的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在照度為18001ux、12h光照/12h黑暗的光照條件下，培養(yǎng)90~120天后，在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團(tuán)塊上分離下來，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基；
[0041 ] 小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后，平均直徑達(dá)到Icm以上，可進(jìn)行步驟六中的出瓶種植，或者不出瓶，進(jìn)行步驟五中的繼代以維持百合離體鱗莖再生體系，再進(jìn)行步驟六中的出瓶種植。
[0042]所述繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基中添加有4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊月旨、O ~0.2mg/L6-節(jié)氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)，繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8。其中，α-萘乙酸不是必需的，但一定濃度的萘乙酸將有利于小植株根系生長，6-芐氨基腺嘌呤不是必需的，但一定濃度的6-芐氨基腺嘌呤將有利于小植株增殖。
[0043]步驟五:小植株的繼代培養(yǎng):
[0044]步驟四中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后，不出瓶，進(jìn)行繼代的方法是:小植株在繼代培養(yǎng)基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉(zhuǎn)綠后，進(jìn)行小植株的轉(zhuǎn)接；轉(zhuǎn)接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉(zhuǎn)接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上，繼續(xù)步驟四的培養(yǎng)；繼代頻率以每4~8周繼代一次為宜。
[0045]步驟六:小植株的出瓶種植:
[0046]出瓶前進(jìn)行低溫鍛煉，將組培容器中的小植株在I~5攝氏度、黑暗條件下進(jìn)行30~50天的低溫處理；低溫處理后，將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15~30min，然后種入育苗專用介質(zhì)(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質(zhì)中的深度在I~2cm范圍內(nèi)，即小鱗莖頂端距土表一球高左右，進(jìn)行栽培管理，即完成百合胚性愈傷再生體系的建立。
[0047]下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)的專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0048]實(shí)施例1以東方百合‘索邦’花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0049](I)花蕾期取1.5cm長的百合幼嫩花荀,帶長Icm的花梗,在封口袋中冷藏于4攝氏度冰箱中，冷藏一周后取出進(jìn)行處理。
[0050](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡5min，在流水下沖洗75min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v次氯酸鈉溶液，進(jìn)行表面消毒8min，然后用無菌水沖洗3遍。切取Icm長的花梗，切掉其端部褐化部分產(chǎn)生新鮮切口，解剖刀在其表面劃痕、切口或創(chuàng)傷后接種，并使創(chuàng)傷面盡量接觸愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面。將接種了外植體的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基在25攝氏度、完全黑暗條件下培養(yǎng)24天，開始出現(xiàn)愈傷組織，污染率為O，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)96%。
[0051]愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，SP采用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、1.5mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液的pH值為
5.8。
[0052]愈傷團(tuán)塊若在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)130天后直徑最大可達(dá)5.83mm。其中，愈傷團(tuán)塊大小以游標(biāo)卡尺測量，由于愈傷團(tuán)塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團(tuán)塊大小衡量標(biāo)準(zhǔn)，并伴隨著小植株的分化。
[0053](3)外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長70天后，開始分化出小植株，分化率100%。將花梗連同愈傷組織團(tuán)塊、小植株一起在超凈工作臺上轉(zhuǎn)接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在照度為18001ux、12h光照/12h黑暗的光照條件下培養(yǎng)105天，繼續(xù)分化出大量小植株，平均每塊外植體可分化出80棵小植株，將小植株從外植體上分切下來，轉(zhuǎn)接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上。
[0054]繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、8g/L瓊脂，繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0055](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周，鱗莖平均直徑在1.34cm，達(dá)到Icm以上，小植株直接進(jìn)行出瓶種植。將繼代培養(yǎng)基上的小植株置于5攝氏度黑暗條件下進(jìn)行低溫處理40天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈`1000倍溶液中浸泡消毒15min，然后種入育苗專用介質(zhì)(Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質(zhì)中的深度在1.5cm,進(jìn)行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達(dá)到1:80，即平均每塊外植體最終產(chǎn)生80棵小植株。
[0056]實(shí)施例2以東方百合‘索邦’花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0057](I)花蕾期取0.5 cm長的百合幼嫩花荀,帶1.2 cm長度的花梗,封在口袋中冷藏于4攝氏度冰箱冷藏一周后，再進(jìn)行后續(xù)操作。
[0058](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡18min，在流水下沖洗30min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1% (v/v)吐溫的l%(w/v)次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒12min，然后用無菌水沖洗3遍。用鑷子和解剖刀將花蕾分開，切取Icm長的花梗，切掉其端部褐化部分產(chǎn)生新鮮切口，解剖刀在其表面劃痕、切口或創(chuàng)傷后接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并使創(chuàng)傷面盡量接觸培養(yǎng)基表面。將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、完全黑暗條件下培養(yǎng)40天，開始出現(xiàn)愈傷組織，污染率為O。愈傷誘導(dǎo)率達(dá)88%。
[0059]愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.5mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8。
[0060]愈傷團(tuán)塊若在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)130天后直徑最大可達(dá)4.96mm。其中，愈傷團(tuán)塊大小以游標(biāo)卡尺測量，由于愈傷團(tuán)塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團(tuán)塊大小衡量標(biāo)準(zhǔn)，并伴隨著小植株的分化。
[0061](3)外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)到40天后愈傷組織開始分化出小植株，分化率100%。將花梗連同愈傷組織團(tuán)塊、小植株一起在超凈工作臺上轉(zhuǎn)接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在照度為18001UX、12h光照/12h黑暗的光照條件下培養(yǎng)90天，繼續(xù)分化出大量小植株，平均每塊外植體可分化出70棵小植株，將小植株從外植體上分切下來，轉(zhuǎn)接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上。
[0062]繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、6g/L瓊脂、0.1mg/L6-節(jié)氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.lmg/L α _ 蔡乙酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA),繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0063](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周，鱗莖平均直徑在1.2cm，達(dá)到Icm以上，小植株直接進(jìn)行出瓶種植。將繼代培養(yǎng)基上的小植株置于4攝氏度黑暗條件下進(jìn)行低溫處理50天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒25min，然后種入育苗專用介質(zhì)(Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質(zhì)中的深度在Icm,進(jìn)行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達(dá)到1:70，即平均每塊外植體最終產(chǎn)生70棵小植株。
[0064]實(shí)施例3以東方百合‘索邦’花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0065](I)花蕾期取2cm長的百合幼嫩花荀,帶1.5 cm長度的花梗,封在口袋中冷藏于4攝氏度冰箱，冷藏一周后取出外植體進(jìn)行處理。
[0066](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡30min，在流水下沖洗120min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用 添加了 0.1% (v/v)吐溫的1% (w/v)次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒15min，然后用無菌水沖洗3遍。用鑷子和解剖刀將花蕾分開，切取Icm長的花梗，切掉其端部褐化部分產(chǎn)生新鮮切口，解剖刀在其表面劃痕、切口或創(chuàng)傷后接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并使創(chuàng)傷面盡量接觸愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面。將接種了外植體的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基在25攝氏度、完全黑暗條件下培養(yǎng)8天，開始出現(xiàn)愈傷組織，污染率為O。愈傷誘導(dǎo)率達(dá)100%，污染率為O。
[0067]愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6_節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.25mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4_D);愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8。
[0068]愈傷團(tuán)塊若在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)130天后，直徑最大可達(dá)3.58mm。其中，愈傷團(tuán)塊大小以游標(biāo)卡尺測量，由于愈傷團(tuán)塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團(tuán)塊大小衡量標(biāo)準(zhǔn)，并伴隨著小植株的分化。
[0069](3)外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)到50天后，愈傷組織開始分化出小植株，分化率100%。將花梗連同愈傷組織團(tuán)塊、小植株一起在超凈工作臺上轉(zhuǎn)接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在照度為18001ux、12h光照/12h黑暗的光照條件下培養(yǎng)120天，繼續(xù)分化出大量小植株，平均每塊外植體可分化出63棵小植株，將小植株從外植體上分切下來，轉(zhuǎn)接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上。
[0070]繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，SP每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4g/L 瓊月旨、0.2mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.2mg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),繼代培養(yǎng)基的 pH 值為 5.8。
[0071](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周，鱗莖平均直徑在1.34cm，達(dá)到Icm以上，小植株直接進(jìn)行出瓶種植。將繼代培養(yǎng)基上的小植株置于I攝氏度黑暗條件下進(jìn)行低溫處理30天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒30min，然后種入育苗專用介質(zhì)(Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質(zhì)中的深度在2cm,進(jìn)行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達(dá)到1:63，即平均每塊外植體最終產(chǎn)生63棵小植株。
[0072]實(shí)施例4以東方百合‘索邦’花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0073](I)花蕾期取2cm長的百合幼嫩花苞，帶1.5cm長度的花梗，封在口袋中冷藏于4攝氏度冰箱，冷藏一周后取出外植體進(jìn)行處理。
[0074](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡30min，在流水下沖洗120min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1% (v/v)吐溫的1% (w/v)次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒15min，然后用無菌水沖洗3遍。用鑷子和解剖刀將花蕾分開，切取Icm長的花梗，切掉其端部褐化部分產(chǎn)生新鮮切口，解剖刀在其表面劃痕、切口或創(chuàng)傷后接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并使創(chuàng)傷面盡量接觸愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面。將接種了外植體的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基在25攝氏度、完全黑暗條件下培養(yǎng)8天，開始出現(xiàn)`愈傷組織，污染率為O。愈傷誘導(dǎo)率達(dá)100%，污染率為O。
[0075]愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L瓊脂、0.25mg/L6_節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.25mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液的pH值為
5.8。
[0076]愈傷團(tuán)塊若在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)130天后，直徑最大可達(dá)3.58mm。其中，愈傷團(tuán)塊大小以游標(biāo)卡尺測量，由于愈傷團(tuán)塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團(tuán)塊大小衡量標(biāo)準(zhǔn)，并伴隨著小植株的分化。
[0077](3)外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)到50天后，愈傷組織開始分化出小植株，分化率100%。將花梗連同愈傷組織團(tuán)塊、小植株一起在超凈工作臺上轉(zhuǎn)接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在照度為18001ux、12h光照/12h黑暗的光照條件下培養(yǎng)120天，繼續(xù)分化出大量小植株，平均每塊外植體可分化出63棵小植株，將小植株從外植體上分切下來，轉(zhuǎn)接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上。
[0078]繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4g/L 瓊月旨、0.2mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.2mg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),繼代培養(yǎng)基的 pH 值為 5.8。
[0079](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周，鱗莖平均直徑在1.34cm，達(dá)到Icm以上，繼續(xù)維持百合離體鱗莖再生體系，進(jìn)行繼代的方法是:小植株在繼代培養(yǎng)基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉(zhuǎn)綠后，進(jìn)行小植株的轉(zhuǎn)接；轉(zhuǎn)接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉(zhuǎn)接到按步驟(3)配置的新鮮的繼代培養(yǎng)基上；
[0080](5)步驟(4)中的小鱗莖在繼代培養(yǎng)基上再生出小植株，對再生出的小植株進(jìn)行出瓶種植。將繼代培養(yǎng)基上的小植株置于I攝氏度黑暗條件下進(jìn)行低溫處理30天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)3?中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒30min,然后種入育苗專用介質(zhì)(Custom growingmix, Fafard)中，小植株種入育苗基質(zhì)中的深度在2cm，進(jìn)行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達(dá)到1:63，即平均每塊外植體最終產(chǎn)生63棵小植株。
[0081]最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以 有很多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容中直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種以花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:材料采取: 在百合花期，取百合長0.5~2.0cm的花蕾，花蕾帶長I~1.5cm的花梗，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏I周后，再進(jìn)行后續(xù)操作； 步驟二:愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配置: 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6_ 節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~1.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4_D),愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液的pH值為 5.8 ; 將配置好的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進(jìn)行分裝，即將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液倒入培養(yǎng)皿中，待愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液凝固成愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿包裹好，放在無菌潔凈環(huán)境下存放； 步驟三:外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo): 將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5~30min，再在流水下沖洗0.5~2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進(jìn)行消毒接種； 消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v的次氯酸鈉溶液，將清洗干凈的花蕾進(jìn)行表面消毒8~15min,然后用無菌水沖洗3遍； 消毒后進(jìn)行接種:用鑷子和解剖刀將花蕾上的花梗切下，將長Icm的花梗接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，花梗需先切掉其端部褐化部分產(chǎn)生新鮮切口，然后用解剖刀在其表面處理出劃痕、切口或創(chuàng)傷后接種，并使創(chuàng)傷面接觸培養(yǎng)基表面；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、黑暗條件下培養(yǎng)8~40天，完成愈傷組織的誘導(dǎo)，出現(xiàn)愈傷組織團(tuán)塊； 步驟四:小植株再生: 外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)40~70天后，開始分化再生出小植株，然后將外植體轉(zhuǎn)接到新鮮的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在照度為18001uX、12h光照/12h黑暗的光照條件下，培養(yǎng)90~120天后，在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團(tuán)塊上分離下來，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)； 小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后，可進(jìn)行步驟六中的出瓶種植，或者不出瓶，進(jìn)行步驟五中的繼代以維持百合離體鱗莖再生體系，再進(jìn)行步驟六中的出瓶種植； 所述繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基中添加有4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊月旨、O ~0.2mg/L6-節(jié)氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),繼代培養(yǎng)基的 pH 值為 5.8 ； 步驟五:小植株的繼代培養(yǎng): 步驟四中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后，不出瓶，進(jìn)行繼代的方法是:小植株在繼代培養(yǎng)基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉(zhuǎn)綠后，進(jìn)行小植株的轉(zhuǎn)接；轉(zhuǎn)接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉(zhuǎn)接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上，繼續(xù)步驟四的培養(yǎng)； 步驟六:小植株的出瓶種植: 出瓶前進(jìn)行低溫鍛煉，將組培容器中的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)的小植株，在I~5攝氏度、黑暗條件下進(jìn)行30~50天的低溫處理；低溫處理后，將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15~30min，然后種入育苗專用介質(zhì)(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗專用介質(zhì)中的深度在I~2cm范圍內(nèi)，即小鱗莖頂端距土表一球高左右，進(jìn)行栽培管理，即完成百合胚性愈 傷再生體系的建立。
【文檔編號】A01H4/00GK103798141SQ201410037629
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】張琳, 夏宜平 申請人:浙江大學(xué)