人源化il-7嚙齒動(dòng)物的制作方法
【專利摘要】包含人或人源化白介素-7(IL-7)基因的基因修飾非人動(dòng)物。包含人或人源化IL-7基因的細(xì)胞、胚胎和非人動(dòng)物。表達(dá)人或人源化IL-7蛋白的嚙齒動(dòng)物。在其種系中包含編碼人或人源化IL-7的基因的基因修飾小鼠，其中所述編碼人或人源化IL-7的基因處于內(nèi)源小鼠IL-7調(diào)控序列的控制之下。
【專利說(shuō)明】人源化IL-7嚙齒動(dòng)物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 包含遺傳修飾的非人動(dòng)物（例如，哺乳動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物，諸如小鼠、大鼠和倉(cāng) 鼠），所述遺傳修飾包括在內(nèi)源基因座處用人IL-7基因序列對(duì)非人IL-7基因序列進(jìn)行置 換。嚙齒動(dòng)物和其他非人動(dòng)物，其從處于內(nèi)源非人調(diào)控序列的控制之下的基因座中，或者從 包含內(nèi)源非人調(diào)控序列的內(nèi)源非人IL-7基因座中，表達(dá)人IL-7或人源化IL-7。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 隨機(jī)插入了包含人IL-7序列的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠是本領(lǐng)域中已知的。然而，大 多數(shù)（如果不是所有）的這些轉(zhuǎn)基因小鼠在一個(gè)方面或另一個(gè)方面不是最佳的。例如，大 多數(shù)的在人IL-7方面而言轉(zhuǎn)基因的小鼠展現(xiàn)出異常水平和/或比例的某些細(xì)胞（包括T 細(xì)胞），這很可能歸因于免疫細(xì)胞發(fā)育（例如T細(xì)胞發(fā)育）的失調(diào)。
[0004] 在本領(lǐng)域中仍然需要包含編碼人IL-7的序列的非人動(dòng)物，其中所述編碼人IL-7 的序列位于內(nèi)源非人IL-7基因座處，和需要在內(nèi)源非人調(diào)控元件的控制之下表達(dá)人IL-7 的非人動(dòng)物。在本領(lǐng)域中需要這樣的非人動(dòng)物，其以盡可能地在該非人動(dòng)物中在生理學(xué)上 適當(dāng)?shù)姆绞奖磉_(dá)人IL-7。在本領(lǐng)域中需要表達(dá)人IL-7的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物在外 周T細(xì)胞方面和/或在T細(xì)胞亞型的比例方面沒(méi)有顯著異常。
[0005] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0006] 提供了基因修飾非人動(dòng)物、細(xì)胞、組織和核酸，其在內(nèi)源非人IL-7基因座處包含 人IL-7基因組序列。所述非人動(dòng)物從經(jīng)修飾的基因座中表達(dá)人源化IL-7蛋白，所述經(jīng)修 飾的基因座由該經(jīng)修飾的內(nèi)源IL-7基因座的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源非人調(diào)控序列進(jìn)行調(diào)控。在 各種不同的實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠等。在一個(gè)特別的 實(shí)施方案中，所述嚙齒動(dòng)物為小鼠或大鼠。
[0007] 在各種不同的實(shí)施方案和方面中，所述非人動(dòng)物在該非人動(dòng)物的種系中在經(jīng)修飾 的內(nèi)源IL-7基因座處包含經(jīng)修飾的IL-7基因，其中所述經(jīng)修飾的內(nèi)源IL-7基因座包含該 內(nèi)源IL-7基因的至少一部分的人源化。在各種不同的實(shí)施方案中，所述小鼠在經(jīng)修飾的 IL-7基因座方面而言是雜合的或純合的。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了非人動(dòng)物，其包含第一 個(gè)內(nèi)源IL-7等位基因的缺乏和第二個(gè)內(nèi)源IL-7等位基因的人源化。在各種不同的實(shí)施方 案和方面中，所述人源化涉及一個(gè)或多個(gè)外顯子和/或內(nèi)含子。在各種不同的實(shí)施方案和 方面中，提供了具有經(jīng)修飾的IL-7基因座的非人動(dòng)物，其中在該經(jīng)修飾的動(dòng)物中保留了內(nèi) 源非人5' -非翻譯區(qū)和內(nèi)源非人3' -非翻譯區(qū)之一或兩者。
[0008] 在一些方面，本發(fā)明的非人動(dòng)物包含有包含在SEQ ID NO: 1之內(nèi)的5'-非翻譯區(qū)。 在一些方面，本發(fā)明的非人動(dòng)物包含有包含在SEQ ID NO:2之內(nèi)的3'-非翻譯區(qū)。在一些 實(shí)施方案中，本發(fā)明的非人動(dòng)物包含有包含在SEQ ID NO: 1之內(nèi)的5'-非翻譯區(qū)和包含在 SEQ ID NO:2之內(nèi)的3'-非翻譯區(qū)。
[0009] 在一些方面，本發(fā)明的非人動(dòng)物包含是SEQ ID NO: 1的5' -非翻譯區(qū)。在一些方 面，本發(fā)明的非人動(dòng)物包含是SEQ ID N0:2的3'-非翻譯區(qū)。在一些方面，本發(fā)明的非人動(dòng) 物包含是SEQ ID NO: 1的5' -非翻譯區(qū)和是SEQ ID NO: 2的3' -非翻譯區(qū)。
[0010] 在一些方面，本發(fā)明的人源化IL-7基因具有與包含人IL-7基因的外顯子2-6 的連續(xù)序列至少 50% (例如，50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）同一的序列。在一些確定的方面，本 發(fā)明的人IL-7基因包含SEQ ID N0:3。在一些方面，本發(fā)明的人源化IL-7基因具有反映出 圖1中所示的人源化的序列。
[0011] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其在內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7基因座處包含用 人IL-7基因組序列對(duì)內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7基因組序列進(jìn)行的置換。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因修飾嚙齒動(dòng)物包含位于人IL-7基因組序列上游（相 關(guān)于IL-7基因的轉(zhuǎn)錄方向而言）的第一嚙齒動(dòng)物調(diào)控序列和位于人IL-7基因組序列下游 的第二嚙齒動(dòng)物調(diào)控序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一嚙齒動(dòng)物調(diào)控序列包含嚙齒動(dòng)物 啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，和所述第二嚙齒動(dòng)物調(diào)控序列包含3' -UTR。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述嚙齒動(dòng)物為小鼠并且包含具有小鼠外顯子1和人外顯子 2、3、4、5和6的內(nèi)源小鼠 IL-7基因座位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)源小鼠 IL-7基因座 位從上游至下游（相關(guān)于轉(zhuǎn)錄方向而言）包含：小鼠外顯子1，至少一部分的第一小鼠內(nèi)含 子，和鄰接的包含人外顯子2至人外顯子6的人基因組片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠 進(jìn)一步包含鄰接的內(nèi)源小鼠 DNA序列，其包含完整的內(nèi)源小鼠 IL-7上游（相關(guān)于IL-7基 因的轉(zhuǎn)錄方向而言）啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)，其中所述鄰接的小鼠 DNA位于所述人基因組片段的 上游；和進(jìn)一步包含鄰接的位于所述人基因組片段的下游的內(nèi)源小鼠 DNA3' -UTR序列。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠包含與選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2及其組合的 序列至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一的小鼠序列。在 一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述小鼠包含選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的小鼠序列。
[0015] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾小鼠，其在內(nèi)源小鼠 IL-7基因座處包含用人IL-7基 因組序列對(duì)內(nèi)源小鼠 IL-7基因組序列進(jìn)行的置換，從而形成經(jīng)修飾的基因座，其中所述人 IL-7基因組序列包含至少一個(gè)人外顯子，并且所述經(jīng)修飾的基因座包含選自SEQ ID NO: 1 的序列、SEQ ID NO: 2的序列及其組合的小鼠序列。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述置換包括含有外顯子2至6的人基因組片段，并且所述人 基因組片段與小鼠外顯子1相連接從而形成經(jīng)修飾的內(nèi)源小鼠 IL-7基因座，其中所述經(jīng)修 飾的小鼠 IL-7基因座包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2及其組合的小鼠序列。
[0017] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其包含IL-7基因，該IL-7基因包含嚙 齒動(dòng)物外顯子1和至少一部分的嚙齒動(dòng)物內(nèi)含子1，以及人IL-7外顯子2、3、4、5和6的 人IL-7基因序列，其中所述嚙齒動(dòng)物包含選自嚙齒動(dòng)物上游IL-7調(diào)控序列、嚙齒動(dòng)物 IL-73' -UTR及其組合的序列。
[0018] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾小鼠，其包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2及其組 合的序列；其中所述小鼠缺乏編碼小鼠 IL-7蛋白的外顯子2至5的內(nèi)源序列，并且所述小 鼠在內(nèi)源小鼠 IL-7基因座處包含核酸序列，其中該核酸序列編碼人IL-7外顯子2、3、4、5 和6。
[0019] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其從經(jīng)修飾從而表達(dá)至少一個(gè)人IL-7外 顯子的內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7基因座中表達(dá)人或人源化IL-7蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾 所述嚙齒動(dòng)物IL-7基因座以表達(dá)由包含至少兩個(gè)人IL-7外顯子的序列所編碼的人或人源 化IL-7蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾所述嚙齒動(dòng)物IL-7基因座以表達(dá)由包含至少三個(gè)人 IL-7外顯子的序列所編碼的人或人源化IL-7蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾所述嚙齒動(dòng)物 IL-7基因座以表達(dá)由至少包含人IL-7外顯子2、3、4、5和6 (即2至6)的序列所編碼的人 或人源化IL-7蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾所述嚙齒動(dòng)物IL-7基因座以表達(dá)人IL-7蛋 白。在一些確定的方面，修飾所述嚙齒動(dòng)物IL-7基因座以表達(dá)其序列反映了由在圖1中顯 示的基因座所編碼的蛋白的人IL-7蛋白。在一些確定的方面，修飾所述嚙齒動(dòng)物IL-7基 因座以表達(dá)包含由人IL-7基因的外顯子2-6所編碼的序列的人IL-7蛋白。在一些確定的 方面，修飾所述嚙齒動(dòng)物IL-7基因座以表達(dá)包含由在SEQ ID NO:3中所示的人IL-7基因 的外顯子2-6所編碼的序列的人IL-7蛋白。
[0020] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其從經(jīng)修飾從而至少包含人IL-7外顯子 2至6 (代替嚙齒動(dòng)物IL-7外顯子2至5)的內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7基因座中表達(dá)人或人源化 IL-7蛋白。
[0021] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其從包含人源化內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7編碼 區(qū)的人源化內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7基因座中表達(dá)人或人源化IL-7蛋白，其中所述人源化內(nèi)源 嚙齒動(dòng)物IL-7基因座包含所有的在野生型嚙齒動(dòng)物中存在于野生型嚙齒動(dòng)物IL-7編碼區(qū) 上游和存在于野生型嚙齒動(dòng)物IL-7編碼區(qū)下游的內(nèi)源嚙齒動(dòng)物調(diào)控元件。
[0022] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其從包含位于編碼人或人源化IL-7蛋白 的核酸序列上游和下游的嚙齒動(dòng)物調(diào)控區(qū)的人源化嚙齒動(dòng)物IL-7基因座中表達(dá)人或人源 化IL-7蛋白，其中所述人或人源化IL-7蛋白以與在野生型嚙齒動(dòng)物中嚙齒動(dòng)物IL-7蛋白 的表達(dá)圖式大致相同的表達(dá)圖式進(jìn)行表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人或人源化IL-7的血 清表達(dá)水平與在野生型嚙齒動(dòng)物中嚙齒動(dòng)物IL-7蛋白的血清表達(dá)水平大致相同。
[0023] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其表達(dá)人源化IL-7蛋白，其中該嚙齒動(dòng) 物的淋巴細(xì)胞群的特征為在數(shù)目上與在年齡匹配的野生型小鼠中的B細(xì)胞群大致相同的 其B細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的嚙齒動(dòng)物的特征為在數(shù)目上與在年齡匹配 的野生型小鼠中的成熟B細(xì)胞群大致相同的成熟B細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源 化IL-7蛋白與人IL-7蛋白是同一的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化IL-7蛋白包含由至 少人IL-7基因的外顯子2至6所編碼的人序列。
[0024] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其表達(dá)人源化IL-7蛋白，其中該嚙齒動(dòng) 物的淋巴細(xì)胞群的特征為在數(shù)目上與在年齡匹配的野生型小鼠中的T細(xì)胞群大致相同的T 細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的嚙齒動(dòng)物展現(xiàn)出在數(shù)目上與在年齡匹配的野生 型小鼠中的成熟T細(xì)胞群大致相同的成熟T細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的嚙 齒動(dòng)物展現(xiàn)出在數(shù)目上與在年齡匹配的野生型小鼠中的外周T細(xì)胞群大致相同的外周T細(xì) 胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化IL-7蛋白與人IL-7蛋白是同一的。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述人源化IL-7蛋白包含由至少人IL-7基因的外顯子2至6所編碼的人序列。
[0025] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其表達(dá)人源化IL-7蛋白，其中該嚙齒動(dòng) 物的淋巴細(xì)胞群的特征為這樣的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞群展現(xiàn)出與在年齡匹配的野生型小 鼠中的T細(xì)胞群的⑶4:⑶8比例大致相同的⑶4:⑶8比例。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源 化IL-7蛋白與人IL-7蛋白是同一的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化IL-7蛋白包含由至 少人IL-7基因的外顯子2至6所編碼的人序列。
[0026] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其表達(dá)人源化IL-7蛋白，其中所述嚙齒 動(dòng)物包含選自下列的特征：沒(méi)有發(fā)展出慢性結(jié)腸炎的傾向；沒(méi)有在結(jié)腸粘膜淋巴細(xì)胞中 IL-7的過(guò)表達(dá)；在結(jié)腸粘膜淋巴細(xì)胞中IL-7的正常的或野生型的表達(dá)；沒(méi)有嚴(yán)重皮炎；沒(méi) 有以單核細(xì)胞的大量真皮浸潤(rùn)為特征的皮炎；在其T細(xì)胞群中展現(xiàn)出與年齡匹配的野生型 小鼠的⑶4:⑶8比例大致相同的⑶4:⑶8比例；展現(xiàn)出與在野生型小鼠中小鼠 IL-7的表達(dá) 圖式大致相同的人IL-7的表達(dá)圖式；以及其組合。
[0027] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其表達(dá)人源化IL-7蛋白，其中所述嚙齒 動(dòng)物沒(méi)有發(fā)展出慢性結(jié)腸炎的傾向。
[0028] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其表達(dá)人源化IL-7蛋白，其中所述嚙齒 動(dòng)物不展現(xiàn)出在結(jié)腸粘膜淋巴細(xì)胞中IL-7的過(guò)表達(dá)。
[0029] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其表達(dá)人源化IL-7蛋白，其中所述嚙齒 動(dòng)物不展現(xiàn)出以單核細(xì)胞的大量真皮浸潤(rùn)為特征的皮炎。
[0030] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其表達(dá)人源化IL-7蛋白，其中所述嚙齒 動(dòng)物不展現(xiàn)出進(jìn)入真皮的淋巴組織增生。
[0031] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其表達(dá)人源化IL-7蛋白，其中所述嚙齒 動(dòng)物不以比年齡匹配的野生型小鼠更高的頻率展現(xiàn)出B和/或T細(xì)胞淋巴瘤。
[0032] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾小鼠，其表達(dá)人源化IL-7蛋白或人IL-7蛋白，其中 所述小鼠不比野生型小鼠更傾向于發(fā)展出選自下列的病理學(xué)狀態(tài)：結(jié)腸炎，慢性結(jié)腸炎，嚴(yán) 重皮炎，單核細(xì)胞對(duì)于真皮的病理學(xué)和/或大量浸潤(rùn)，真皮的淋巴組織增生，B細(xì)胞淋巴瘤， T細(xì)胞淋巴瘤，成熟B和/或T細(xì)胞的數(shù)目減少，外周B和/或T細(xì)胞的數(shù)目減少，異常的 ⑶4+T細(xì)胞數(shù)目，異常的⑶8+T細(xì)胞數(shù)目，以及其組合。
[0033] 在一些方面，提供了基因修飾小鼠，其表達(dá)人IL-7蛋白，所述人IL-7蛋白的序列 反映了用人IL-7基因序列對(duì)小鼠 IL-7基因序列進(jìn)行的置換，其中所述人IL-7基因序列包 含人IL-7基因的外顯子2-6。在一些確定的方面，所述置換涉及包含小鼠 IL-7基因的外顯 子2-5的序列。在一些確定的方面，人IL-7基因包含SEQ ID N0:3。在一些確定的方面，所 述人IL-7蛋白的表達(dá)處于小鼠調(diào)控元件的控制之下。
[0034] 在一些方面，提供了基因修飾小鼠，其沒(méi)有可檢測(cè)地表達(dá)小鼠 IL-7蛋白。在一些 確定的方面，在本文中所描述的小鼠基因組包含小鼠 IL-7基因的全部或部分缺失。在一些 確定的方面，在本文中所描述的小鼠基因組包含相應(yīng)于外顯子2-5的內(nèi)源IL-7基因序列的 缺失。
[0035] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾非人動(dòng)物，其在其種系中包含用至少一個(gè)人IL-7外 顯子對(duì)至少一個(gè)非人IL-7外顯子進(jìn)行的置換，從而形成編碼人或人源化IL-7的基因，其中 所述置換位于內(nèi)源非人IL-7基因座處，其中所述編碼人或人源化IL-7的基因處于內(nèi)源非 人調(diào)控元件的控制之下。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因修飾非人動(dòng)物為哨齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 嚙齒動(dòng)物選自大鼠和小鼠。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼人或人源化IL-7的基因包含選自下列的人外顯子： 人外顯子1、人外顯子2、人外顯子3、人外顯子4、人外顯子5、人外顯子6及其組合。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述編碼人或人源化IL-7的基因包含選不多于五個(gè)人外顯子。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因修飾非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物，所述嚙齒動(dòng)物為小鼠，并 且所述經(jīng)修飾的基因座包含用包含人IL-7外顯子2、3、4、5和6的人基因組區(qū)段對(duì)小鼠外 顯子2、3、4和5進(jìn)行的置換。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼人或人源化IL-7的基因包含編碼人或人源化IL-7 蛋白的cDNA。
[0040] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾非人動(dòng)物，其在其種系中包含轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包 含編碼人或人源化IL-7基因的核酸序列，其中所述人或人源化IL-7基因在上游和下游在 側(cè)翼與內(nèi)源非人調(diào)控序列相接。
[0041] 在一個(gè)方面，所述基因修飾非人動(dòng)物為哨齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哨齒動(dòng) 物選自小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因修飾非人動(dòng)物包含選自下列的人外顯子：人外顯子 1、人外顯子2、人外顯子3、人外顯子4、人外顯子5、人外顯子6及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述人或人源化IL-7基因包含至少五個(gè)人外顯子。
[0043] 在一個(gè)方面，提供了人源化IL-7基因座，其包含非人外顯子1、人外顯子2、人外顯 子3、人外顯子4、人外顯子5和人外顯子6。在一些確定的方面，所述人源化IL-7基因座 進(jìn)一步包含位于非人外顯子1和人外顯子6側(cè)翼的5'和3'非人非翻譯區(qū)。在一些確定的 實(shí)施方案中，所述人源化IL-7基因座包含與非人3'非翻譯區(qū)鄰接的3'人非翻譯區(qū)或其部 分。在一些確定的方面，所述人源化IL-7基因座包含5'非人非翻譯區(qū)或其部分，和非人外 顯子1，其與人外顯子2鄰接。在一些確定的方面，人源化IL-7基因座包含圖1中所示的結(jié) 構(gòu)。
[0044] 在一個(gè)方面，提供了人源化IL-7基因座，其包含可操作地連接至非人IL-7調(diào)控序 列的人IL-7基因的人外顯子2-6。在一些確定的方面，本發(fā)明的人源化IL-7基因座包含非 人IL-7外顯子1。在一些確定的方面，本發(fā)明的人源化IL-7基因座包含非人IL-7外顯子 1和非人IL-7內(nèi)含子1。在一些確定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化IL-7基因座包含與非 人IL-73'非翻譯區(qū)或其部分鄰接的3'人IL-7非翻譯區(qū)或其部分。在一些確定的方面，本 發(fā)明的人源化IL-7基因座包含5'非人非翻譯區(qū)或其部分，和非人外顯子1，其與人IL-7外 顯子2鄰接。
[0045] 在一個(gè)方面，提供了人源化IL-7基因座，其包含編碼實(shí)質(zhì)上是人的IL-7蛋白的 序列。在一些確定的方面，本發(fā)明的人源化IL-7基因座包含與SEQ ID N0:3至少50%、至 少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少 95%或至少98%同一的序列。在一些確定的方面，本發(fā)明的人源化IL-7基因座包含SEQ ID NO:3。在一些確定的方面，本發(fā)明的IL-7蛋白由與SEQ ID NO:3至少50%、至少55%、至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至 少98%同一的序列編碼。在一些確定的方面，本發(fā)明的IL-7蛋白由SEQ ID NO: 3編碼。
[0046] 在一個(gè)方面，提供了用于制備具有編碼人或人源化IL-7的基因的非人動(dòng)物的方 法，所述方法包括修飾所述非人動(dòng)物的種系以包含編碼人或人源化IL-7的基因，該編碼人 或人源化IL-7的基因在上游和下游在側(cè)翼與內(nèi)源非人IL-7調(diào)控序列相接。
[0047] 在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾位于內(nèi)源非人IL-7基因座處。
[0048] 在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物為哨齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述嚙齒動(dòng)物選自小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。
[0049] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾非人動(dòng)物，其進(jìn)行了基因修飾從而以與對(duì)于相同屬 和種的野生型非人動(dòng)物所觀察到的表達(dá)圖式相同的表達(dá)圖式來(lái)表達(dá)人IL-7。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠和大 鼠。
[0050] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述非人動(dòng)物中表達(dá)的人IL-7的水平與在相應(yīng)的野生型 小鼠中非人IL-7的水平大致相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。在一個(gè) 特別的實(shí)施方案中，所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠和大鼠。
[0051] 在一個(gè)方面，提供了 DNA構(gòu)建體，其從5'至3'（相關(guān)于轉(zhuǎn)錄方向而言）包含：與 小鼠 IL-75'非編碼序列同源的核酸序列；編碼人IL-7蛋白但不包含位于編碼人IL-7蛋白 的序列上游或下游的人調(diào)控序列的人基因組片段；和與小鼠 IL-73'非編碼序列同源的核 酸序列。
[0052] 在一個(gè)方面，提供了 DNA構(gòu)建體，其從5'至3'（相關(guān)于轉(zhuǎn)錄方向而言）包含：包 含與小鼠 IL-7外顯子1序列具有同源性的區(qū)域的核酸序列；編碼人IL-7蛋白但不包含位 于編碼人IL-7蛋白的序列上游或下游的人調(diào)控序列的人基因組片段；和與小鼠 IL-73'非 編碼序列同源的核酸序列。
[0053] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物，其中所述嚙齒動(dòng)物包含在本文中所描述 的DNA構(gòu)建體。
[0054] 在一個(gè)方面，提供了在本文中所描述的DNA構(gòu)建體用于制備表達(dá)人IL-7蛋白的嚙 齒動(dòng)物或嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的用途。在一些確定的方面，所述嚙齒動(dòng)物或嚙齒動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有可 檢測(cè)地表達(dá)嚙齒動(dòng)物IL-7蛋白。
[0055] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，其中所述嚙齒動(dòng)物細(xì)胞在內(nèi)源嚙齒 動(dòng)物IL-7基因座處包含用編碼人IL-7的人基因組序列對(duì)編碼嚙齒動(dòng)物IL-7的基因序列 進(jìn)行的置換。在一些確定的方面，所述置換用在本文中所描述的DNA構(gòu)建體來(lái)進(jìn)行。在一 些確定的方面，所述嚙齒動(dòng)物細(xì)胞為大鼠細(xì)胞。在一些確定的方面，所述嚙齒動(dòng)物細(xì)胞為小 鼠細(xì)胞。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人基因組序列包含鄰接的跨越人IL-7外顯子2至人IL-7 外顯子6的人核酸序列。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因修飾嚙齒動(dòng)物在內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7基因座處包含 小鼠 IL-7啟動(dòng)子。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自多能細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能細(xì)胞、全能細(xì)胞、ES細(xì)胞 和卵子。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞分泌人IL-7。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分泌人IL-7 的細(xì)胞選自上皮細(xì)胞（例如，腸上皮細(xì)胞）、肝細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和小結(jié)樹(shù)突細(xì) 胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述嚙齒動(dòng)物細(xì)胞為骨髓樹(shù)突細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分泌 人IL-7的細(xì)胞為胸腺基質(zhì)細(xì)胞；在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述胸腺基質(zhì)細(xì)胞為皮質(zhì)上皮 細(xì)胞。
[0060] 在一個(gè)方面，提供了嚙齒動(dòng)物胚胎，其中所述胚胎包含至少一個(gè)嚙齒動(dòng)物供體細(xì) 胞（例如，ES細(xì)胞、多能細(xì)胞、全能細(xì)胞等），所述嚙齒動(dòng)物供體細(xì)胞在內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7 基因座處包含用編碼人IL-7的核酸序列對(duì)內(nèi)源的編碼嚙齒動(dòng)物IL-7的核酸序列進(jìn)行的置 換。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述供體細(xì)胞為小鼠 ES細(xì)胞，并且所述胚胎為宿主小鼠胚胎，其是 前桑椹胚、桑椹胚或胚泡。
[0061] 在一個(gè)方面，提供了在內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7基因座處包含人源化IL-7基因的嚙齒 動(dòng)物組織，其中所述嚙齒動(dòng)物組織選自胸腺組織、脾組織、表皮組織和腸組織。
[0062] 在一個(gè)方面，提供了基因修飾小鼠，其包含編碼人IL-7的DNA序列，其中所述小鼠 不表達(dá)小鼠 IL-7,并且其中所述小鼠展現(xiàn)出具有與野生型小鼠的T細(xì)胞群大致相同的大小 的T細(xì)胞群。
[0063] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠展現(xiàn)出具有與野生型小鼠的外周T細(xì)胞群大致相同 的大小的外周T細(xì)胞群。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞群為小鼠 T細(xì)胞群。
[0065] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠不比野生型小鼠更傾向于發(fā)展出包含原B細(xì)胞或前 B細(xì)胞的B細(xì)胞腫瘤。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠不比野生型小鼠更傾向于發(fā)展出淋巴樣腫瘤。
[0067] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠在已知的淋巴組織增生致病因子不存在下不展現(xiàn)出 淋巴組織增生性病癥。
[0068] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠不展現(xiàn)出在皮膚層中T細(xì)胞的病理學(xué)浸潤(rùn)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述小鼠不展現(xiàn)出脫發(fā)的癥狀。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因修飾小鼠的大多數(shù)T細(xì)胞在大小分布上與在年齡匹 配的野生型小鼠中大致相同。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述基因修飾小鼠不展現(xiàn)出T細(xì) 胞的擴(kuò)大。
[0070] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了嚙齒動(dòng)物，其從內(nèi)源的經(jīng)修飾的嚙齒動(dòng)物IL-7基因座 中表達(dá)人源化或人IL-7蛋白，其中在所述嚙齒動(dòng)物中人IL-7的血清濃度是在生理學(xué)上正 常的。
[0071] 在一個(gè)方面，提供了人源化嚙齒動(dòng)物，其以在生理學(xué)上正常的濃度在所述嚙齒動(dòng) 物的血清中表達(dá)人源化IL-7基因。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施方案中,所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠和大鼠。
[0073] 在一個(gè)實(shí)施方案中，人IL-7的在生理學(xué)上正常的血清濃度小于10pg/mL。在一個(gè) 實(shí)施方案中，人IL-7的在生理學(xué)上正常的血清濃度小于5pg/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，在嚙 齒動(dòng)物中人IL-7的在生理學(xué)上正常的血清濃度為大約2pg/mL至大約4pg/mL。在一個(gè)實(shí)施 方案中，在嚙齒動(dòng)物血清中人IL-7的在生理學(xué)上正常的血清濃度為大約2. 4pg/mL至大約 3. 2pg/mL〇
[0074] 在一個(gè)方面，提供了用于制備人IL-7蛋白的方法，所述方法包括在非人動(dòng)物的種 系中插入處于內(nèi)源非人調(diào)控元件的控制之下的編碼人或人源化IL-7的基因，允許所述非 人動(dòng)物產(chǎn)生人或人源化IL-7,和從所述非人動(dòng)物（例如，哺乳動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物，諸如小 鼠或大鼠或倉(cāng)鼠）中分離人或人源化IL-7。
[0075] 在一個(gè)方面，提供了用于制備人IL-7蛋白的方法，所述方法包括從在本文中所描 述的非人動(dòng)物（例如，哺乳動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物，諸如小鼠或大鼠或倉(cāng)鼠）中分離。
[0076] 在一個(gè)方面，提供了用于制備在其種系中包含人或人源化IL-7基因的非人動(dòng)物 的方法，所述方法包括在所述非人動(dòng)物的種系中插入編碼人或人源化IL-7的核酸序列或 其片段，其中所述編碼人或人源化IL-7的核酸序列或其片段處于內(nèi)源非人調(diào)控元件的調(diào) 控控制之下。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人或人源化IL-7基因位于內(nèi)源非人IL-7基因座處 (即，插入在所述內(nèi)源非人IL-7基因座處在上游和下游非人調(diào)控元件之間，其中所述編碼 人或人源化IL-7的核酸序列置換了全部或部分的野生型的現(xiàn)存的非人IL-7編碼序列）。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述嚙 齒動(dòng)物選自小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。
[0077] 在一個(gè)方面，提供了用于制備包含人或人源化IL-7基因的非人動(dòng)物的方法，所述 方法包括將包含人IL-7基因的外顯子2-6的DNA構(gòu)建體插入非人細(xì)胞的內(nèi)源非人IL-7基 因中。
[0078] 在一個(gè)方面，提供了用于從非人動(dòng)物中分離已被暴露至人或人源化IL-7蛋白的T 細(xì)胞的方法，所述方法包括從在本文中所描述的非人動(dòng)物中分離T細(xì)胞的步驟。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述非人動(dòng)物為小鼠或大鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞為非人T細(xì)胞，例 如嚙齒動(dòng)物T細(xì)胞，例如小鼠或大鼠的T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞選自在胸腺 中的T細(xì)胞和外周T細(xì)胞。
[0079] 在一個(gè)方面，提供用于鑒定是人IL-7的拮抗劑的試劑的方法，所述方法包括下述 步驟：向在本文中所描述的基因修飾嚙齒動(dòng)物施用試劑，測(cè)定所述試劑對(duì)于在嚙齒動(dòng)物中 由人IL-7介導(dǎo)的功能的影響，和如果其拮抗在所述基因修飾嚙齒動(dòng)物中人IL-7的功能，則 將所述試劑鑒定為IL-7拮抗劑。
[0080] 在一個(gè)方面，提供了在本文中所描述的基因修飾嚙齒動(dòng)物用于鑒定是人IL-7的 拮抗劑的試劑的用途，其包括：向所述基因修飾嚙齒動(dòng)物施用試劑，測(cè)定所述試劑對(duì)于在嚙 齒動(dòng)物中由人IL-7介導(dǎo)的功能的影響，和如果其拮抗在所述基因修飾嚙齒動(dòng)物中人IL-7 的功能，則將所述試劑鑒定為IL-7拮抗劑。
[0081] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑包括結(jié)合IL-7的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述試劑特異地結(jié)合人IL-7而不結(jié)合嚙齒動(dòng)物IL-7。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 試劑為抗體。
[0082] 在一個(gè)方面，提供了用于確定試劑是否減少由IL-7介導(dǎo)的外周T細(xì)胞群的方法， 所述方法包括下述步驟：向在本文中所描述的基因修飾嚙齒動(dòng)物施用IL-7拮抗劑一段時(shí) 間，在施用之后在一個(gè)或多個(gè)時(shí)限處測(cè)量所述嚙齒動(dòng)物的外周T細(xì)胞群數(shù)目，和確定所述 IL-7拮抗劑是否減少外周T細(xì)胞群。
[0083] 在一個(gè)方面，提供了在本文中所描述的基因修飾嚙齒動(dòng)物用于確定試劑是否減少 由IL-7介導(dǎo)的外周T細(xì)胞群的用途，其包括向所述基因修飾嚙齒動(dòng)物施用IL-7拮抗劑一 段時(shí)間，在施用之后在一個(gè)或多個(gè)時(shí)限處測(cè)量所述嚙齒動(dòng)物的外周T細(xì)胞群數(shù)目，和確定 所述IL-7拮抗劑是否減少外周T細(xì)胞群。
[0084] 在一個(gè)方面，所述基因修飾非人動(dòng)物對(duì)于編碼人或人源化IL-7的基因而言是雜 合的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物不能夠表達(dá)內(nèi)源IL-7蛋白。在一個(gè)特別的實(shí)施方 案中，所述非人動(dòng)物包含兩個(gè)內(nèi)源IL-7等位基因的敲除。
[0085] 上面和下面所描述的方面和實(shí)施方案中的每一個(gè)可以一起使用，除非另有說(shuō)明和 除非另外從上下文看是清楚的。
[0086] 附圖簡(jiǎn)述
[0087] 圖1描繪了（不是按比例地）野生型小鼠 IL-7基因座位（上）和人源化內(nèi)源小 鼠 IL-7基因座（下）的示意圖。空心符號(hào)表明人序列；實(shí)心符號(hào)表明小鼠序列；加陰影的 項(xiàng)目表明非翻譯區(qū)；加點(diǎn)的區(qū)域表明其他序列。
[0088] 圖2描繪了在具有75% C57B6和25 % 129/SvJ的遺傳背景的野生型小鼠 (75/25WT)和對(duì)于本文中所描述的人源化內(nèi)源IL-7基因座而言雜合的小鼠（5148Het)的血 清中的人IL-7濃度。
[0089] 發(fā)明詳述
[0090] 在各種不同的實(shí)施方案中，描述了包含本文中所描述的基因修飾的非人動(dòng)物。所 述基因修飾非人動(dòng)物可以選自小鼠、大鼠、兔、豬、牛（例如，母牛、公牛、野牛）、鹿、綿羊、山 羊、雞、貓、狗、雪貂、靈長(zhǎng)類動(dòng)物（例如，狨猴、獼猴）。對(duì)于其中合適的可進(jìn)行基因修飾的 ES細(xì)胞不容易得到的非人動(dòng)物，使用其他方法來(lái)制備包含基因修飾的非人動(dòng)物。此類方法 包括例如，修飾非ES細(xì)胞基因組（例如，成纖維細(xì)胞或誘導(dǎo)型多能細(xì)胞）和采用核轉(zhuǎn)移以 將所述經(jīng)修飾的基因組轉(zhuǎn)移至合適的細(xì)胞例如卵母細(xì)胞，和在合適的條件下在非人動(dòng)物中 孕育所述經(jīng)修飾的細(xì)胞（例如，經(jīng)修飾的卵母細(xì)胞）以形成胚胎。
[0091] 在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物為小型哺乳 動(dòng)物，例如跳鼠總科（Dipodoidea)或鼠總科（Muroidea)的小型哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述基因修飾動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠、大鼠和 倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哨齒動(dòng)物選自鼠總科。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因修飾 動(dòng)物來(lái)自選自下列的科：美倉(cāng)鼠科（Calomyscidae)(例如，美倉(cāng)鼠），倉(cāng)鼠科（Cricetidae) (例如，倉(cāng)鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠），鼠科（Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺鼠、冠 毛鼠），馬島鼠科（Nesomyidae)(攀鼠、巖鼠、白尾鼠、馬達(dá)加斯加大鼠和小鼠），刺睡鼠科 (Platacanthomyidae)(例如，刺睡鼠）和瞎鼠科（Spalacidae)(例如，瞎鼠、竹鼠和1?鼠）。 在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述基因修飾嚙齒動(dòng)物選自真小鼠或大鼠（鼠科）、沙鼠、刺鼠 和冠毛鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因修飾小鼠來(lái)自鼠科的成員。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠和大鼠。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述非人動(dòng)物為小鼠。
[0092] 在各種不同的實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物，所述嚙齒動(dòng)物為選 自 C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、 C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr 和 C57BL/01a 的 C57BL 品系的 小鼠。在另 Iv實(shí)施方案中，所述小鼠為選自下列品系的129品系：129P1、129P2、 129P3、129X1、129S1 (例如，129Sl/SV、129Sl/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、 129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(參見(jiàn)例如，F(xiàn)esting 等人（1999)Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836 ;還參見(jiàn) Auerbach 等人 (2000)Establishment and Chimera Analysis of129/SvEv-and C57BL/6_Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述基因修飾小鼠為前面提及 的129品系和前面提及的C57BL/6品系的雜交種。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述小鼠為 前面提及的那些129品系的雜交種，或前面提及的那些BL/6品系的雜交種。在一個(gè)特別的 實(shí)施方案中，所述雜交種的129品系為129S6(129/SvEvTa C)品系。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述小鼠為BALB品系，例如BALB/c品系。在Iv實(shí)施方案中，所述小鼠為BALB品系和另 一個(gè)前面提及的品系的雜交種。
[0093] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物為大鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述大鼠選自 Wistar 大鼠 、LEA 品系、Sprague Dawley 品系、Fischer 品系、F344、F6 和 Dark Agouti。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述大鼠品系為兩個(gè)或更多個(gè)選自下列的品系的雜交種：Wistar、LEA、 Sprague Dawley、Fischer、F344、F6 和 Dark Agouti〇
[0094] 提供了基因修飾非人動(dòng)物，其包含用人IL-7基因序列對(duì)非人IL-7基因序列進(jìn)行 的置換。提供了嚙齒動(dòng)物，其在內(nèi)源嚙齒動(dòng)物IL-7基因座處包含IL-7基因的人源化。用 于制備嚙齒動(dòng)物例如小鼠的方法，所述嚙齒動(dòng)物在內(nèi)源IL-7基因座處包含用人源化IL-7 基因或其片段（例如，包含一個(gè)或多個(gè)外顯子的片段）對(duì)內(nèi)源IL-7基因或其片段（例如， 包含一個(gè)或多個(gè)外顯子的片段）進(jìn)行的置換。提供了包含人源化基因的細(xì)胞、組織和小鼠， 以及從內(nèi)源非人IL-7基因座中表達(dá)人IL-7的細(xì)胞、組織和小鼠。本發(fā)明的人源化IL-7基 因的示例性的側(cè)翼基因組序列提供在SEQ ID NO: 1(5'側(cè)翼序列）和SEQ ID N0:2(3'側(cè)翼 序列）中。本發(fā)明的示例性的人IL-7基因提供在SEQ ID N0:3中。
[0095] IL-7是對(duì)于幼B和T細(xì)胞的發(fā)育來(lái)說(shuō)和在某種程度上對(duì)于成熟T細(xì)胞的發(fā) 育來(lái)說(shuō)必不可少的細(xì)胞因子；IL-7敲除小鼠展示出成熟B和T細(xì)胞的嚴(yán)重耗竭（von Freeden-Jeffry U.等人（1995) Lymphopenia in interleukin (IL) -7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a nonredundant cytokine, J. Exp. Med. 181:1519-1526) 〇 該耗竭顯 然是由于原B細(xì)胞和前B細(xì)胞之間的阻斷，以及T細(xì)胞增殖中的阻斷（而非T細(xì)胞分化 中的阻斷；在IL-7 KO小鼠中T細(xì)胞類型的比例是大致正常的），其導(dǎo)致降低的T細(xì)胞和 成熟B細(xì)胞群（同上）。IL-7在胸腺和腸中由上皮細(xì)胞產(chǎn)生，在角質(zhì)形成細(xì)胞、肝臟和樹(shù) 突細(xì)胞中產(chǎn)生一但不由正常的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生（例如在Fry T.J.和Mackall，C.L. (2002) Interleukin-7:from bench to clinic, Blood 99 (11) :3892-3904 中作了綜述）。
[0096] 簡(jiǎn)而言之，IL-7增加 T細(xì)胞數(shù)目并增強(qiáng)T細(xì)胞功能（參見(jiàn)例如Morrissey，J. J. (1991)Administration of IL-7 to normal mice stimulates B-Iymphopoiesis and peripheral lymphadenopathy, J. Tmmunol. 147:561-568 ；Faltynek, C. R.等人(1992) Administration of human recombinant IL-7 to normal and irradiated mice increases the numbers of lymphocytes and some immature cells of the myeloid lineage, J. Immunol. 149:1276-1282 ;Risdon，G.J.等人（1994)Proliferative and cytotoxic responses of human cord blood T lymphocytes following allegenic stimulation, Cell. Immunol. 154:14-24)。T細(xì)胞的功能增強(qiáng)可以通過(guò)短持續(xù)時(shí)間 的IL-7暴露來(lái)實(shí)現(xiàn)，而T細(xì)胞數(shù)目的增加反映了用較長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間暴露實(shí)現(xiàn)的增殖效 應(yīng)（Geiselhart，L.A.等人（2001)IL-7 Administration Alters the CD4:CD8 Ratio Increases T Cell Numbers, and Increases T Cell Function in the Absence of Activation, J. Immunol. 166:3019-3027 ;還參見(jiàn)，Tan J.T.等人（2001) IL-7 is critical for homeostatic proliferation and survival of naive T cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA98(15):8732-8737)。
[0097] IL-7對(duì)于早期和晚期T細(xì)胞調(diào)節(jié)兩者來(lái)說(shuō)均是必需的。IL-7不由T細(xì)胞表 達(dá)，后者必須遇到在外周由非胸腺細(xì)胞釋放并且據(jù)信對(duì)于外周T細(xì)胞增殖和維持負(fù) 責(zé)的 IL_7(例如在 Guimond，M(2005)Cytokine Signals in T-Cell Homeostasis，J. Immunother. 28 (4) : 289-294中作了綜述）。IL-7饑餓導(dǎo)致嚴(yán)重受損的T細(xì)胞發(fā)育和幼稚T 細(xì)胞的存活。IL-7還看起來(lái)對(duì)于成熟T細(xì)胞的存活來(lái)說(shuō)是必需的；當(dāng)小鼠缺乏IL-7基因時(shí)， 通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移入IL-7缺陷型小鼠中而獲得的成熟T細(xì)胞進(jìn)入凋亡，但在缺乏IL-7R基因的 表達(dá) IL-7 的小鼠中則不是這樣（Schluns，K.S.等人（2000) Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo, Nat. Immunol. I (5) :426-432) 〇 IL-7功能的喪失在小鼠中導(dǎo)致SCID-樣表型（Puel, A.和Leonard, W.J. (2000)Mutations in the gene for the IL-7 receptor result in T(-)B(+)NK(+)severe combined immunodeficiency disease, Curr. Opin. Tmmunol. 12:468-473)，據(jù)推測(cè)這歸因于通過(guò)在 IL-7刺激不存在下可能由糖酵解不足介導(dǎo)的降低的生長(zhǎng)速率而引起的T細(xì)胞萎縮和死 亡（Jacobs, S. R.等人（2010) IL-7 Is Essential for Homeostatic Control of T Cell Metabolism In Vivo, J. Immunol. 184:3461-3469)。
[0098] 人IL-7基因包含6個(gè)外顯子（其延伸達(dá)到33 kb)并且位于染色體8上于 8ql2_13處。小鼠 IL-7包含5個(gè)外顯子（在小鼠中不存在相對(duì)于人外顯子5的對(duì)應(yīng)物） 并且與人基因大約80%同源；人和小鼠基因的非編碼序列的分析揭示了少量的對(duì)基因表 達(dá)的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控負(fù)責(zé)的可識(shí)別的調(diào)控基序（Lupton，S.D.等人（1990)Characterization of the Human and Murine IL-7 Genes, J. Immunol. 144 (9) :3592-3601)，這暗不 IL-7 表 達(dá)的調(diào)控可能是復(fù)雜的。但是，已經(jīng)在小鼠中表達(dá)了在hIL-7基因座處包含報(bào)道基因的 小鼠 BAC片段，從而成功地查明在小鼠中IL-7的表達(dá)圖式（參見(jiàn)例如，Avles，N.L.等人 (2009)Characterization of the thymic IL-7 niche in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(5):1512-1517 ；Mazzucchelli, R. I. (2009)Visualization and Identification of IL-7 Producing Cells in Reporter Mice，PLoS ONE 4(11) :e7637;Repas，J.F.等人 (2009)IL7_hCD25 and IL7_Cre BAC transgenic mouse lines:new tools for analysis of IL-7 expressing cells, Genesis 47:281-287)。在至少一種情況下，用報(bào)道基因?qū)?IL-7外顯子進(jìn)行基于BAC的置換需要整個(gè)43 kb IL-7基因座以及96 kb的5'側(cè)翼序列和17 kb的3'側(cè)翼序列，以期忠實(shí)地重演野生型小鼠的IL-7表達(dá)（Itepass，J. F.等人（2009))。無(wú) 論如何，來(lái)自關(guān)于由推定的IL-7調(diào)控元件驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因表達(dá)的不同研究的數(shù)據(jù)在相互 之間以及相對(duì)于較早的觀察結(jié)果稍微有些變化，從而支持了這樣的推論：IL_7調(diào)控在這些 報(bào)道基因小鼠中可能未被忠實(shí)地重演（IL-7報(bào)道基因轉(zhuǎn)基因小鼠在Kim，G.Y.等人（2011) Seeing Is Believing:Illuminating the Source of In Vivo Interleukin-7, Immune Network 11(1) :1-10中作了綜述）。人IL-7對(duì)于小鼠細(xì)胞是有功能的，但小鼠 IL-7對(duì)于 人細(xì)胞卻不是有功能的。
[0099] 表達(dá)異常地或差地被調(diào)節(jié)的人IL-7的轉(zhuǎn)基因小鼠展現(xiàn)出眾多病理學(xué)狀態(tài)或綜 合征。對(duì)于鼠類IL-7 cDNA(其處于小鼠 Ig重鏈增強(qiáng)子、κ輕鏈增強(qiáng)子和輕鏈啟動(dòng)子 的控制之下，以靶向在淋巴區(qū)室中的表達(dá)）而言轉(zhuǎn)基因的小鼠展現(xiàn)出顯著增高的B細(xì)胞 前體數(shù)目以及胸腺中所有亞群的胸腺細(xì)胞和外周T細(xì)胞的全面擴(kuò)展（Samaridis，J.等 人(1991)Development of lymphocytes in interleukin 7-transgenic mice, Eur. J. Tmmunol. 21:453-460)。
[0100] 從處于SRa啟動(dòng)子的控制之下的小鼠 cDNA來(lái)表達(dá)IL-7的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)展出眾 多病理學(xué)狀態(tài)，包括慢性結(jié)腸炎，其在組織病理學(xué)上模仿人的慢性結(jié)腸炎，并且其特征至少 為在結(jié)腸粘膜淋巴細(xì)胞（但不是結(jié)腸上皮細(xì)胞）中IL-7的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)以及IL-7在結(jié)腸 粘膜杯形細(xì)胞的粘液中的明顯積累（Watanabe，M.等人（1998) Interleukin 7Transgenic Mice Develop Chronic Colitis with Decreased Interleukin7 Protein Accumulation in the Colonic Mucosa，J. Exp Med. 187 (3) :389-402 ;Takebe，Y.等人（1988) sR alpha promoter:an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type I long terminal repeat, Mol. Cell Biol. 8 (I) : 466-472) 〇 在轉(zhuǎn) 基因小鼠中由相同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的小鼠 IL-7的組成型表達(dá)也發(fā)展出嚴(yán)重皮炎，其特征在 于十分明顯的變形和大多數(shù)為T(mén)CRT^細(xì)胞的單核細(xì)胞的大量真皮浸潤(rùn)（Uehira，M.等 人，The development of dermatitis infiltrated by jd T cells in IL-7 transgenic mice, Inti. Immunol. 5(12) :1619-1627)。表達(dá)由鼠類重鏈啟動(dòng)子和增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的鼠 類IL-7 cDNA的轉(zhuǎn)基因小鼠也展現(xiàn)出皮炎和進(jìn)入真皮的淋巴組織增生，但據(jù)報(bào)道其涉及 TCRa β細(xì)胞和表達(dá)Thy-Ι、⑶3和⑶5但缺乏⑶4和⑶8的細(xì)胞（⑶4+/⑶8+胸腺細(xì)胞 實(shí)質(zhì)上從這些轉(zhuǎn)基因小鼠中缺失）；這些小鼠也發(fā)展出B和T細(xì)胞淋巴瘤，據(jù)推測(cè)其與在 這些小鼠中觀察到的延長(zhǎng)的淋巴組織增生相關(guān)（參見(jiàn)，Rich, Β.Ε.等人（1993)Cutaneous lymphoproliferation and lymphomas in interleukin 7 transgenic mice, J. Exp. Med. 177:305-316)。
[0101] IL-7基因的失調(diào)與各種各樣的病理學(xué)狀態(tài)相關(guān)。表達(dá)處于II類MHC Ea啟動(dòng)子 的控制之下的轉(zhuǎn)基因小鼠 IL-7的小鼠高度傾向于淋巴樣腫瘤（參見(jiàn)例如，F(xiàn)isher, A.G.等 人(1995)Lymphoproliferative disorders in IL-7 transgenic mice: expansion of immature B cells which retain macrophage potential, Int. Tmmunol · 7(3):414-423 ;還 參見(jiàn)，Ceredig, R.等人（1999)Effect of deregulated IL-7 transgene expression on B lymphocyte development in mice expressing mutated pre_B cell receptors, Eur. J. Immunol. 29 (9) : 2797-2807)。T細(xì)胞大小在轉(zhuǎn)基因小鼠中也更大，并且觀察到多克隆 T細(xì)胞擴(kuò)展（占優(yōu)勢(shì)地，⑶8+，這表明在這些小鼠中被擾亂的調(diào)節(jié)）（Mertsching, E.等 人，IL_7transgenic mice:analysis of the role of IL-7 in the differentiation of thymocytes in vivo and in vitro, Inti. Immunol. 7(3) :401-414)。其他通過(guò) II 類 MHC Ea啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)mIL-7(大約25-50倍）的轉(zhuǎn)基因小鼠看起來(lái)是總體上健康的（如果沒(méi) 有低的B細(xì)胞腫瘤發(fā)病率的話），并且展現(xiàn)出相對(duì)于野生型小鼠而言10-20倍的T細(xì)胞數(shù) 目增加，其特征在于大數(shù)目的CD8+細(xì)胞，所述CD8+細(xì)胞還是CD44 hi和CD122hi的（Ki印er ff. C.等人（2002) Overexpression of Interleukin (IL) -7Leads to IL-15-independent Generation of Memory Phenotype CD8+T Cells, J. Exp. Med. 195(12):1533-1539)。
[0102] 從處于II類MHC E α啟動(dòng)子的控制之下的cDNA來(lái)組成性地表達(dá)小鼠 IL-7的小 鼠選擇性地?cái)U(kuò)展IL-7-應(yīng)答性早期B細(xì)胞，并且是包含原B細(xì)胞和前B細(xì)胞的腫瘤的良好 來(lái)源。表達(dá)由人K14啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的IL-7的小鼠發(fā)展出淋巴組織增生性應(yīng)答，其導(dǎo)致類似于 脫發(fā)的皮膚的T細(xì)胞浸潤(rùn)。
[0103] 對(duì)于IL-7R而言轉(zhuǎn)基因的小鼠展示出在胸腺中雙陰性（CD4-CD8-)前體細(xì)胞的大 量減少，據(jù)推測(cè)這歸因于在該轉(zhuǎn)基因小鼠中大數(shù)目的雙陽(yáng)性胸腺細(xì)胞耗竭了 IL-7,這暗示 IL-7水平必須受到精巧的控制以促進(jìn)正常的胸腺細(xì)胞發(fā)育（參見(jiàn)例如，Malek，T. R. (2004) IL-7:a limited resource during thymopoiesis, Blood, 104(13):2842)〇
[0104] 早在克隆人IL-7時(shí)，就已經(jīng)知道人IL-7可以誘導(dǎo)鼠類前B細(xì)胞的增殖 (Goodwin, R. G.等人(1989)Human interleukin 7:Molecular cloning and growth factor activity on human and murine B-Iineage lines,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86:302-306)。盡管在某些慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中表達(dá)，但小鼠 IL-7在植入到 小鼠中的腫瘤細(xì)胞之中的表達(dá)誘導(dǎo)炎癥和降低的致瘤性，然而矛盾的是，對(duì)于IL-7而 言轉(zhuǎn)基因的小鼠傾向于淋巴瘤（在Foss, H.-D.等人（1995)Frequent Expression of IL-7 Gene Transcripts in Tumor Cells of Classical Hodgkin' s Disease, Am. J. Pathol. 146(1) :33-39中作了綜述）。因此，希望獲得以在生理學(xué)上適當(dāng)?shù)姆绞綇膬?nèi)源小 鼠 IL-7基因座中表達(dá)人IL-7(而非小鼠 IL-7)的小鼠，特別是但不限于包含人或小鼠腫瘤 (例如，淋巴細(xì)胞腫瘤）的小鼠。
[0105] 以在生理學(xué)上適當(dāng)?shù)姆绞奖磉_(dá)人IL-7的小鼠對(duì)于在小鼠中的人實(shí)體瘤異種移植 物模型之中評(píng)價(jià)推定的治療劑（包括人IL-7及其類似物）的抗腫瘤特性來(lái)說(shuō)也是有用的。 例如，向SCID小鼠植入HT29人結(jié)腸腺癌并在各種各樣的條件下（例如，除去幼稚T細(xì)胞 和添加人T細(xì)胞；添加重組人IL-7 ;等等）進(jìn)行了測(cè)試（參見(jiàn)，Murphy，W. J.等人（1993) Antitumor Effects of Interleukin-7 and Adoptive Immunotherapy on Human Colon Carcinoma Xenografts, J. Clin. Invest. 92:1918-1924)。那個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與人 T 細(xì)胞一 起施用時(shí)，人IL-7導(dǎo)致比在人IL-7不存在下顯著延長(zhǎng)的存活（同上）。
[0106] 因此，表達(dá)人IL-7的小鼠，特別是能夠支持異種移植物（例如，人腫瘤）的小鼠， 例如免疫缺陷小鼠，具有特定的和充分確立的功用。已顯示IL-7信號(hào)傳導(dǎo)在體外和體內(nèi) 對(duì)于人T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL)的發(fā)展和存活來(lái)說(shuō)是必需的（Touw，I.等人 (1990)Interleukin-7 is a growth factor of precursor B and T acute lymphoblastic leukemia. Blood 75, 2097 - 2101)。T-ALL是一種具有差的預(yù)后的侵襲性血液學(xué)癌癥；對(duì)于 驅(qū)動(dòng)T-ALL細(xì)胞的增殖和存活的機(jī)制的理解依然是相對(duì)貧乏的，這是由于缺乏可以支持源 自患者的腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)的異種移植物模型。因此，表達(dá)人IL-7的免疫缺陷動(dòng)物可以充當(dāng) 無(wú)價(jià)的體內(nèi)系統(tǒng)，以用于測(cè)試針對(duì)此類與T細(xì)胞相關(guān)的惡性腫瘤的藥物組合物，例如，測(cè)試 藥物組合物在表達(dá)人IL-7并且具有植入的源自T細(xì)胞的腫瘤的小鼠中靶向由IL-7介導(dǎo)的 信號(hào)傳導(dǎo)的功效，其中所述腫瘤需要IL-7信號(hào)傳導(dǎo)以用于發(fā)展和存活。 實(shí)施例
[0107] 實(shí)施例1.使小鼠 IL-7基因座人源化
[0108] 使用VELOC丨GENE?基因工程技術(shù)，修飾ES細(xì)胞以在內(nèi)源小鼠 IL-7基因 座處用人IL-7基因序列置換小鼠 IL-7基因（在小鼠 IL-7調(diào)控元件的控制之下），從而產(chǎn) 生在圖1中所顯示的人源化基因座。
[0109] 革巴向構(gòu)建體。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的BHR技術(shù)（參見(jiàn)，Valenzuela等人（2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 (6) :652-659)來(lái)進(jìn)行細(xì)菌同源重組（BHR)，以構(gòu) 建用于靶向小鼠 IL-7基因座的包含人IL-7基因的大的靶向載體（LTVEC)。通過(guò)下述方式 來(lái)產(chǎn)生線性片段：將經(jīng)PCR產(chǎn)生的同源盒與經(jīng)克隆的盒相連接，隨后對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行凝膠 分離，和將其電穿孔入擁有靶細(xì)菌人工染色體（BAC)的符合BHR要求的細(xì)菌中。小鼠 BAC bMQ-271gl8用作小鼠序列的來(lái)源；人BAC RP11-625K1用作人序列的來(lái)源。在選擇步驟之 后，通過(guò)越過(guò)新接頭的PCR和通過(guò)限制性酶切分析來(lái)鑒定正確重組的克隆。制備出包含同 源性臂和人IL-7基因序列的大的靶向載體（LTVEC)。小鼠 ES細(xì)胞用LTVEC構(gòu)建體進(jìn)行電 穿孔，使其在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并將其用作供體ES細(xì)胞以制備人源化IL-7小鼠。
[0110] 通過(guò)下述方式來(lái)修飾小鼠 IL-7基因（小鼠 Gene ID:96561 ;Ref Seq轉(zhuǎn)錄 物：NM_00837L4):刪除外顯子 2 至 5(刪除坐標(biāo) NCBIM37:ch3:7604650-7573021 ;負(fù)鏈）， 并用人 IL_7(Entrez Gene ID:6023;Ref Seq 轉(zhuǎn)錄物 ΝΜ_000880·3)外顯子 2 至 6 置換它們 (置換坐標(biāo)GRCh37Lch*: 79711168-79644608 ;負(fù)鏈）。人基因組IL-7序列提供在SEQ ID N0:3中（NC#166E2F2)。小鼠基因組IL-7基因座是已知的，并且被報(bào)道為41，351nt序列， 以登錄號(hào)NC0000696 (通過(guò)提及而合并入本文）；小鼠 IL-7基因組座位的相關(guān)的5'和3'序 列提供在SEQ ID NO: 1(5'側(cè)翼）和SEQ ID N0:2 (3,側(cè)翼）中。
[0111] 包含人源化IL-7基因的LTVEC具有在上游側(cè)翼有著NotI位點(diǎn)的48kb上游小鼠 靶向臂，和在下游側(cè)翼有著NotI位點(diǎn)的77kb下游小鼠靶向臂。將LTVEC用NotI進(jìn)行線性 化以用于電穿孔。
[0112] 在構(gòu)建了 LTVEC之后，獲得越過(guò)小鼠/人5'接頭的LTVEC的核苷酸序列，其從 5 '（小鼠）至3 '（人）包括下述序列（其中小鼠/人接頭核苷酸在括號(hào)中）：5 '-TGCAAGCACC AAAAAGGTGA CCACACTTCA CATTGGCGAT CGC (GG)GTTTC TATCTGAGGA TGTGAATTTA TTTACAGA-3' （SED ID N0:4)。
[0113] 測(cè)定了越過(guò)人插入物和盒的5'末端的接頭的LTVEC的核苷酸序列（參見(jiàn)圖1)， 并且其包括從5'至3'具有人序列/限制性酶切位點(diǎn)/Ioxp/盒序列的下述序列（其中人 序列/限制性酶切位點(diǎn)接頭核苷酸在括號(hào)中）：5'_GTTATGTGCT GATGGGCTTT ATTTGATCTA CAGAAGATGC TCTGGTGACA CCCTCAGTGT GTGTTGGTAA CACCTTCCTG(CC)TCGAGATA ACTTCGTATA ATGTATGCTA TACGAAGTTA TATGCATGGC CTCCGCGCCG GGTTTTGGCG CC-3' （SEQ ID N0:5)。
[0114] 測(cè)定了越過(guò)盒的末端和小鼠序列的開(kāi)頭部分的接頭的LTVEC的核苷酸序列，并且 其包括從5'至3'具有盒序列/限制性酶切位點(diǎn)/小鼠序列的下述序列（其中接頭核苷酸在 括號(hào)中）：5，_GTATGCTATA CGAAGTTATG CTAGTAACTA TMCGGTCCT AAGGTAGCGA GCTAG (CC) CAA TTGCGTACTT TGGATAGTGT CTCTTTTTAA CCTAAATGAC CTTTATTAAC ACTGTCAGGT TCCCTTACTC TCGAGAGTGT TCATTGCTGC ACT-3' （SEQ ID N0:6)。
[0115] 在對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行電穿孔之后，進(jìn)行天然等位基因損失測(cè)定法（參見(jiàn)例如， Valenzuela等人（2003))，以檢測(cè)由于靶向而引起的內(nèi)源IL-7序列的損失。引物對(duì)、片 段大小和TAQMAN?探針顯示在表1中。Cl探針在核苷酸9, 635-9, 664處結(jié)合小鼠 IL-7 基因組序列（NC0000696) ;C2探針在核苷酸39, 793-39, 825處結(jié)合小鼠 IL-7基因組序列 (NC0000696)。對(duì)于等位基因增長(zhǎng)測(cè)定法，C3探針在核苷酸29, 214-29, 242處結(jié)合人IL-7 基因組序列（NC#166E2F2)。
[0116] 表LLTVEC引物和探針
[0117]
【權(quán)利要求】
1. 基因修飾非人動(dòng)物，其在其種系中包含用至少一個(gè)人IL-7外顯子對(duì)至少一個(gè)非人 IL-7外顯子進(jìn)行的置換，從而形成編碼人或人源化IL-7的基因，其中所述置換位于內(nèi)源非 人IL-7基因座處，其中所述編碼人或人源化IL-7的基因處于內(nèi)源非人調(diào)控元件的控制之 下。
2. 權(quán)利要求1的基因修飾非人動(dòng)物，其為嚙齒動(dòng)物。
3. 權(quán)利要求2的基因修飾嚙齒動(dòng)物，其中所述嚙齒動(dòng)物選自大鼠和小鼠。
4. 權(quán)利要求2的基因修飾嚙齒動(dòng)物，其中所述編碼人或人源化IL-7的基因包含選自下 列的人外顯子：人外顯子1、人外顯子2、人外顯子3、人外顯子4、人外顯子5、人外顯子6及 其組合。
5. 權(quán)利要求4的基因修飾嚙齒動(dòng)物，其中所述編碼人或人源化IL-7的基因包含不多于 五個(gè)人外顯子。
6. 權(quán)利要求3的基因修飾嚙齒動(dòng)物，其中所述嚙齒動(dòng)物為小鼠，并且所述經(jīng)修飾的基 因座包含用包含人IL-7外顯子2、3、4、5和6的人基因組區(qū)段對(duì)小鼠外顯子2、3、4和5進(jìn) 行的置換。
7. 權(quán)利要求1的基因修飾非人動(dòng)物，其中所述編碼人或人源化IL-7的基因包含編碼人 或人源化IL-7蛋白的cDNA。
8. 在其種系中包含轉(zhuǎn)基因的基因修飾非人動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因包含編碼人或人源化 IL-7基因的核酸序列，其中所述人或人源化IL-7基因在上游和下游在側(cè)翼與內(nèi)源非人調(diào) 控序列相接。
9. 權(quán)利要求8的基因修飾非人動(dòng)物，其為嚙齒動(dòng)物。
10. 權(quán)利要求9的嚙齒動(dòng)物，其選自小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。
11. 權(quán)利要求8的基因修飾非人動(dòng)物，其中所述人或人源化IL-7基因包含選自下列的 人外顯子：人外顯子1、人外顯子2、人外顯子3、人外顯子4、人外顯子5、人外顯子6及其組 合。
12. 權(quán)利要求11的基因修飾非人動(dòng)物，其中所述人或人源化IL-7基因包含至少五個(gè)人 外顯子。
13. 用于制備具有編碼人或人源化IL-7的基因的非人動(dòng)物的方法，所述方法包括修飾 所述非人動(dòng)物的種系以包含編碼人或人源化IL-7的基因，該編碼人或人源化IL-7的基因 在上游和下游在側(cè)翼與內(nèi)源非人IL-7調(diào)控序列相接。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述修飾位于內(nèi)源非人IL-7基因座處。
15. 權(quán)利要求13的方法，其中所述非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。
17. 基因修飾非人動(dòng)物，其進(jìn)行了基因修飾從而以與對(duì)于相同屬和種的野生型非人動(dòng) 物所觀察到的表達(dá)圖式相同的表達(dá)圖式來(lái)表達(dá)人IL-7。
18. 權(quán)利要求17的基因修飾非人動(dòng)物，其中在所述非人動(dòng)物中表達(dá)的人IL-7的水平與 在相應(yīng)的野生型小鼠中非人IL-7的水平大致相同。
19. 權(quán)利要求17的基因修飾非人動(dòng)物，其為嚙齒動(dòng)物。
20. 權(quán)利要求18的基因修飾非人動(dòng)物，其為嚙齒動(dòng)物。
21. 人源化IL-7基因座，其包含非人IL-7外顯子1、人IL-7外顯子2、人IL-7外顯子 3、人IL-7外顯子4、人IL-7外顯子5和人IL-7外顯子6。
22. 權(quán)利要求21的人源化IL-7基因座，其中所述人源化IL-7基因座進(jìn)一步包含位于 非人IL-7外顯子1和人IL-7外顯子6側(cè)翼的5'和3'非人IL-7非翻譯區(qū)。
23. 權(quán)利要求21或22的人源化IL-7基因座，其中所述人源化IL-7基因座包含與非人 3'非翻譯區(qū)鄰接的3'人非翻譯區(qū)或其部分。
24. 權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的人源化IL-7基因座，其中所述人源化IL-7基因座包含 5'非人IL-7非翻譯區(qū)或其部分，和非人IL-7外顯子1，其與人IL-7外顯子2鄰接。
25. 權(quán)利要求21-24中任一項(xiàng)的人源化IL-7基因座，其中所述人源化IL-7基因座包含 圖1中所示的結(jié)構(gòu)。
26. 包含權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的人源化IL-7基因座的細(xì)胞。
27. 權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞。
28. 分離自權(quán)利要求1-12和17-20中任一項(xiàng)的非人動(dòng)物的細(xì)胞或組織。
29. 權(quán)利要求28的細(xì)胞或組織，其中所述組織選自胸腺組織、脾組織、表皮組織和腸組 織。
30. 權(quán)利要求29的細(xì)胞或組織，其中所述組織為胸腺組織。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK104378976SQ201380031333
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月18日
【發(fā)明者】A·J·莫菲 申請(qǐng)人:瑞澤恩制藥公司