一種復(fù)合微生物肥料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種復(fù)合微生物肥料的制備方法，步驟如下：將桔黃假單胞菌JD37菌或熒光假單胞菌P13接種入液體培養(yǎng)基中，28℃下200r/min振蕩培養(yǎng)16～20小時(shí)；離心后取菌體，與滅菌的保護(hù)劑溶液懸浮，混合均勻，得到懸浮菌液；將懸浮菌液與滅菌的基質(zhì)混合，基質(zhì)與懸浮菌液的質(zhì)量體積比為1～2g/ml；將混合過(guò)菌懸液的基質(zhì)與滅菌的市售蚯蚓糞按質(zhì)量比1:1混合。本發(fā)明組合了兩株植物根際促生細(xì)菌，既能促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)，又能防治一些植物病原菌；提供了一種適合本發(fā)明的復(fù)合保護(hù)劑，效果比單一保護(hù)劑的效果更加顯著；選用了一種成本低廉、易獲取的基質(zhì)，不僅不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染和危害，而且能提高土壤品質(zhì)。
【專利說(shuō)明】一種復(fù)合微生物肥料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種復(fù)合微生物肥料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]為了追求高產(chǎn)量，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)采用化肥作為農(nóng)作物的肥力來(lái)源，而在長(zhǎng)期使用化肥的過(guò)程中所呈現(xiàn)的問(wèn)題也變得越來(lái)越突出。主要有三個(gè)方面:第一，制造化肥的礦物原料及化工原料中，含有多種重金屬放射性物質(zhì)和其它有害成分，它們隨施肥進(jìn)入農(nóng)田土壤造成重金屬污染。第二，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量施用化肥，使氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素大量進(jìn)入水體，引起水體富營(yíng)養(yǎng)化，造成化肥對(duì)地表水的非點(diǎn)源污染。據(jù)估計(jì)，沉入河、湖的氮素約有60%來(lái)自化肥。第三，長(zhǎng)期使用化肥會(huì)起土壤酸化和板結(jié)，導(dǎo)致土壤肥力下降。據(jù)調(diào)查，由于長(zhǎng)年施用化肥，華北平原土壤有機(jī)質(zhì)已降到1%左右，全氮含量不到0.1%，在東北三江平原，多年重用輕養(yǎng)，使土壤有機(jī)質(zhì)的含量從10%~11.5%下降到3%~5%。通過(guò)以上數(shù)據(jù)，說(shuō)明長(zhǎng)期使用化肥已經(jīng)對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量造成了巨大的負(fù)面影響。
[0003]植物根際促生菌是一類生活在植物根際并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益微生物，這類細(xì)菌能合成某種化合物供植物利用，包括分泌有機(jī)酸把土壤中難溶解的無(wú)效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，使其能夠被植物吸收和利用；自生固氮；分泌植物激素；通過(guò)分泌鐵載體供給植物生長(zhǎng)過(guò)程中所需的鐵營(yíng)養(yǎng)；通過(guò)合成ACC脫氨酶能夠調(diào)控植物乙烯水平。同時(shí)，植物根際促生菌也具有生物防治的功能，能夠通過(guò)抑制或減輕某些植物病蟲(chóng)害對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育造成的不良影響，如產(chǎn)生抗生素抑制植物病原菌的生長(zhǎng)繁殖，與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)根際生態(tài)位；誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗性等方式抑制植物病害。由此可見(jiàn)，植物根際促生菌不僅能促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)，還能有效地控制農(nóng)作物病害。
[0004]微生物的生長(zhǎng)需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而蚯`蚓糞富含有機(jī)質(zhì)，并且具有很好的孔性、通氣性、排水性和高的持水量，蚯蚓糞有很大的表面積，使得許多有益微生物得以生存并具有良好的吸收和保持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，同時(shí)經(jīng)過(guò)蚯蚓消化，有益于蚯蚓糞中水穩(wěn)性團(tuán)聚體的形成，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵處理的蚯蚓糞有機(jī)肥具有合理的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)以及孔隙度，通氣性好，保水力強(qiáng)，能夠提高作物抗旱性能，改善根際土壤的通氣性，保水透氣能力比一般土壤提高3倍，施過(guò)蚯蚓糞的農(nóng)田土質(zhì)松軟，比施用其它肥料根系發(fā)達(dá)。所以，發(fā)明一種植物根際促生細(xì)菌與蚯蚓糞相結(jié)合的復(fù)合微生物肥料對(duì)于保護(hù)土壤環(huán)境、促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于利用桔黃假單胞菌JD37 (CGMCC N0.7099)、熒光假單胞菌P13(CCTCC AB209102)，提供一種復(fù)合微生物肥料的制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0007]一種復(fù)合微生物肥料的制備方法，具體實(shí)施步驟如下:
[0008](1)將桔黃假單胞菌JD37菌或熒光假單胞菌P13接種入液體培養(yǎng)基中，放置搖床中28°C下200r/min振蕩培養(yǎng)16~20小時(shí)；離心后取菌體，與滅菌的0.01wt%~10.00wt%保護(hù)劑溶液懸浮，混合均勻，得到懸浮菌液；
[0009]液體培養(yǎng)基為KB培養(yǎng)基；
[0010]離心條件為0~10°C，優(yōu)選4°C，8000~lOOOOrpm離心15~20分鐘；
[0011]保護(hù)劑優(yōu)選配方和濃度為0.lwt%的海藻酸鈉、1(^丨％的甘油和0.lwt%的羧甲基纖維素鈉；
[0012]菌體的液體培養(yǎng)基與助劑溶液體積比為10~20:1，即:平均每10~20毫升菌液離心后得到的桔黃假單胞菌JD37菌體，與1毫升保護(hù)劑溶液混合制備懸浮菌液。
[0013](2)將懸浮菌液與滅菌的基質(zhì)混合，基質(zhì)與懸浮菌液的體積質(zhì)量比為1~2g/ml，優(yōu)選為lg/ml?；|(zhì)可選用草炭土(市售)。
[0014]基質(zhì)使用碳酸韓調(diào)整pH值至6.0~8.0,使用研磨機(jī)將基質(zhì)研磨成粉末后振蕩過(guò)直徑為0.3mm標(biāo)準(zhǔn)篩。
[0015]基質(zhì)滅菌條件為121 °C , 20~30min,兩次。
[0016]混合方法為:將菌懸液與基質(zhì)攪拌后，自然風(fēng)干。
[0017](3)將混合過(guò)菌懸液的草炭土粉末與滅過(guò)菌的蚯蚓糞(市售)混合，混合比為1:1(M:M)。
[0018]使用研磨機(jī)將蚯蚓糞研磨成粉末后振蕩過(guò)直徑為2.0mm標(biāo)準(zhǔn)篩。
[0019]蚯蚓糞滅菌條件為121°C，20~30min，兩次。
[0020]通過(guò)上述方法制備的復(fù)合微生物肥料可用于實(shí)際生產(chǎn)，活菌數(shù)含量高，保存期限長(zhǎng)，菌體釋放能力強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分，既可促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，又能防治植物病原菌。
[0021]本發(fā)明有以下特點(diǎn):
[0022](1)組合了兩株植物根際促生細(xì)菌:
[0023]研究資料表明，桔黃假單胞菌JD37能夠分泌植物生長(zhǎng)激素IAA，能被誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶，具有溶磷活性；對(duì)植物有較好的促生作用；而熒光假單胞菌是報(bào)道較多的一類生防菌株。本發(fā)明中使用到的熒光假單胞菌P13對(duì)油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、番爺灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)和玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)均有明顯的拮抗作用。將這兩株菌種聯(lián)合使用既能促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)，又能防治一些植物病原菌。
[0024](2)研制了一種適合本發(fā)明的復(fù)合保護(hù)劑:
[0025]保護(hù)劑對(duì)菌劑的保存期限影響很大，它不僅影響菌劑中菌體的存活率，也影響保藏期間菌體的穩(wěn)定性，同時(shí)保護(hù)劑可以改變菌體的物理化學(xué)環(huán)境，減輕或防止干燥對(duì)菌體的損害，盡可能保持菌體原有的各種生理生化特性和生物活性。研究資料表明，復(fù)合保護(hù)劑的保護(hù)效果往往比單一保護(hù)劑的效果更加顯著；根據(jù)之前的研究結(jié)果表明，甘油，海藻酸鈉，羧甲基纖維素鈉對(duì)菌體均有一定的保護(hù)作用，在此基礎(chǔ)上研制出了一款復(fù)合保護(hù)劑。
[0026](3)選用了一種成本低廉、易獲取的基質(zhì):
[0027]草炭土是一種經(jīng)過(guò)幾千年所形成的天然沼澤地產(chǎn)物，具有無(wú)毒、無(wú)污染，通氣性能好，質(zhì)輕、持水、保肥的特性，并且有利于微生物活動(dòng)，增強(qiáng)生物性能，營(yíng)養(yǎng)豐富，并含有很高的有機(jī)質(zhì)，腐殖酸及營(yíng)養(yǎng)成份。使用該材料作為基質(zhì)，應(yīng)用于大田中不僅不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染和危害，而且能提高土壤品質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1
[0029](1)將研磨過(guò)的草炭土粉末按9:1 (M:M)加入碳酸鈣后進(jìn)行高壓(1.034X 105Pa)滅菌兩次(12rC，30min)，烘干備用；
[0030](2)將研磨過(guò)的蚯蚓糞進(jìn)行高壓(1.034父10^)滅菌兩次(1211:，301^11)，烘干備用；
[0031](3)制備液體培養(yǎng)基:蛋白胨 20g、甘油 10mL、Κ2ΗΡ041.5g、MgS04.7Η201.5g、去離子水1L,混合后121°C滅菌20min ；
[0032](4)配制保護(hù)劑溶液:0.5wt%的海藻酸鈉、15wt%的甘油和0.lwt%的羧甲基纖維素鈉；去離子水1L, 121°C滅菌20min后常溫保存；
[0033](5)挑取桔黃假單胞菌JD37單菌落至50mL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)18h后，按1%接種量取10mL發(fā)酵液于lOOOmL新鮮液體KB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(28°C , 200rpm, 18h),在無(wú)菌條件下，將發(fā)酵液在lOOOOrpm下離心20min,去除上清液，用lOOmL保護(hù)劑溶液輕輕吹打使之充分懸??；
[0034](6)將lOOmL菌懸液與100g滅菌過(guò)的草炭土粉末混勻后吹干；然后與滅過(guò)菌的100g蚯蚓糞混勻，裝入塑封袋中保存。
[0035]實(shí)施例2
[0036](1)將研磨過(guò)的草炭土粉末按9:1 (M:M)加入碳酸鈣后進(jìn)行高壓(1.034X 105Pa)滅菌兩次(12rC，30min)，烘干備用；
[0037](2)將研磨過(guò)的蚯蚓糞進(jìn)行高壓(1.034父10^)滅菌兩次(1211:，301^11)，烘干備用；
[0038](3)制備液體培養(yǎng)基:蛋白胨 20g、甘油 10mL、Κ2ΗΡ041.5g、MgS04.7Η201.5g、去離子水1L,混合后121°C滅菌20min ；
[0039](4)配制保護(hù)劑溶液:0.5wt%的海藻酸鈉、15wt%的甘油和0.lwt%的羧甲基纖維素鈉；去離子水1L, 121°C滅菌20min后常溫保存；
[0040](5)挑取熒光假單胞菌P13單菌落至50mL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)20h后，按1%接種量取10mL發(fā)酵液于1000mL新鮮液體KB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(28°C，200rpm, 20h),在無(wú)菌條件下，將發(fā)酵液在lOOOOrpm下離心20min,去除上清液,用lOOmL保護(hù)劑溶液輕輕吹打使之充分懸??；
[0041](6)將lOOmL菌懸液與100g滅菌過(guò)的草炭土粉末混勻后吹干；然后與滅過(guò)菌的100g蚯蚓糞混勻，裝入塑封袋中保存。
[0042]實(shí)施例3
[0043](1)將研磨過(guò)的草炭土粉末按9:1 (M:M)加入碳酸鈣后進(jìn)行高壓(1.034X 105Pa)滅菌兩次(12rC，30min)，烘干備用；
[0044](2)將研磨過(guò)的·蚯蚓糞進(jìn)行高壓(1.034父10^)滅菌兩次(1211:，301^11)，烘干備用；
[0045](3)制備液體培養(yǎng)基:蛋白胨 20g、甘油 10mL、Κ2ΗΡ041.5g、MgS04.7Η201.5g、去離子水1L,混合后121°C滅菌20min ；
[0046](4)配制保護(hù)劑溶液:0.5wt%的海藻酸鈉、15wt%的甘油和0.lwt%的羧甲基纖維素鈉；去離子水1L, 121°C滅菌20min后常溫保存；
[0047](5)挑取桔黃假單胞菌JD37單菌落至50mL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)18h，挑取熒光假單胞菌P13單菌落至50mL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)20h后分別按1%接種量取10mL發(fā)酵液于lOOOmL新鮮液體KB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(28°C，200rpm),在無(wú)菌條件下，將發(fā)酵液在lOOOOrpm下離心20min,去除上清液,分別用100mL保護(hù)劑溶液輕輕吹打使之充分懸??；
[0048](6)將200mL菌懸液與200g滅菌過(guò)的草炭土粉末混勻后吹干；然后與滅過(guò)菌的200g蚯蚓糞混勻，裝入塑封袋中保存。
[0049]實(shí)施例4
[0050]實(shí)施例1、2、3的有效活菌數(shù)檢測(cè)
[0051](1)分別稱取以上三種肥料10g，加入帶有玻璃珠的90mL的無(wú)菌水中，靜置20min后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分旋轉(zhuǎn)振蕩30min ；
[0052](2)用移液器吸取0.5mL上述菌懸液加入4.5mL無(wú)菌水中，混勻成1:10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋5次；
[0053](3)用移液器分別吸取不同稀釋度菌懸液0.lmL，加至直徑為9cm平皿的瓊脂培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地徐于瓊脂表面；每個(gè)樣品取2個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，每一稀釋度重復(fù)4次，28°C條件下培養(yǎng)2天后計(jì)數(shù)；
[0054]結(jié)果如下:
[0055]表1采用不同制備方法制作的肥料有效活菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，具體實(shí)施步驟如下:(1)將桔黃假單胞菌JD37菌或熒光假單胞菌P13接種入液體培養(yǎng)基中，28°C下200r/min振蕩培養(yǎng)16~20小時(shí)；離心后取菌體，與滅菌的0.01wt%~10.00wt%保護(hù)劑溶液懸浮，混合均勻，得到懸浮菌液；(2)將懸浮菌液與滅菌的基質(zhì)混合，基質(zhì)與懸浮菌液的質(zhì)量體積比為1~2g/ml；(3)將混合過(guò)菌懸液的基質(zhì)與滅菌的市售蚯蚓糞按質(zhì)量比1:1混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(1)中液體培養(yǎng)基為KB培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(1)中離心條件為0~10°C，8000~lOOOOrpm離心15~20分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(1)中保護(hù)劑為0.lwt%的海藻酸鈉、10wt%的甘油或0.lwt%的羧甲基纖維素鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(1)中菌體的液體培養(yǎng)基與保護(hù)劑溶液體 積比為10~20:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中基質(zhì)為市售草炭土。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中基質(zhì)與懸浮菌液的質(zhì)量體積比為lg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中基質(zhì)使用碳酸鈣調(diào)整pH值至6.0~8.0，將基質(zhì)研磨成粉末后振蕩過(guò)直徑為0.3mm標(biāo)準(zhǔn)篩。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中混合方法為:將菌懸液與基質(zhì)攪拌后，自然風(fēng)干。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(3)中市售蚯蚓糞研磨成粉末后振蕩過(guò)直徑為2.0mm標(biāo)準(zhǔn)篩。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)和(3)中基質(zhì)和蚯蚓糞滅菌條件為121°C，20~30min，兩次。
【文檔編號(hào)】C05F15/00GK103664254SQ201310671396
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】肖明, 周晨昊, 蔣秋悅, 陳兵 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)