惠樓山藥的脫毒快繁方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種惠樓山藥的脫毒快繁方法，從正在生長的植株中，選擇生長健壯，無病蟲的植株，剪取帶有莖尖的莖蔓，去掉可見葉，消毒滅菌，利用解剖針剝離莖尖含1-2個葉原基，快速接種到分化與誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；通過病毒檢測后，將脫毒無菌苗剪成帶有1-2個節(jié)間的莖段轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中；選取生長勢強、健壯的無菌芽苗切成含有1-2個節(jié)間的小段轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，生根后進行煉苗。本發(fā)明的方法可人為的控制培養(yǎng)基生長條件，不受自然條件的影響，取材量小，培養(yǎng)材料經(jīng)濟，生長周期短，繁殖系數(shù)大，管理方便，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】惠樓山藥的脫毒快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物的組織培養(yǎng)脫毒與快繁技術(shù)，確切地說是用山藥的莖尖分生組織進行脫毒、莖段無性組織培養(yǎng)進行快繁，以及組織培養(yǎng)擴繁時所用的營養(yǎng)物質(zhì)一培養(yǎng)基的配比。
【背景技術(shù)】
[0002]山藥是一種介于糧食和蔬菜之間的食物，我國年產(chǎn)量居世界之首，既可大規(guī)模集約化生產(chǎn)，也可小面積庭院栽培。但由于我市及周邊地區(qū)山藥栽培歷史悠久，山藥病毒危害相當嚴重，田塊發(fā)病率100%，品種感病率100%。山藥感染病毒后，導(dǎo)致品種退化，產(chǎn)量下降30%以上，嚴重的田塊產(chǎn)量下降50%以上，有的甚至絕收；山藥病毒已成為導(dǎo)致山藥種性退化產(chǎn)量下降的重要原因，每年造成經(jīng)濟損失近億元。只有采用無性營養(yǎng)體進行組織培養(yǎng)脫毒快繁，才能保持原品種全部的遺傳性和實現(xiàn)該品種種質(zhì)的一致性。
[0003]植物組織培養(yǎng)脫毒與快繁技術(shù)近幾年飛快發(fā)展，已廣泛應(yīng)用在花卉、林果、蔬菜以及農(nóng)作物上。植物不同其培養(yǎng)方法也不同，即使是一種植物，但品種不同培養(yǎng)方法亦不盡相同。也就是說在同一種植物內(nèi)的每一個品種，都有它各自的生長發(fā)育規(guī)律，以及適宜生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)和環(huán)境條件。因此，惠樓山藥的組織培養(yǎng)脫毒與快繁技術(shù)，適宜的惠樓山藥莖尖分生組織培養(yǎng)和莖段組培快繁，最佳培養(yǎng)基和外界環(huán)境條件，與其他植物的培養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件也是不同的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種 山藥的組培脫毒與快繁技術(shù)以及用于山藥組培快繁的培養(yǎng)物質(zhì)，通過無性營養(yǎng)體進行組織培養(yǎng)脫毒快繁，一是不受季節(jié)限制，實現(xiàn)多次、快速、高系數(shù)繁殖；二是可保證原品種全部的遺傳性和該品種品質(zhì)的一致性。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案:
[0005]本發(fā)明的組培繁育方法包括如下步驟:
[0006](I)分化培養(yǎng)
[0007]從正在生長的山藥植株中，選擇生長健壯，無病蟲的植株，剪取帶有莖尖的莖蔓，去掉可見葉，在流動的自來水中沖洗，拮干水分；在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上，用酒精和升汞溶液滅菌，無菌水沖洗5-7遍，采用解剖鏡，利用解剖針剝離莖尖，所剝莖尖為0.1-0.3毫米，帶1-2個葉原基，接種到分化與誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；然后在溫度25±2°C，日照系數(shù)12-14h光照強度2200-2500LX的條件下培養(yǎng)；24_26d后重新轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，40_50d后培養(yǎng)瓶內(nèi)小苗長出5-7片葉，除去病苗弱苗，其余的快繁一次，待苗子長出7-9片葉時進行病毒檢測；
[0008](2)莖尖苗帶毒檢測
[0009]脫毒莖尖苗和在形態(tài)長勢上差異明顯，脫毒莖尖苗生長快，葉色濃，植株健壯；帶毒莖尖苗長勢弱葉色淡，葉片上有明顯花葉明脈或褪綠斑；經(jīng)目測，把帶毒癥狀明顯的莖尖苗除去；用血清學(xué)檢測法對剩余的山藥莖尖苗進行檢測，去除對山藥危害嚴重的PVA、PVM,PLRV, PVS、PVX、PVY和馬鈴薯卷葉病毒的莖尖苗；
[0010](3)增殖培養(yǎng)
[0011]通過病毒檢測后，剩下的無毒苗進行快繁，在超凈工作臺上，將脫毒無菌苗剪成帶有1-2個節(jié)間的莖段轉(zhuǎn)接到繼代與增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，PH5.6-5.8，在溫度
26-28 °C，光照12-14h/d，光照強度2000_25001x，濕度65-70%的環(huán)境條件下進行培養(yǎng)；20-25d后形成4-5個叢生芽，28-35d生長高度4_6cm左右，在同一培養(yǎng)基上繼代繁殖，繼代周期為25-28d ;循環(huán)往復(fù)6次以上；
[0012](4)生根培養(yǎng)[0013]選取生長勢強、健壯的無菌芽切成含有1-2個節(jié)間的小段，長1.0-1.5cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，，培養(yǎng)溫度26±2°C，濕度65-75%，光照強度2200-2500LX，光照時間12_14h/d，25-28d后選取長出3-5條0.3-3cm長的根以及展開葉3_5片的植株，待苗長至30_35d時，進行煉苗移栽；
[0014](5)煉苗與移栽
[0015]練苗前首先揭開培養(yǎng)瓶的封口膜，練苗時逐步調(diào)節(jié)濕度和溫度使得其接近自然環(huán)境，練苗時間為5-7天，然后取出，用自來水沖洗凈苗基部的培養(yǎng)基，并滅菌，然后移栽到已滅過菌的腐殖質(zhì)、碎爐渣、珍珠巖以3-5:1-2:1-2的比例混合的基質(zhì)中，前期適當遮陰并保持濕度在90%，逐步降至70-75%，15天后去掉薄膜罩，定期殺菌，7-10天一次，共計2_3次。
[0016]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的步驟I)中的滅菌過程是指采用重量百分比為70-80%的酒精浸泡15-25秒鐘，用百分比為0.05-0.15%的升汞溶液滅菌6_11分鐘。
[0017]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的山藥是惠樓山藥。
[0018]本發(fā)明的培養(yǎng)物質(zhì)及配比:
[0019]惠樓山藥的脫毒快繁的培養(yǎng)物質(zhì):由基本培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑加椰汁、蔗糖和瓊脂組成分化與誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代與增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基為MS，基本培養(yǎng)基MS的配置方法為公知技術(shù)，生長調(diào)節(jié)劑由6-芐基腺嘌呤(6-BA)、2.4-二氯苯氧乙酸(2.4-D)、a-萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IBA)、玉米素(ZT)組合而成。
[0020]1、分化與誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基I升加6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1.0-3.5mg、a-萘乙酸(NAA)0.5-3.0mg,2.4-二氯苯氧乙酸(2.4_D)0.2-2.5mg、玉米素(ZT)0.1-0.3mg、椰汁 100-200mg、鹿糖 30g、瓊脂 6.5g ；
[0021]2、繼代與增殖培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基I升加6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1.0-3.0mg,a-萘乙酸(NAA) 0.5-2.0mg、吲哚丁酸(IBA) 0.2-1.5mg、玉米素(ZT) 0.1-0.3mg、鹿糖 30g、瓊脂6g ；
[0022]3、生根培養(yǎng)基:1/2MS基本培養(yǎng)基I升加a_萘乙酸(NAA)0.5-2.0mg、蔗糖20g、瓊月旨6g。
[0023]本發(fā)明的積極效果是:
[0024]1、利用“惠樓山藥”的莖尖脫毒、莖段快繁，解決了年復(fù)一年用零余子繁殖、塊根頂部繁殖導(dǎo)致“惠樓山藥”病毒病嚴重、使新育品種品質(zhì)變劣、種質(zhì)退化、產(chǎn)量降低等難題；脫毒后在保持原品種特征特性的基礎(chǔ)上，純化了種質(zhì)，增強了品種抗疫性，提高了品質(zhì)和產(chǎn)量，增產(chǎn)30%以上，并且薯皮光滑，薯塊耐儲存；[0025]2、快繁克服了傳統(tǒng)的塊根頂部繁殖速度慢的弊端，I年內(nèi)I個生長點或I個莖段可增殖70-80萬個，I個人I年內(nèi)可快繁10-15萬個與母體生理特征完全一致的小植株，可實
現(xiàn)工廠化育苗、高效率生產(chǎn)；
[0026]3、可人為的控制培養(yǎng)生長條件，不受自然條件的影響，取材量小，培養(yǎng)材料經(jīng)濟，
生長周期短，繁殖系數(shù)大，管理方便，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；
[0027]4、培養(yǎng)基質(zhì)是腐殖質(zhì)、碎爐渣、珍珠巖以4:1:1比例混合的物質(zhì)，既經(jīng)濟又有效，降低了生產(chǎn)成本；
[0028]5、采用脫毒山藥苗三級育苗體系和無病毒甘薯種苗的繁殖更新，有效地防止了品種退化，確保了種質(zhì)純度。
【具體實施方式】
[0029]本實施例是用河南豫東四大特產(chǎn)之一“惠樓山藥”進行組培快繁的實例。
[0030]1、分化與誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0031]從正在生長的植株中，選擇生長健壯，無病蟲，具有本品種特征特性的植株，剪取帶有莖尖的莖蔓，去掉可見葉，在流動的自來水中沖洗20-30min，拮干水分待用。在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上，用重量百分比為75%的酒精浸泡20秒鐘，0.1%的升汞溶液滅菌8-12分鐘，無菌水沖洗5-7遍，在借助于60-80倍解剖鏡下，利用解剖針剝離莖尖，所剝莖尖為
0.1-0.3毫米，帶1-2個葉原基，快速接種到分化與誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+6-芐基腺嘌呤(6-BA)3.0mg/L+a-萘乙酸(NAA) 1.0mg/L+2.4- 二氯苯氧乙酸(2.4-D) lmg/L+ 玉米素(ZT) 0.2mg/L+椰汁120mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L中，封口后做好標記，然后在溫度26 ± 2°C，日照系數(shù)16h，光照強度2200-2500LX的條件下培養(yǎng)。20d后重新轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，40-50d后培養(yǎng)瓶內(nèi)小苗長出5-7片葉，除去病苗弱苗，其余的進行編號并快繁一次，待苗子長出7-9片葉時即可以進行病毒檢測。
[0032]2、增殖培養(yǎng)
[0033]通過病毒檢測后，不符合標準的全部淘汰，剩下的無毒苗加速快繁。在超凈工作臺上，將脫毒無菌苗剪成帶有1-2個節(jié)間的莖段轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基:MS+6-芐基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+a-萘乙酸(NAA) lmg/L+ 口引哚丁酸(IBA) 0.5mg/L+ 玉米素(ZT) 0.2mg/L+ 鹿糖30g/L+瓊脂6g/L中進行增殖培養(yǎng)，PH5.6-5.8，在溫度26_28°C，光照12_14h/d，光照強度2200-25001x，濕度65-70%的環(huán)境條件下進行培養(yǎng)。28_35d生長高度5cm左右，即可在同一培養(yǎng)基上繼代繁殖，繼代周期為25-28d。循環(huán)往復(fù)，增殖倍數(shù)6以上。
[0034]3、生根培養(yǎng)
[0035]選取生長勢強、健壯的無菌芽苗切成含有1-2個節(jié)間的小段長1.0-1.5cm轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基:l/2MS+a-萘乙酸(NAA) lmg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L中，25_28d有95%以上的植株長出3-5條0.3-3cm長的根，展開葉3_5片，待苗長至30_35d時，即可煉苗移栽，培養(yǎng)溫度(26±2) °C，濕度 65-75%，光照強度 2200-2500LX，光照時間 12_14h/d。
[0036]4、煉苗與移栽
[0037]煉苗前首先揭開培養(yǎng)瓶的封口膜，煉苗時間5-7天，煉苗時在保證溫、濕度的條件下，逐步接近自然環(huán)境，以利提高成活率，然后小心取出，用自來水沖洗凈苗基部的培養(yǎng)基，并滅菌，然后移栽到已滅過菌的腐殖質(zhì)與碎爐渣以2:1的比例混合的基質(zhì)中，前期適當遮陰并保持濕度在90%，逐步降至70-75%，15天后去掉薄膜罩，定期殺菌，7-10天一次，共計
2-3次，成活率達95%以上。
[0038]采取組織培養(yǎng)脫毒和快速繁殖新技術(shù)，對脫毒山藥進行無性繁殖，是解決生產(chǎn)和市場對其大量需求的一個有效途徑。I年內(nèi)I個生長點或I個莖段可增殖70-80萬個，I個人I年內(nèi)可快繁10-15萬個與母體生理特征完全一致的小植株，可實現(xiàn)工廠化育苗、高效率生產(chǎn)。而且所培育的品種適宜種植范圍廣，產(chǎn)量1800-2500kg/畝，脫毒后較脫毒前增產(chǎn)38.9%，對促進農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效具有很大的意義。 [0039]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護范圍為準。
【權(quán)利要求】
1.山藥組培繁育方法，其特征在于包括如下步驟: (1)分化培養(yǎng) 從正在生長的山藥植株中，選擇生長健壯，無病蟲的植株，剪取帶有莖尖的莖蔓，去掉可見葉，在流動的自來水中沖洗，拮干水分；在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上，用酒精和升汞溶液滅菌，無菌水沖洗5-7遍，采用解剖鏡，利用解剖針剝離莖尖，所剝莖尖為0.1-0.3毫米，帶1-2個葉原基，接種到分化與誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；然后在溫度25±2°C，日照系數(shù)12-14h光照強度2200-2500LX的條件下培養(yǎng)；24_26d后重新轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，40_50d后培養(yǎng)瓶內(nèi)小苗長出5-7片葉，除去病苗弱苗，其余的快繁一次，待苗子長出7-9片葉時進行病毒檢測； (2)莖尖苗帶毒檢測 脫毒莖尖苗和在形態(tài)長勢上差異明顯，脫毒莖尖苗生長快，葉色濃，植株健壯；帶毒莖尖苗長勢弱葉色淡，葉片上有明顯花葉明脈或褪綠斑；經(jīng)目測，把帶毒癥狀明顯的莖尖苗除去；用血清學(xué)檢測法對剩余的山藥莖尖苗進行檢測，去除對山藥危害嚴重的PVA、PVM,PLRV, PVS、PVX、PVY和馬鈴薯卷葉病毒的莖尖苗； (3)增殖培養(yǎng) 通過病毒檢測后，剩下的無毒苗進行快繁，在超凈工作臺上，將脫毒無菌苗剪成帶有1-2個節(jié)間的莖段轉(zhuǎn)接到繼代與增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，PH5.6-5.8，在溫度26_28°C，光照12-14h/d，光照強度2000-25001x，濕度65-70%的環(huán)境條件下進行培養(yǎng)；20_25d后形成4-5個叢生芽，28-35d生長高度4-6cm左右，在同一培養(yǎng)基上繼代繁殖，繼代周期為25-28d;循環(huán)往復(fù)6次以上； (4)生根培養(yǎng) 選取生長勢強、健壯的無菌芽切成含有1-2個節(jié)間的小段，長1.0-1.5cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，，培養(yǎng)溫度26±2°C，濕度65-75%，光照強度2200-2500LX，光照時間12_14h/d，25-28d后選取長出3-5條0.3-3cm長的根以及展開葉3_5片的植株，待苗長至30_35d時，進行煉苗移栽； (5)煉苗與移栽 練苗前首先揭開培養(yǎng)瓶的封口膜，練苗時逐步調(diào)節(jié)濕度和溫度使得其接近自然環(huán)境，練苗時間為5-7天，然后取出，用自來水沖洗凈苗基部的培養(yǎng)基，并滅菌，然后移栽到已滅過菌的腐殖質(zhì)、碎爐渣、珍珠巖以3-5:1-2:1-2的比例混合的基質(zhì)中，前期適當遮陰并保持濕度在90%，逐步降至70-75%，15天后去掉薄膜罩，定期殺菌，7-10天一次，共計2_3次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟I)中的滅菌過程是指采用重量百分比為70-80%的酒精浸泡15-25秒鐘，用百分比為0.05-0.15%的升汞溶液滅菌6_11分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的山藥是惠樓山藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: (O分化與誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:MS基本培養(yǎng)基I升加6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.0-3.5mg、a-萘乙酸(NAA)0.5-3.0mg,2.4-二氯苯氧乙酸(2.4_D)0.2-2.5mg、玉米素(ZT)0.1-0.3mg、椰汁 100-200mg、鹿糖 30g、瓊脂 6.5g ； (2)繼代與增殖培養(yǎng)基的配方為:MS基本培養(yǎng)基I升加6-芐基腺嘌呤(6-BA).1.0-3.0mg、a-萘乙酸(NAA)0.5-2.0mg、吲哚丁酸(IBA)0.2-1.5mg、玉米素(ZT)0.1-0.3mg、鹿糖30g、瓊脂6g ； (3)生根培養(yǎng)基的配方為:1/2MS基本培養(yǎng)基I升加a-萘乙酸(NAA) 0.5-2.0mg、蔗糖.20g、瓊脂 6g。
【文檔編號】A01G1/00GK103563747SQ201310516558
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】呂樹立, 孫鳳領(lǐng), 孫喜云, 左雙喜, 周玉玲, 丁芳, 侯倩倩 申請人:商丘市農(nóng)林科學(xué)院