一種快大型烏膚雞品系的培育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快大型烏膚雞品系的培育方法，屬于分子育種【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用分子輔助選擇的方法鑒定雞烏膚位點(diǎn)基因型，可以快速判定出該位點(diǎn)的基因型，克服了傳統(tǒng)常規(guī)育種中測(cè)交繁瑣、世代間隔長(zhǎng)等缺點(diǎn)。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)基因型為FmFm的烏膚雞品系，不僅避免了測(cè)交選育的繁瑣，縮短了世代間隔，加快了育種進(jìn)程，降低了培育成本；而且該品系烏膚性狀均一，屠體更加美觀；肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。此外，該品系用作父本與快大型白羽肉雞雜交配套，可生產(chǎn)出高生長(zhǎng)性能的烏膚雞。
【專利說(shuō)明】一種快大型烏膚雞品系的培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種快大型烏膚雞品系的培育方法，屬于分子育種【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]烏骨雞是聞名中外的藥用家禽，1874年被國(guó)際上承認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)品種，它具有特殊的藥用、營(yíng)養(yǎng)及觀賞價(jià)值。而國(guó)外的快大型白羽肉雞長(zhǎng)速快。為了提高其生長(zhǎng)性能，育種工作者在育種實(shí)踐中往往要導(dǎo)入快大型肉雞的血緣，這會(huì)使得烏膚性狀發(fā)生分離。烏雞的藥用價(jià)值主要在于其黑色素的作用，烏膚性狀是消費(fèi)者對(duì)黑色素表達(dá)最直接的判定。為了能夠在提供生長(zhǎng)性能的同時(shí)又保持烏膚的性狀，烏膚位點(diǎn)基因型的判定就顯得非常重要。傳統(tǒng)育種中常常采用測(cè)交的方法，依據(jù)雜交后代雞的表型性狀留種。即通過(guò)測(cè)交、繁殖擴(kuò)群來(lái)淘汰隱性烏雞群體里的烏膚雜合子個(gè)體。但是測(cè)交過(guò)程較為繁瑣，周期長(zhǎng)，且會(huì)受到擴(kuò)群的大小的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種快大型烏膚雞品系的培育方法。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0005]一種快大型烏膚雞品系的培育方法，包括以下步驟:
[0006](I)利用烏膚雞品種作為父本與快大型白羽肉雞品種作為母本進(jìn)行雜交，生產(chǎn)出Fl代雞，選留Fl代烏膚雞；
[0007](2) Fl代自交得到F2代，選留F2代烏膚雞；
[0008](3)利用熒光定量PCR測(cè)定F2代烏膚雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)，確定F2代烏膚雞個(gè)體的基因型，選留烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的個(gè)體，淘汰烏膚位點(diǎn)為Fmfm基因型的個(gè)體，得到烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的公母雞；
[0009](4)對(duì)得到的FmFm基因型個(gè)體進(jìn)行橫交和擴(kuò)繁，按照家系選擇和個(gè)體選擇方法，提高生長(zhǎng)速度，同時(shí)提純和固定烏膚性狀，經(jīng)過(guò)4個(gè)世代以上的選育后，得到烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的快大型烏膚雞品系。
[0010]所述步驟(1)中的烏膚雞品種為絲羽烏骨雞、江山烏骨雞、金湖烏鳳雞、余干烏骨雞、鄖陽(yáng)烏骨雞、雪峰烏骨雞、四川山地烏骨雞、烏蒙烏骨雞、騰沖雪雞、略陽(yáng)雞(黑河烏雞)、他留烏骨雞、無(wú)量山烏骨雞、鹽津?yàn)豕请u等。
[0011]所述步驟(1)中的快大型白羽肉雞品種為羅斯308、科寶、艾維茵、哈巴德、艾拔益加(AA)、海波羅、迪聞等。
[0012]所述步驟(3)中利用熒光定量PCR測(cè)定F2代烏膚雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)，確定F2代烏膚雞個(gè)體基因型的方法，包括以下步驟:以包含EDN3基因的待測(cè)雞全血基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的DNA序列如SEQ ID N0.3所示；
[0013]所述的引物對(duì)P為:[0014]上游引物P-F:5’-CTTGACirTTGGGAITTACCT-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)，
[0015]下游引物P-R:5’ -ACTGGTGCAGTAnTTCTGTT-3，(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0016] 該擴(kuò)增序列的全長(zhǎng)為134bp，位于雞烏膚位點(diǎn)EDN3基因上，能夠檢測(cè)雞烏膚基因位點(diǎn)EDN3基因是否存在拷貝數(shù)變異。
[0017]所述的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:熒光定量PCR2X緩沖液10 ii L，ddH207 ii L，P-F0.5u L, P-R0.5u L, DNA 模板 2u L0
[0018]所述的熒光定量PCR2X緩沖液的成分為:5U/ u L Taq DNA Polymerase,10XBuffer,25mM MgCl2, 2mM dNTPs, SYBR Green I。
[0019]所述的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性2min;40個(gè)循環(huán):95°C變性30s，57。。退火 30s，72。。延伸 30s ;72°C 延伸 IOmin ;20°C保存。
[0020]具體的，所述步驟(3)中利用熒光定量PCR測(cè)定F2代烏膚雞EDN3基因拷貝數(shù)，確定F2代烏膚雞基因型的方法，還包括以下步驟:利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)，根據(jù)其拷貝數(shù)鑒定雞烏膚位點(diǎn)的基因型。
[0021]所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法為:以白膚雞全血基因組DNA作為熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為80，40，20，10，5，2.5ng/uL,以引物對(duì)P為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以上述六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
[0022]所述的利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)的方法為:熒光定量PCR擴(kuò)增前，先將待測(cè)雞的DNA稀釋到同一濃度IOng/ u L，再將待測(cè)雞的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求出其對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)濃度，再轉(zhuǎn)化為濃度，即為該待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)。
[0023]所述的根據(jù)拷貝數(shù)鑒定雞烏膚位點(diǎn)的基因型的方法為:當(dāng)待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)為2時(shí)，該個(gè)體為烏膚純合子(FmFm);當(dāng)待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)為1.5時(shí)，該個(gè)體為烏膚雜合子(Fmfm);當(dāng)待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)為1，該個(gè)體為非烏膚純合子(fmfm)。
[0024]優(yōu)選的，將步驟(4)得到的烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的快大型烏膚雞作為父本與快大型白羽肉雞品種雜交配套，生產(chǎn)出更高生長(zhǎng)性能的烏膚雞。
[0025]本發(fā)明的有益效果:
[0026]采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)基因型為FmFm的烏膚雞品系，不僅避免了測(cè)交選育的繁瑣，縮短了世代間隔，加快了育種進(jìn)程，降低了培育成本；而且該品系烏膚性狀均一，屠體更加美觀；肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。此外，該品系用作父本與快大型白羽肉雞雜交配套，可生產(chǎn)出高生長(zhǎng)性能的烏膚雞。
[0027]本發(fā)明采用分子輔助選擇的方法鑒定雞烏膚位點(diǎn)基因型，可以快速判定出該位點(diǎn)的基因型，縮短育種時(shí)間，提高育種效率，克服了傳統(tǒng)常規(guī)育種中測(cè)交繁瑣、世代間隔長(zhǎng)等缺點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0029]實(shí)施例1
[0030]本實(shí)施例中快大型烏膚雞品系的培育方法，包括以下步驟:[0031](I)利用絲羽烏骨雞純系公雞作為父本與羅斯308母雞作為母本進(jìn)行雜交，生產(chǎn)出Fl代雞，選留Fl代烏膚雞；
[0032](2) Fl代自交得到F2代，選留F2代烏膚雞；
[0033](3)利用熒光定量PCR測(cè)定F2代烏膚雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)，確定F2代烏膚雞個(gè)體的基因型，具體包括以下步驟:
[0034]①樣品的采集
[0035]對(duì)F2代選留的烏膚雞翅靜脈采血，加1/3抗凝劑，用蛋白酶K法提取血液DNA ；
[0036]②DNA樣品濃度調(diào)整
[0037]將待測(cè)樣品的DNA利用微量分光光度儀進(jìn)行濃度測(cè)定，根據(jù)所測(cè)濃度，將每一個(gè)待測(cè)樣品DNA濃度加TE稀釋至IOng/μ L，稀釋后用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定，4°C冰箱保存?zhèn)溆?
[0038]③標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0039]隨機(jī)取一個(gè)白羽肉雞的DNA樣本，測(cè)定濃度后，將其稀釋至80ng/ μ L，作為標(biāo)準(zhǔn)品母液，將母液倍比稀釋為80，40，20，10,5,2.5ng/μ L，作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品；
[0040]④引物設(shè)計(jì)
[0041]基因型鑒定所用到的引物對(duì)P的序列如下:
[0042]上游引物P-F:5 ’ -CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3 ’，
[0043]下游引物P-R: 5 ’ -ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3 ’ ；
[0044]⑤qPCR 擴(kuò)增
[0045]以引物對(duì)P為擴(kuò)增引物，建立20yL體系:熒光定量PCR2X緩沖液(包括5U/μ L Taq DNA Polymerase, 10 XBuffer, 25mM MgCl2, 2mM dNTPs, SYBR Green I) 10 μ L,ddH207 μ L, P-F0.5 μ L, P-R0.5 μ L，DNA 模板 2 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性 2min ;95°C變性 30s，57°C退火 30s，72。。延伸 30s, 40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ;20°C保存；
[0046]⑥qPCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)處理和基因型結(jié)果的判定
[0047]以80、40、20、10、5、2.5ng/ μ L的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)，以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程y=_0.285x+7.665，R2=0.9986和該反應(yīng)的擴(kuò)增效率 92.72% ；
[0048]將待測(cè)個(gè)體的Ct值帶入方程，求出其對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)濃度，再轉(zhuǎn)化為濃度，即為該待測(cè)個(gè)體EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)；
[0049]將白膚個(gè)體的EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)設(shè)為1，當(dāng)待測(cè)個(gè)體的相對(duì)拷貝數(shù)為2時(shí)，該位點(diǎn)的基因型為FmFm ;當(dāng)待測(cè)個(gè)體的相對(duì)拷貝數(shù)為1.5時(shí)，該位點(diǎn)的基因型為Fmfm (由于待測(cè)樣本DNA濃度標(biāo)定和熒光定量PCR試驗(yàn)都會(huì)存在一定的試驗(yàn)誤差，將此誤差控制在20%之內(nèi)即可，不影響對(duì)烏膚位點(diǎn)的判型)；
[0050](4)根據(jù)基因型判定結(jié)果，選留烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的個(gè)體，淘汰烏膚位點(diǎn)為Fmfm基因型的個(gè)體；
[0051](5)對(duì)得到的FmFm基因型個(gè)體進(jìn)行橫交和擴(kuò)繁，按照家系選擇和個(gè)體選擇方法，提高生長(zhǎng)速度，同時(shí)提純和固定烏膚性狀，經(jīng)過(guò)4個(gè)世代以上的選育后，得到烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的快大型烏膚雞品系；
[0052](6)將得到的烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的快大型烏膚雞作為父本與快大型白羽肉雞品種雜交配套，生產(chǎn)出更高生長(zhǎng)性能的烏膚雞。
【權(quán)利要求】
1.一種快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)利用烏膚雞品種作為父本與快大型白羽肉雞品種作為母本進(jìn)行雜交，生產(chǎn)出Fl代雞； (2)Fl代自交得到F2代，選留F2代烏膚雞； (3)利用熒光定量PCR測(cè)定F2代烏膚雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)，確定F2代烏膚雞個(gè)體的基因型，選留烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的個(gè)體，淘汰烏膚位點(diǎn)為Fmfm基因型的個(gè)體； (4)對(duì)得到的FmFm基因型個(gè)體進(jìn)行橫交和擴(kuò)繁，按照家系選擇和個(gè)體選擇方法，提高生長(zhǎng)速度，同時(shí)提純和固定烏膚性狀，經(jīng)過(guò)4個(gè)世代以上的選育后，得到烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的快大型烏膚雞品系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:所述步驟(1)中的烏膚雞品種為絲羽烏骨雞、江山烏骨雞、金湖烏鳳雞、余干烏骨雞、鄖陽(yáng)烏骨雞、雪峰烏骨雞、四川山地烏骨雞、烏蒙烏骨雞、騰沖雪雞、略陽(yáng)雞、他留烏骨雞、無(wú)量山烏骨雞或鹽津?yàn)豕请u。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:所述步驟(1)中的快大型白羽肉雞品種為羅斯308、科寶、艾維茵、哈巴德、艾拔益加、海波羅或迪高。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:所述步驟(3)中利用熒光定量PCR測(cè)定F2代烏膚雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)，確定F2代烏膚雞基因型的方法，包括以下步驟:以包含EDN3基因的待測(cè)雞全血基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的DNA序列如SEQ ID N0.3所示； 所述的引物對(duì)P為:
上游引物 P-F:5’ -CTTGACirTTGGGAITTACCT-3’，
下游引物 P-R:5’ -ACTGGTGCAGTAITITCTGTT-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:所述的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:熒光定量PCR2X緩沖液10 u L，ddH207 u L，P_F0.5 u L，P_R0.5 u L,DNA 模板 2 u L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:所述的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性2min ；40個(gè)循環(huán):95°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸 30s ;72°C延伸 IOmin ;20°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:所述步驟(3)中利用熒光定量PCR測(cè)定F2代烏膚雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)，確定F2代烏膚雞個(gè)體基因型的方法，還包括以下步驟:利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)，根據(jù)其相對(duì)拷貝數(shù)鑒定雞烏膚位點(diǎn)的基因型。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:所述的利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)的方法為:熒光定量PCR擴(kuò)增前，先將待測(cè)雞的DNA稀釋到同一濃度IOng/ u L，再將待測(cè)雞的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求出其對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)濃度，再轉(zhuǎn)化為濃度，即為該待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:所述的根據(jù)其相對(duì)拷貝數(shù)鑒定雞烏膚位點(diǎn)的基因型的方法為:當(dāng)待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)為2時(shí)，該個(gè)體為烏膚純合子；當(dāng)待測(cè)雞EDN3基因的相對(duì)拷貝數(shù)為1.5時(shí)，該個(gè)體為烏膚雜合子。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快大型烏膚雞品系的培育方法，其特征在于:將步驟(4)得到的烏膚位點(diǎn)為FmFm基因型的快大型烏膚雞作為父本與快大型白羽肉雞品種雜交配套，生產(chǎn)出更高生長(zhǎng)性能的烏膚·雞。
【文檔編號(hào)】A01K67/02GK103563846SQ201310509011
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】康相濤, 楊朋坤, 韓瑞麗, 田亞?wèn)|, 李轉(zhuǎn)見(jiàn), 王丹丹, 孫桂榮, 蔣瑞瑞, 呂世杰, 王彥彬, 劉小軍, 李國(guó)喜, 閆峰賓, 黃艷群, 許殿明, 李孝法, 索智勇, 張瑞勤 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)