一種解磷真菌及其在生物磷肥制備和蘑菇栽培中的應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種解磷真菌以及利用該真菌制備腐熟劑，制備的腐熟劑可用于生物有機肥的生產(chǎn)和蘑菇栽培中，屬于農(nóng)業(yè)廢棄物資源化綜合利用【
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】。本發(fā)明的微生物為黑曲霉AspergillusnigerMZ菌株，該菌株2013年4月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC?No.7464。MZ菌株的ITS4基因序列（此序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列號為HQ850370）是鑒別該菌株的主要特征依據(jù)。利用本發(fā)明的MZ菌株制備的腐熟劑通過堆肥發(fā)酵方法能將玉米、水稻、小麥等農(nóng)作物秸稈在21天內(nèi)完全腐熟，轉(zhuǎn)化為生物磷肥。利用本發(fā)明的MZ菌株制備的腐熟劑還可用于雙孢蘑菇、草菇等培養(yǎng)料的快速腐熟和提高蘑菇產(chǎn)量?！緦＠f明】一種解磷真菌及其在生物磷肥制備和蘑菇栽培中的應(yīng)用【
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】[0001]本發(fā)明涉及利用一種解磷真菌制備秸桿腐熟劑的方法，以及利用該腐熟劑發(fā)酵秸桿類農(nóng)業(yè)廢棄物制備生物磷肥和栽培蘑菇，屬微生物菌劑【
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】?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]秸桿還田有利于改善土壤理化和生物學(xué)性狀、培肥土壤，促進作物生長發(fā)育和產(chǎn)量的提高。作物秸桿主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蠟質(zhì)物質(zhì)及少量灰分組成，在纖維素的晶型構(gòu)架之間充滿了半纖維素和有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素大分子，三者通過特定的方式結(jié)合在一起形成穩(wěn)定的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。盡管纖維素、半纖維素多糖類有機物質(zhì)容易被微生物或酶分解，但是在植物組織中木質(zhì)素與半纖維素以共價鍵形式結(jié)合，并將纖維素分子緊緊包埋其中成為外圍基質(zhì)，形成一種堅固的天然屏障，多數(shù)微生物及其產(chǎn)生的降解酶很難進入其中分解纖維素。因此，自然條件下秸桿腐熟速度緩慢，腐熟程度不徹底，還田后使用會影響土壤墑情，在土壤中經(jīng)微生物繼續(xù)發(fā)酵分解產(chǎn)生的熱量還會導(dǎo)致作物燒苗等現(xiàn)象。[0003]我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物播種面積居世界第一位，秸桿中蘊藏著巨大的養(yǎng)分資源，作物吸收的養(yǎng)分有50%左右以生物質(zhì)的形式保留在秸桿中。2006年中國作物秸桿資源數(shù)量超過7.6億噸，接近世界秸桿資源總量1/3，是世界第一秸桿大國，且總產(chǎn)量呈不斷增長之勢(畢于運等，2009)。中國農(nóng)作物秸桿種類繁多，主要作物秸桿近20種。其中，水稻、小麥和玉米三大作物秸桿的總量占全部秸桿總量的77.2%(高利偉等，2009)。這三大作物秸桿的氮、磷、鉀養(yǎng)分含量分別占到秸桿養(yǎng)分總量的68.8%,74.0%、73.9%，總養(yǎng)分占到總量的72.3%(高利偉等，2009)。因此，如何加速農(nóng)作物秸桿的快速腐解、促進秸桿的原位還田，以及通過秸桿的快速堆肥發(fā)酵將其轉(zhuǎn)化成有機肥，已成為秸桿資源循環(huán)利用亟待解決的關(guān)鍵問題。[0004]通過添加腐熟劑可以加快秸桿腐熟、實現(xiàn)廢棄物的利用。農(nóng)作物秸桿能夠利用自身的、環(huán)境的微生物完成自身的腐熟過程，但人為添加腐熟劑能達(dá)到縮短腐熟時間、提高腐熟效率；同時，添加具有解磷、生防等特殊功能的微生物腐熟劑還能能更大程度的滿足農(nóng)業(yè)發(fā)展的需要。木腐菌等微生物可分泌木質(zhì)素酶、纖維素酶、半纖維素酶等胞外酶分解秸桿中的木質(zhì)素、纖維素等成分，促進纖維類物質(zhì)的分解(Zhouetal.,2007;顧方媛等，2008)。Haruta等(2002)構(gòu)建的復(fù)合菌系能在4天的時間將水稻稻桿質(zhì)量的60%分解；任克寧等(2011)報道了白腐菌和黑曲霉混合能降解玉米秸桿中的木質(zhì)素和纖維素。劉成等(2007)以棉柏和玉米桿為主要原料研究了黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件及部分酶學(xué)性質(zhì)及利用生物防治微生物降解秸桿等應(yīng)用。研究表明黑曲霉具有較強溶解多種無機磷的能力和促進作物生長的作用(梁艷瓊等，2011)。[0005]磷是植物生長發(fā)育所必需營養(yǎng)元素之一，在植物的生長和發(fā)育中的作用僅次于氮。我國有74%的耕地處于缺磷狀態(tài)，為了確保農(nóng)作物生長所必需的磷素營養(yǎng)，每年必須向農(nóng)田土壤中施入大量的化學(xué)磷肥。但施入的化學(xué)肥料僅有5%~25%可被植物吸收利用，絕大部分磷肥則很快與土壤中的其它成分發(fā)生反應(yīng)變成植物不能吸收利用的難溶性磷酸鹽或以吸附態(tài)形式滯留于土壤中(Singh&Kapoor,1994)。解磷微生物可通過分泌各種有機酸，無機酸等途徑溶解礦物磷，釋放可溶性磷供植物生長需要(Songetal.,2008)。利用解磷真菌制備的秸桿腐熟劑不僅具有常規(guī)腐熟劑腐熟秸桿的效果，還具有微生物磷肥的功能，應(yīng)用前景十分廣闊。[0006]雙孢蘑菇和草菇的培養(yǎng)料主要是糞草，栽培之前需要將糞草堆肥發(fā)酵和充分腐熟以提高培養(yǎng)料的養(yǎng)分和減少蘑菇栽培過程中的病蟲害。目前，對糞草腐熟以常規(guī)的堆肥自然發(fā)酵方式為主，耗時長，養(yǎng)分損失大。利用功能微生物制備的腐熟劑能加速糞草腐熟進程和減少養(yǎng)分流失，已經(jīng)在雙孢蘑菇的栽培中應(yīng)用(石文權(quán)等，2010)。可以預(yù)見，利用抗病、促進生長等功能性微生物腐熟劑在蘑菇栽培中有廣泛的應(yīng)用前景。[0007]主要參考文獻畢于運等，高春雨，王亞靜.中國秸桿資源數(shù)量估算.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2009，25:211-217.高利偉，馬林，張衛(wèi)峰.中國作物秸桿養(yǎng)分資源數(shù)量估算及其利用狀況.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2009，7:173-179.顧方媛，陳朝銀，石家驥.纖維素酶的研究進展與發(fā)展趨勢.微生物學(xué)雜志，2008，28(I):83-87.梁艷瓊，雷照鳴，賀春萍.一株溶磷真菌的分離鑒定及其溶磷能力的初步研.熱帶作物學(xué)報，2011，32(6):1116-1121.劉成，孫中濤，田林茂，杜金華.黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件及部分酶學(xué)性質(zhì)的研究.生物技術(shù)，2007，17(4):82-85.任克寧，張福元，王瑩瑩.白腐菌及黑曲霉對玉米秸桿生物降解的研究.中國飼料，2011，(3):35-37.石文權(quán)，賈琦，劉民強.腐熟劑在雙孢蘑菇栽培中的應(yīng)用研究.食用菌，2010，1:33-35.HarutaS，CuiZJjHuangZ.Constructionofastablemicrobialcommunitywithhighcellulose-degradationability.ApplMicrobiolBiotechnolj2002，59:529-534.SinghSjKapoorK.Solubilizationofinsolublephosphatesbybacteriaisolatedfromdifferentsources.EnvironEcol.1994，(12):51-55.Song0R，LeeSJjLeeYS.SolubilizationofinsolubleinorganicphosphatebyBurkholderiacepaciaDA23isolatedfromcultivatedsoil.BrazJMicrobiol.2008，(39):151-156.ZhouX，SmithJAjOiFM，KoehlerPGjBennettGWjScharfME.CorrelationofcellulasegeneexpressionandcellulolyticactivitythroughoutthegutofthetermiteReticulitermesflavi`pes.Gene,2007，1(395):29-39.【
發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種解磷真菌及其制備腐熟劑的方法，以及該腐熟劑在堆肥發(fā)酵農(nóng)作物秸桿制備生物磷肥和腐熟蘑菇培養(yǎng)料上的應(yīng)用。[0009]本發(fā)明人從磷礦區(qū)植物根際土中篩選獲得一株能快速腐熟農(nóng)作物秸桿和蘑菇培養(yǎng)料的解磷真菌，利用該微生物制備的腐熟劑具有快速腐熟農(nóng)作物秸桿和蘑菇培養(yǎng)料的功能；同時，腐熟的秸桿基質(zhì)里含有生物量很高的解磷真菌，可直接作為解磷菌肥替代化學(xué)磷肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。利用該微生物不但能加速蘑菇培養(yǎng)料的腐熟，而且能提高蘑菇產(chǎn)量。[0010]本發(fā)明人采用篩選解磷微生物的常規(guī)方法從云南省晉寧縣磷礦廠植物根際土中篩選獲得黑曲霉(Aspergillusniger)MZ菌株。45/76?/及_/77"5.nigerMZ菌株已于2013年4月12日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號:CGMCCN0.7464，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所。[0011]AspergiIlusnigerMZ菌株在CA培養(yǎng)基(NaNo33g,K2HPO4lg,KCl0.5g,MgSO4.7H200.5g,FeSO4.7H200.01g,蔗糖30g,瓊脂15g，補水至1000ml)上25°C下培養(yǎng)7天，菌落圓形，表面呈深棕色或黑色。分生孢子囊直徑約10-22μm，球狀，深棕色，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸分開成許多單列。分生孢子梗透明，或在朝向孢子囊的部分變暗。分生孢子頭二列，附有棕色瓶梗，孢子球狀或近球狀，直徑3.5-5.0μm，深棕色或黑色，外表粗糙。分生孢子大小為3-5μπι(長)Χ3-4μπι(寬)。利用引物5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC，，5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’經(jīng)PCR擴增，獲得MZ菌株的ITS4區(qū)基因序列，提交到GeneBank公共數(shù)據(jù)庫,其序列號為HQ850370，此序列是鑒定該菌株的主要特征依據(jù)。[0012]所述的解磷真菌nigerMZ的用途是用于制備MZ腐熟劑。[0013]—種采用上述解磷真菌制備MZ腐熟劑的方法為:、\%AspergiIIusnigerMZ菌株在PDA固體培養(yǎng)基上、28°C下培養(yǎng)4d，用無菌牙簽將平板表面的菌絲和孢子刮下并接種到棉籽殼培養(yǎng)基中，28°C下培養(yǎng)4-8天后即得到MZ腐熟劑。[0014]所述的棉籽殼培養(yǎng)基由棉籽殼加PDA液體培養(yǎng)基混勻制成,含水量為35%_45%。[0015]上述制備的MZ腐熟劑用于堆肥發(fā)酵農(nóng)作物秸桿來制備生產(chǎn)生物磷肥。[0016]一種利用MZ腐熟劑發(fā)酵農(nóng)作物秸桿制備生物磷肥的方法:農(nóng)作物秸桿經(jīng)自然風(fēng)干，粉碎成小于3cm的片段，與草碳按重量比為7:3混勻，按堆料干重的0.1%-5%的比例接種MZ腐熟劑，充分混勻后將堆料水分調(diào)節(jié)到30%-45%，將堆料在室內(nèi)按梯形堆垛，堆體的下底長1-1.5m,上底長0.5-lm,高0.5-lm,每3天翻堆一次，發(fā)酵18-21天時終止發(fā)酵，將發(fā)酵產(chǎn)物在65°C以下干至水分含量小于5%，粉碎、過篩后即得到生物磷肥。[0017]上述制備的MZ腐熟劑用于發(fā)酵糞草培養(yǎng)料，可加速培養(yǎng)料的腐熟和提高蘑菇產(chǎn)量。[0018]一種利用MZ腐熟劑發(fā)酵糞草培養(yǎng)料的方法，向糞草培養(yǎng)料中，按堆料干重0.1%-5%的比例接種MZ腐熟劑，充分混勻后，將堆料水分調(diào)節(jié)到30%-45%。將堆料在室內(nèi)按梯形堆垛，堆體的下底長1-1.5米，上底長0.5-1米，高0.5-1米，每3天翻堆一次，發(fā)酵6-10天時獲得的發(fā)酵產(chǎn)物可用于雙孢蘑菇、草菇等栽培。[0019]本發(fā)明提供的解磷真菌nigerMZ可制備腐熟劑,該腐熟劑可加快稻桿腐熟，具有解磷、生防等特殊功能，通過腐熟農(nóng)作物秸桿制備的生物有機肥在土壤磷酸鹽含量較高的土壤中可替代化學(xué)磷肥使用。同時該腐熟劑可用于雙孢蘑菇、草菇等培養(yǎng)料的發(fā)酵環(huán)節(jié)中，可加速培養(yǎng)料(糞草)的腐熟進程和減少養(yǎng)分流失，并在抗病、促進生長等方面具有顯著效果。本發(fā)明提供的解磷真菌在生物肥料及植物培植領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)潛力。【具體實施方式】[0020]實施例一:AspergillusnigerMZ菌株的培養(yǎng)分五組培養(yǎng)且進行對比，將AspergillusnigerMZ菌株的菌體接種到PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g切碎，用水煮沸30分鐘后過濾取濾液，蔗糖20g，瓊脂20g，補水至1000ml,pH自然)斜面上，分別在20°C、22°C、24°C、26°C、28°C、30°C下培養(yǎng)，相繼在4-10天后獲得斜面種子。[0021]經(jīng)對比，最適宜的培養(yǎng)條件為28°C下培養(yǎng)4天。[0022]實施例二:MZ腐熟劑的制備將AspergillusnigerMZ菌株在PDA固體培養(yǎng)基上、28°C下培養(yǎng)4d，用無菌牙簽將平板表面的菌絲和孢子刮下并接種到棉籽殼培養(yǎng)基中，在28°C下培養(yǎng)，實驗表明5-8天后可得到MZ腐熟劑。[0023]經(jīng)實驗對比，最佳適宜的培養(yǎng)條件是28°C下培養(yǎng)4天。[0024]所述的棉籽殼培養(yǎng)基是通過向棉籽殼加PDA液體培養(yǎng)基混勻制得，含水量為35-45%。[0025]實施例三:利用MZ腐熟劑發(fā)酵農(nóng)作物秸桿制備生物磷肥將水稻、小麥、玉米等農(nóng)作物秸桿經(jīng)自然風(fēng)干，粉碎成小于3cm的片段，然后與草碳按重量比為7:3的比例混勻后，按堆料干重的0.1-5%的比例接種MZ腐熟劑，充分混勻后將堆料水分調(diào)節(jié)到30%-45%，將堆料在室內(nèi)按梯形堆垛，堆體的下底長1-1.5米，上底長0.5-1米，高0.5-1米，每3天翻堆一次，發(fā)酵18-21天時終止發(fā)酵，將發(fā)酵產(chǎn)物在65°C以下烘干或室溫下晾干至水分含量小于5%，粉碎、過篩后即得到生物磷肥。[0026]經(jīng)檢測,用此方法制備的生物磷肥，AspergillusnigerMZ的活菌數(shù)含量一般在I~9X109個/克。[0027]實施例四:利用MZ腐熟劑發(fā)酵糞草培養(yǎng)料以雙孢蘑菇的培養(yǎng)料為例(稻草30%、玉米桿15%，麥桿5%，豬糞41.7%，尿素0.3%，石膏1%，石灰1%，過磷酸鈣1%)，按培養(yǎng)料堆料干重的0.1-5%接種MZ腐熟劑，充分混勻后將堆料水分調(diào)節(jié)到30-45%。將堆料在室內(nèi)按梯形堆垛，堆體的下底長1-1.5米，上底長0.5-1米，高0.5-1米，每3天翻堆一次，發(fā)酵6-10天時獲得的發(fā)酵產(chǎn)物用于雙孢蘑菇的栽培。[0028]實施例五:本發(fā)明制備的生物磷肥在番茄種植中的應(yīng)用試驗供試作物:番爺Solanum應(yīng),品種:歐石大紅。[0029]土壤:采自滇池富磷區(qū)的磷礦土。[0030]供試肥料:活菌數(shù)含量為5.5XIO9個/克的MZ生物磷肥；商品有機肥。[0031]試驗方法:用5%的次氯酸鈉表面滅菌番茄種子5-8分鐘，用清水清洗3-4次除去次氯酸鈉后在常溫下放置30分鐘自然干燥。供試土壤充風(fēng)干后經(jīng)2mm孔徑的篩子過篩，按過篩土壤重量的1%加入MZ生物磷肥并混合均勻，每盆裝入混有生物菌肥的土壤2kg，并將10顆油菜種子播入盆栽土壤上層2cm深處，澆透水。之后視植物生長需要澆水保持水分，待種子發(fā)芽長出2片葉時每盆保留3株苗。分別以未施用任何肥料和添加等量商品有機肥的處理為對照，每處理3個重復(fù)。統(tǒng)計番茄種子的發(fā)芽率，播種60天時測定單株番茄果實數(shù)量和重量。[0032]試驗結(jié)果表明:未施肥料的對照中番爺種子萌發(fā)率為75.43%,施用商品有機肥的對照中種子萌發(fā)率為93.36%，而施用MZ生物磷肥的處理中種子萌發(fā)率高達(dá)98.67%，種子萌發(fā)率分別比兩對照提高了23.24%和5.31%。收獲時，未施肥料的對照中單株番茄果實平均數(shù)為13.45個，總重1.47kg，單果重109.29g;施用商品有機肥的對照中單株番茄果實平均數(shù)為12.73個，總重1.93kg，單果重151.61g;而施用MZ生物磷肥的處理中單株番茄果實平均數(shù)為13.23個，總重2.17kg，單果重164.02g。可以看出施用MZ生物磷肥和商品有機肥的單株番茄個數(shù)與不施肥料的相當(dāng)，但總產(chǎn)量和單果重均高于不施肥料的處理，其中施用MZ生物磷肥的單株產(chǎn)量和單果重量最高。[0033]實施例六:MZ腐熟劑在雙孢蘑菇栽培中的應(yīng)用試驗試驗方法:在雙孢蘑菇的培養(yǎng)料(稻草30%、玉米桿15%，麥桿5%，豬糞41.7%，尿素0.3%，石膏1%，石灰1%，過磷酸鈣1%)中，按堆料干重0.5%的比例接種MZ活菌數(shù)為4.5XIO9個/克的腐熟劑，充分混勻后將堆料水分調(diào)節(jié)到30-45%。將堆料在室內(nèi)按梯形堆垛，堆體的下底長1-1.5米，上底長0.5-1米，高0.5-1米，每3天翻堆一次，發(fā)酵8天時終止發(fā)酵。栽培雙孢蘑菇時，在拱棚內(nèi)將培養(yǎng)料鋪成1.5mX0.5mX0.25m大小的樣板，常規(guī)方法接種雙孢蘑菇菌種As2796、發(fā)菌、覆土、出菇管理，記錄出菇產(chǎn)量。以未添加腐熟劑而自然發(fā)酵的培養(yǎng)料栽培蘑菇的處理為對照，每處理3個重復(fù)。[0034]試驗結(jié)果表明:經(jīng)過MZ腐熟劑發(fā)酵8天時的培養(yǎng)料用于栽培雙孢蘑菇，產(chǎn)量為13.37kg/m2，而常規(guī)自然發(fā)酵的培養(yǎng)料栽培雙孢蘑菇的產(chǎn)量僅為10.93kg/m2，表明使用MZ腐熟劑可使雙孢蘑菇產(chǎn)量提高22.32%`。【權(quán)利要求】1.一種解磷真菌，其特征在于:該菌株為黑曲霉MZ菌株，該菌株2013年4月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號:CGMCCN0.7464。2.如權(quán)利要求1所述解磷真菌的用途，其特征在于:用于制備MZ腐熟劑。3.一種制備MZ腐熟劑的方法,其特征在于:將采用權(quán)利要求1所述的nigerMZ菌株在PDA固體培養(yǎng)基上、28°C下培養(yǎng)4d，用無菌牙簽將平板表面的菌絲和孢子刮下并接種到棉籽殼培養(yǎng)基中，28°C下培養(yǎng)4-8天后即得到MZ腐熟劑。4.如權(quán)利要求3所述的一種制備MZ腐熟劑的方法,其特征在于:所述的棉籽殼培養(yǎng)基由棉籽殼加PDA液體培養(yǎng)基混勻制成，含水量為35%-45%。5.如權(quán)利要求3所述的一種制備MZ腐熟劑的方法,其特征在于:最適宜的培養(yǎng)條件為28°C下培養(yǎng)4天。6.如權(quán)利要求2所述的MZ腐熟劑的用途，其特征在于:用于堆肥發(fā)酵農(nóng)作物秸桿來制備生產(chǎn)生物磷肥、在發(fā)酵糞草培養(yǎng)料中加速培養(yǎng)料的腐熟和提高蘑菇產(chǎn)量。7.一種利用MZ腐熟劑發(fā)酵農(nóng)作物秸桿制備生物磷肥的方法，其特征在于:農(nóng)作物秸桿經(jīng)自然風(fēng)干，粉碎成小于3cm的片段，與草碳按重量比為7:3混勻，按堆料干重的0.1%-5%的比例接種MZ腐熟劑，充分混勻后將堆料水分調(diào)節(jié)到30%-45%，將堆料在室內(nèi)按梯形堆垛，每3天翻堆一次，發(fā)酵18-21天時終止發(fā)酵，將發(fā)酵產(chǎn)物在65°C以下干至水分含量小于5%，粉碎、過篩后即得到生物磷肥。8.一種利用MZ腐熟劑發(fā)酵糞草培養(yǎng)料的方法，其特征在于:向糞草培養(yǎng)料中，按堆料干重0.1%-5%的比例接種MZ腐熟劑，充分混勻后，將堆料水分調(diào)節(jié)到30%-45%。9.將堆料在室內(nèi)按梯形堆垛，堆體的下底長1-1.5米，上底長0.5-1米，高0.5-1米，每3天翻堆一次，發(fā)酵6-10天時獲得的發(fā)酵產(chǎn)物。10.如權(quán)利要求6所述MZ腐熟劑的用途，其特征在于:所述的糞草培養(yǎng)料為雙孢菇和草燕培養(yǎng)料。11.如權(quán)利要求7所述的一種利用MZ腐熟劑發(fā)酵農(nóng)作物秸桿制備生物磷肥的方法，其特征在于:所述堆垛的下底長1-1.5m,上底長0.5-lm,高0.5_lm?！疚臋n編號】C05F11/08GK103756909SQ201310195335【公開日】2014年4月30日申請日期:2013年5月24日優(yōu)先權(quán)日:2013年5月24日【發(fā)明者】周峰,莫明和,楊舒惠申請人:山東泰豐源生物科技有限公司