專利名稱：一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法。
背景技術(shù)：
以子癇前期(preeclampsia, PE)、子癇(eclampsia)為代表的妊娠期高血壓疾病是嚴(yán)重威脅孕產(chǎn)婦和胎兒健康的重要產(chǎn)科疾病，其發(fā)病機制至今未明。母體血液循環(huán)的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜(syncytiotrophoblast microvillous membrane, STBM)因可作用于外周血管，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞失功能而被認(rèn)為是子癇前期、子癇等發(fā)病的重要因素?；卺t(yī)學(xué)研究的倫理要求和妊娠過程的特殊性質(zhì)，目前尚無法通過臨床試驗來研究合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜在人類妊娠期高血壓疾病中的具體作用及其機制。同時，由于沒有以合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜為研究靶點的動物模型，相應(yīng)的動物實驗和體內(nèi)研究也無法開展。這局限了對子癇前期、子癇等妊娠期高血壓疾病的進(jìn)一步研究。因此，建立基于STBM的妊娠期高血壓疾病動物模型，對深入研究人類子癇的病因、發(fā)生發(fā)展機制和治療具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法。本發(fā)明建立的妊娠期高血壓疾病小鼠模型具有子癇前期、子癇的特征性癥狀和體征改變，可用于研究人類妊娠期高血壓疾病的病因、發(fā)生發(fā)展機制和治療。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下措施:
本發(fā)明所述妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟:(I)將新鮮C57BL/6小鼠胎盤采用冰PBS緩沖液洗凈后剪碎成胎盤碎片；取胎盤碎片放置在0.1 0.2mol/L的NaCl溶液中，2 6°C振蕩過夜，其中所述NaCl溶液中添加了 I 2%的青-鏈霉素；取上清，差速離心:1OOOg, lOmin，棄沉淀；10000g, lOmin，棄沉淀；IOOOOOg, 60min,棄上清，得合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜富集沉淀；將合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜富集沉淀以2 6°C的PBS緩沖液洗滌，再以2 6°C的PBS緩沖液重懸，其中所述重懸步驟中PBS緩沖液中含3 7%的蔗糖，保存于_20°C備用，得合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液；(2)將上述步驟(I)所得的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液通過尾靜脈注射回輸入同種品系的孕鼠體內(nèi)。優(yōu)選地，在上述妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法中，所述步驟(I)中的C57BL/6小鼠為8 12周齡，妊娠16 20天，體重25 30g。 優(yōu)選地，在上述妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法中，所述步驟(I)中的胎盤碎片大小為I 2mm3。優(yōu)選地，在上述妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法中，所述步驟(I)中胎盤碎片質(zhì)量和NaCl溶液體積之比為Ig: 40 60ml。優(yōu)選地，在上述妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法中，所述步驟(2)中每只小鼠注射合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液中總蛋白含量為0.03 0.04mg。優(yōu)選地，在上述妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法中，所述步驟(2)中孕鼠為雌性C57BL/6小鼠，小鼠年齡為8 12周齡，孕8 20天，體重19 30g。在上述妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法中，孕鼠注射合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液后，本發(fā)明通過血壓監(jiān)測、病理檢查等方法監(jiān)測其血壓、腎臟、心肌病理改變等相關(guān)指標(biāo)變化，并觀察其有無子癇抽搐的出現(xiàn)，以判斷模型是否構(gòu)建成功。本發(fā)明建立的妊娠期高血壓疾病小鼠模型，具有血壓升高、心腎損害、子癇抽搐等妊娠高血壓和子癇特征性癥狀和體征改變,這些現(xiàn)象與人類妊娠期高血壓疾病的癥狀和病理過程相符，可用于以研究子癇前期、子癇等妊娠期高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展機制以及開發(fā)對抗子癇藥物為目的的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究。


圖1妊娠第18天雌性C57BL/6小鼠胎盤。圖2剪碎的胎盤碎片置于0.15mol/L NaCl溶液中。圖3合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜蛋白的含量檢測。圖4合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜組織多肽抗原含量檢測。圖5掃描電子顯微鏡下的C57BL/6小鼠合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜。

圖6回輸合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜(STBM)后C57BL/6小鼠血壓測定值變化。圖7回輸合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜(STBM)后C57BL/6小鼠腎臟、心臟組織病理變化。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。應(yīng)理解，本發(fā)明的實施例只用于說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明技術(shù)思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段，做出的各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例1妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法主要試劑:C57BL/6小鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物實驗中心)，青-鏈霉素溶液(GIBCO Invitrogen Life Technologies), Improved-lowry 蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，小鼠組織多肽抗原ELISA試劑盒(上海盧尚生物有限公司)。主要儀器:超速冷凍離心機(BECKMAN公司)，電子天平，酶標(biāo)儀(LabsystemsMultiskan MS)，小動物無創(chuàng)血壓儀(GENEI S0FTR0N公司)，掃描電子顯微鏡(HatchiS-3400N II)。(I)合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜的獲取和鑒定將新鮮雌性C57BL/6小鼠胎盤(圖1所示)采用冰PBS緩沖液洗去殘留血液，無菌紗布吸干表面水分，以眼科剪將胎盤剪碎為I 2_3的胎盤碎片，其中所述C57BL/6小鼠為8 12周齡，妊娠16 20天，體重25 30g ;稱取2g胎盤碎片放入80 120ml0.1
0.2mol/L的NaCl溶液中(圖2所示)，其中NaCl溶液中添加了 I 2%的青-鏈霉素，2 6 °C振蕩過夜,取上清離心,離心方法為:IOOOg, IOmin,棄沉淀；IOOOOg, IOmin,棄沉淀；IOOOOOg, 60min,棄上清，得到合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜富集沉淀。將合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜富集沉淀以lml2 6°C的PBS緩沖液洗滌，并以1.2ml2 6°C的PBS緩沖液(5%蔗糖)重懸，得到合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液，保存于_20°C備用。使用Improved-lowry蛋白定量試劑盒,按照說明書嚴(yán)格操作測定所得合體滋養(yǎng)細(xì)胞微續(xù)毛 旲總蛋白的含量，測定結(jié)果如圖3所不，總蛋白含量為(0.69±0.12) mg/ml ；以組織多肽抗原為標(biāo)記，使用小鼠組織多肽抗原ELISA試劑盒，按說明書嚴(yán)格操作測定所得合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜組織中多肽抗原(tissue polypeptide antigen, TPA)的含量,測定結(jié)果如圖4所示，組織多肽抗原含量為(61.49±9.78)ng/ml。如果總蛋白定量偏高而組織多肽抗原定量偏低，則所得合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜純度差，反之純度較好；由上述測定結(jié)果可知，本發(fā)明方法提取、富集的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜純度相對較好，且穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強。掃描電子顯微鏡觀察:取0.2ml所得合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液，加入等體積的2.5%戊二醛，固定四小時后滴到直徑約IcmXlcm的云母片上，自然風(fēng)干，鍍金，上機觀察，結(jié)果如圖5所示，由圖可見所得合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜為直徑約200 500nm的囊泡狀結(jié)構(gòu)。由上述實驗結(jié)果可知，本發(fā)明制備的小鼠合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜產(chǎn)量大、濃度高，與人合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜在形態(tài)和蛋白標(biāo)記物方面高度相似。(2)妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立和鑒定取實施例1制備的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液，以2 6°C的PBS緩沖液調(diào)整濃度并配制成總蛋白濃度為0.15mg/ml和0.2mg/ml的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液。取8 12周齡雌性C57BL/6小鼠，體重19 23g，小鼠在孕8 13天的范圍內(nèi)較好，本實施例取孕10天，分為3 組,每組6只；將200 μ I總蛋白濃度為0.15mg/ml的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液，隔日經(jīng)尾靜脈回輸孕鼠體內(nèi)，作為實驗組，同時以分別注射回輸?shù)润w積的PBS緩沖液和生理鹽水組為對照組。持續(xù)無創(chuàng)檢測孕鼠血壓，6次/日；每組取3只小鼠于孕19天處死后取腎臟和心臟行組織病理檢查。在回輸?shù)?天，實驗組孕鼠無論收縮壓及舒張壓均顯著高于對照組，如圖6所示，P<0.05。孕19天處死后取腎臟和心臟行組織病理檢查發(fā)現(xiàn):實驗組腎臟病理呈子癇疾病表現(xiàn)，腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，腎小管上皮廣泛濁腫、空泡樣變性；心肌組織病理則呈為肌纖維肥大、間質(zhì)水腫、點狀壞死等妊娠期高血壓性心臟病表現(xiàn)，如圖7所示。取8 12周齡雌性C57BL/6小鼠，體重25 30g，小鼠在孕18 20天的范圍內(nèi)較好，最好為孕19天,分為3組,每組3只；將200 μ I總蛋白濃度為0.2mg/ml的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液，經(jīng)尾靜脈回輸孕鼠體內(nèi)，作為實驗組，同時以分別注射回輸?shù)润w積的PBS緩沖液和生理鹽水組為對照組。實驗組發(fā)生于2 5分鐘后發(fā)生類似子癇抽搐樣癥狀，全身及四肢肌強直，四肢屈曲，趾部蜷曲，迅速發(fā)生強烈抽動，持續(xù)時間約2-5min，后抽搐停止，肌肉松弛，呼吸運動微弱，持續(xù)約5-10分鐘后孕鼠死亡。而對照組均未出現(xiàn)抽搐及其他異常表現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將新鮮C57BL/6小鼠胎盤采用冰PBS緩沖液洗凈后剪碎成胎盤碎片；取胎盤碎片放置在0.1 0.2mol/L的NaCl溶液中，2 6°C振蕩過夜，其中所述NaCl溶液中添加了1 2%的青-鏈霉素；取上清，差速離心:1000g, 10min,棄沉淀；10000g, 10min,棄沉淀；100000g, 60min,棄上清，得合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜富集沉淀；將合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜富集沉淀以2 6°C的PBS緩沖液洗滌，再以2 6°C的PBS緩沖液重懸，其中所述重懸步驟中PBS緩沖液中含3-7%的蔗糖，保存于_20°C備用，得合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液； (2)將上述步驟(1)所得的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液通過尾靜脈注射回輸入同種品系的孕鼠體內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于:所述步驟(1)中的C57BL/6小鼠為8 12周齡，妊娠16 20天，體重25 30g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于:所述步驟(1)中的胎盤碎片大小為I 2mm3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于:所述步驟(1)中胎盤碎片質(zhì)量和NaCl溶液體積之比為Ig: 40 60ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于:所述步驟(2)中每只小鼠注射合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜混懸液中總蛋白含量為0.03 .0.04mg.
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于:所述步驟(2)中孕鼠為雌性C57BL/6小鼠，小鼠年齡為8 12周齡，孕8 20天，體重19 30g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法。該妊娠期高血壓疾病小鼠模型的建立方法通過從小鼠胎盤中提取合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜，并將其通過尾靜脈注射回輸入同種品系的孕鼠體內(nèi)，構(gòu)建妊娠期高血壓疾病小鼠模型。本發(fā)明建立的妊娠期高血壓疾病小鼠模型具有血壓升高、子癇抽搐、心腎損害等妊娠期高血壓疾病特征性癥狀和體征改變，這些現(xiàn)象與人類子癇前期、子癇等妊娠期高血壓疾病的癥狀和病理過程相符，可用于以研究子癇前期、子癇等妊娠期高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展機制以及開發(fā)對抗藥物為目的的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究。
文檔編號A01K67/027GK103224906SQ201310162749
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者李力, 韓健, 胡炯宇, 李怡琳, 劉曉潔 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院