專利名稱：一種植物維管組織特異表達(dá)啟動子及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及楊樹基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及分離得到的楊樹(PopulusdeltoidesXP. euramericana cv. ‘Nanlin895’)抗真菌蛋白基因類奇甜蛋白/ / 基因的啟動子，其能夠驅(qū)動一個多核苷酸序列或目的基因在植物細(xì)胞中高水平表達(dá)，并且在植物維管組織中特異表達(dá)。
背景技術(shù)：
楊屬{Populus )植物作為木本植物中的模式植物，具有優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)特性，包括容易進(jìn)行種間雜交和無性繁殖；生長迅速，并已建立完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系；基因組相對較小，約450-550Mbp ;易于進(jìn)行遺傳研究。因此，模式植物-楊樹的基因表達(dá)調(diào)控的研究，為弄清木本植物的生長發(fā)育調(diào)控機(jī)理提供證據(jù)。啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游的一段DNA序列，能與RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合，控制基因轉(zhuǎn)錄起始時間和表達(dá)的程度，是基因轉(zhuǎn)錄最主要的一種調(diào)節(jié)方式。啟動子中包含多種重要的順式作用元件，其類型直接影響著基因的表達(dá)量及表達(dá)位點(diǎn)。因此，啟動子的分離與分析是研究基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵所在。目前在植物表達(dá)載體中使用的大多為組成型的強(qiáng)啟動子來自玉米的Ubiquitin啟動子和來自水稻的Actin啟動子,花椰菜葉病毒CaMV 35S啟動子和胭脂堿氨酸合成酶Nos啟動子。組成型啟動子可以使外源基因持續(xù)恒定的表達(dá)，但是外源基因的組成型表達(dá)不僅造成資源的浪費(fèi)，重復(fù)使用同一種啟動子驅(qū)動兩個或兩個以上的外源基因還可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象，此外還會引發(fā)轉(zhuǎn)基因植物安全性問題，因此，有必要在楊樹基因工程中采用組織器官特異性或逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動子，這樣既可以是外源基因在楊樹特異組織器官中或受到逆境脅迫時高效表達(dá)，又不影響植物體的正常生長發(fā)育。目前，已經(jīng)克隆的在楊樹組織器官中特異表達(dá)或誘導(dǎo)型啟動子還比較少。李強(qiáng)等分別從歐洲黑楊和美洲黑楊中克隆到機(jī)械損傷誘導(dǎo)表達(dá)_Win3基因啟動子WINP和WIDP，結(jié)果表明二者控制的GUS基因的表達(dá)不僅在損傷部位，還具有系統(tǒng)的因傷誘導(dǎo)效應(yīng)。蔣浩等克隆到楊樹樹皮儲藏蛋白BSP基因啟動子，通過煙草轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，該啟動子具有韌皮部表達(dá)特性，介導(dǎo)⑶S基因在轉(zhuǎn)基因煙草韌皮部特異表達(dá)。張爽等從三倍體毛白楊-93中分離得到了 MDCesAP這一木質(zhì)部纖維素合酶基因啟動子，結(jié)果表明MDCesAP為木質(zhì)部特異性啟動子。霍秀文等利用PCR方法從擬南芥基因組DNA中擴(kuò)增得到了轉(zhuǎn)錄因子上游的DNA片段，初步表明該啟動子為誘導(dǎo)型啟動子。隨著楊樹的廣泛栽培，病害的發(fā)生越來越嚴(yán)重，在我國，主要的楊樹病害有葉銹病、楊樹黑斑病、楊樹炭疽病、白粉病、黑星病、潰瘍病、爛皮病、枝瘤病、干腐病、紫根病等等，已嚴(yán)重威脅楊樹的生長和木材質(zhì)量，單純依靠常規(guī)育種和噴灑農(nóng)藥的方法已不能從根本上解決問題。隨著世界生態(tài)環(huán)境的日益加劇，以及地理和氣候的限制，楊樹抗性育種顯得更加迫切。因此，尋找一周期短、效率高的新育種方法的工作已刻不容緩，并引起國內(nèi)外林業(yè)研究者的普遍關(guān)注。
到目前為止，已經(jīng)研究可用于林木抗真菌病基因工程的誘導(dǎo)型啟動子幾乎沒有，因此，抗真菌基因啟動子的研究對于楊樹生長和木材質(zhì)量的提高有著非常重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種植物維管組織特異表達(dá)啟動子，可用于楊樹抗 真菌病基因工程育種，可以驅(qū)動目的基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)，并且在植物維管組織中特異表達(dá)。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述植物維管組織特異表達(dá)啟動子的表達(dá)載體。本發(fā)明還有一目的是提供一種上述植物維管組織特異表達(dá)啟動子的應(yīng)用。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種植物維管組織特異表達(dá)啟動子，核苷酸序列如SEQ NOl所示。含有植物維管組織特異表達(dá)啟動子的表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體為pJIT166-pPeTLP2-GFP融合表達(dá)載體和pBin-pPeTLP2_GUS融合表達(dá)載體。所述表達(dá)載體中的GUS或GFP可以被多種目的基因取代，例如抗蟲的Bt毒素蛋白基因和胰蛋白酶抑制劑CpTi基因。所述的植物維管組織特異表達(dá)啟動子在楊樹維管組織中特異表達(dá)抑制真菌基因中的應(yīng)用。所述的表達(dá)載體在楊樹維管組織中特異表達(dá)抑制真菌基因中的應(yīng)用。所述的植物維管組織特異表達(dá)啟動子在培育抗真菌病楊樹新品種中的應(yīng)用。所述的表達(dá)載體在培育抗真菌病楊樹新品種中的應(yīng)用。本發(fā)明采用同源克隆-PCR的方法，克隆了楊樹抗真菌類奇甜蛋白PeTLP2基因的翻譯起始位點(diǎn)上游調(diào)控序列2078bp，該啟動子命名為pPeTLP2。通過plantCARE軟件進(jìn)行了 pPeTLP2的啟動子順式元件及其功能的預(yù)測。其中含有各種激素響應(yīng)、光響應(yīng)順式元件，另外還有真菌誘導(dǎo)物響應(yīng)元件Box-Wl，以及誘導(dǎo)物響應(yīng)元件EIER。由于類奇甜蛋白(PeTLP2)基因可以抑制真菌根霉(Rhizopus sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、桔青霉(Penicillium citrinum)和鏈格抱(Alternaria sp.)。因此可以人為 pPeTLP2 可能屬于真菌誘導(dǎo)型啟動子。本發(fā)明根據(jù)啟動子pPeTLP2序列，設(shè)計正反向引物，分別引入SacI和SalI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了啟動子pPeTLP2與綠色熒光蛋白(GFP)融合的瞬時表達(dá)載體pJIT166-pPeTLP2-GFP，通過基因槍轉(zhuǎn)化方法，將pJIT166-pPeTLP2_GFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，通過激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的分布情況，從而驗(yàn)證啟動子pPeTLP2的活性，并分析啟動子pPeTLP2在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，啟動子pPeTLP2在洋蔥表皮細(xì)胞中能夠驅(qū)動報告基因GFP的高效表達(dá)，驅(qū)動效率類似于2個串聯(lián)35S啟動子的活性；另外，啟動子pPeTLP2可以驅(qū)動報告基因在洋蔥表皮細(xì)胞中細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、以及質(zhì)膜上表達(dá)，而不在細(xì)胞壁上表達(dá)。因此，啟動子pPeTLP2在植物細(xì)胞中可以高效表達(dá)，作用位置包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上。本發(fā)明根據(jù)啟動子pPeTLP2序列，設(shè)計正反向引物，分別引入Sal I和SacI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBin-pPeTLP2-GUS，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的floral-dip法，將pBin-pPeTLP2-GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，通過組織化學(xué)法⑶S染色，觀察啟動子pPeTLP2在植物細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及植物組織定位情況。首先通過PCR的方法檢測轉(zhuǎn)基因Tl代植株。本發(fā)明使用了 3對不同的引物來檢測擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，包括npt II基因特異性引物、pPeTLP2特異引物和udiA (CTS)特異引物，分別擴(kuò)增得到521bp、2078bp和441bp的特異片段。另外,還通過Southern雜交進(jìn)一步分析了啟動子pPeTLP2轉(zhuǎn)入擬南芥基因組的拷貝數(shù)，結(jié)果表明，啟動子pPeTLP2成功整合到擬南芥基因組中。最后通過GUS染色，進(jìn)一步確認(rèn)pBin-pPeTLP2-GUS融合蛋白已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染擬南芥基因組，而且該啟動子只作用于根、莖和葉的維管部位，其他部位不表達(dá)。本發(fā)明涵蓋上述兩種植物表達(dá)載體瞬時表達(dá)載體pJIT166-pPeTLP2_GFP和植物表達(dá)載體pBin-pPeTLP2-GUS。表達(dá)載體中的報告基因GFP或⑶S可以被多種目的基因取代。而目的基因以正義或反義與啟動子連接均可。
有益效果本發(fā)明的維管組織特異性啟動子，能將目的基因的表達(dá)限制在維管組織部分，這就有效避免了外源蛋白在其他組織中的積累及減輕某些有毒物質(zhì)對植物的毒害，使目的基因在植物維管組織中高效特異持久表達(dá)。應(yīng)用本發(fā)明的啟動子在楊樹育種工程中，可用來培育抗真菌病楊樹新品種，為利用基因工程手段增強(qiáng)楊樹對真菌病的抗性方面奠定基礎(chǔ)，拓寬轉(zhuǎn)基因技術(shù)在楊樹育種領(lǐng)域的應(yīng)用前景。


圖I是通過plantCARE軟件對啟動子pPeTLP2序列中順式作用元件預(yù)測結(jié)果圖；圖中，每一個順式元件均有元件名稱的標(biāo)注，序列末端為起始密碼子ATG;從上至下連續(xù)分為圖1_1和圖1~2 ；
圖2是pJIT166-pPeTLP2-GFP瞬時表達(dá)載體結(jié)構(gòu) 圖3是pPeTLP2啟動子亞細(xì)胞定位研究結(jié)果圖；圖中，a，b，C，陽性對照35S (2X)GFP ；d，e, f，pPeTLP2: :GFP融合表達(dá)載體；g，h，i，利用20%蔗糖溶液，對發(fā)現(xiàn)綠色熒光的陽性細(xì)胞(對應(yīng)于d，e, f)進(jìn)行質(zhì)壁分離；a，d，g，GFP視場；b，e, h，明亮視場；c，f，i，組合視場；圖4是pBin-pPeTLP2-GUS表達(dá)載體結(jié)構(gòu) 圖5是pBin-pPeTLP2-GUS表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥陽性轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果圖；圖中，上521bp的npt II基因；中2078bp的pPeTLP2啟動子片段；下441bp的udiA ( β -葡萄糖醛酸酶(⑶S))基因；
圖6是pBin-pPeTLP2-GUS表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥陽性轉(zhuǎn)基因植株的的Southern雜交分析結(jié)果圖；圖中，M,marker (bp);P,陽性對照；N,陰性對照；L1_L7 :擬南芥轉(zhuǎn)基因Tl代陽性植株；
圖7是pBin-pPeTLP2-GUS表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥陽性轉(zhuǎn)基因植株的⑶S組織化學(xué)染色分析結(jié)果圖；圖中，a，陽性植株LI ;b，陽性植株L3 ;c，陽性植株L5 ;d，未轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥植株作為陰性對照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明，實(shí)施例中所使用的方法，除有特別說明外，均參照分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊或其他現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。實(shí)施例I啟動子pPeTLP2序列的獲得
本實(shí)施例根據(jù)已經(jīng)測序了的楊樹-毛果楊(Populus trichocarpa)基因組數(shù)據(jù)庫(http://www. phytozome. net/search. php method=Org_Ptrichocarpa)中的基因 Pt0LP25 '上游序列，設(shè)計了一對特異引物pPeTLP2-F (5 ' -TATCCTCTTCCGCCACCGTGTT-3 ')，pPeTLP2-R (5' -GGCCGTTGCATTCGATTCTGTT-3 ')，從‘南林 895’ 基因組中分離到 PeTLP2基因翻譯起始位點(diǎn)上游調(diào)控序列2078bp，該啟動子命名為pPeTLP2，序列如SEQ NOl所示。PCR具體過程如下
模板制備利用CTAB法提取‘南林895’楊葉片DNA，以該DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；20 μ L PCR 反應(yīng)體系10ng 模板 DNA，I μ L pPeTLP2_F (10 μ M)，I μ L pPeTLP2_R(10μΜ),2μ L PCR Buffer (10X ), I. 5μ L dNTP (2. 5mM), I. 2μ L MgCl2 (25mM),0. 3μ LPCR聚合酶，ddH20補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)程序95 °C，5min ；94 °C，45s, 56 °C，45s, 72 °C，lmin, 29cycles ；72 °C，IOmin ； 10°C,IOmin0獲得目的片段之后，連接測序載體PMD T-18載體(TAKARA公司產(chǎn)品)，將樣品送上海英駿測序公司測序，從而得到pPeTLP2啟動子序列。通過plantCARE軟件進(jìn)行了 pPeTLP2的啟動子順式元件及其功能的預(yù)測，結(jié)果如圖I和表I所示，其中含有各種激素響應(yīng)、光響應(yīng)順式元件，另外還有真菌誘導(dǎo)物響應(yīng)元件Box-Wl，以及誘導(dǎo)物響應(yīng)元件EIER。類奇甜蛋白(PeTLP2)基因可以抑制真菌根霉(Rhizopus sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、桔青霉(Penicillium citrinum)和鏈格抱(Alternaria sp.)。因此可以認(rèn)為pPeTLP2啟動子屬于真菌誘導(dǎo)型啟動子。表I顯示啟動子pPeTLP2序列中順式作用元件功能預(yù)測表
權(quán)利要求
1.一種植物維管組織特異表達(dá)啟動子，核苷酸序列如SEQ NOl所示。
2.含有權(quán)利要求I中所述植物維管組織特異表達(dá)啟動子的表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于；所述的表達(dá)載體為pJIT166-pPeTLP2-GFP融合表達(dá)載體或pBin-pPeTLP2_GUS融合表達(dá)載體。
4.據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的GUS或GFP可被抗蟲的Bt毒素蛋白基因取代，或被胰蛋白酶抑制劑CpTi基因取代。
5.權(quán)利要求I所述的植物維管組織特異表達(dá)啟動子在楊樹維管組織中特異表達(dá)抑制真菌基因中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體在楊樹維管組織中特異表達(dá)抑制真菌基因中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述的植物維管組織特異表達(dá)啟動子在培育抗真菌病楊樹新品種中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體在培育抗真菌病楊樹新品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物維管組織特異表達(dá)啟動子及其表達(dá)載體和應(yīng)用，植物維管組織特異表達(dá)啟動子為真菌誘導(dǎo)型啟動子，核苷酸序列如SEQNO1所示。含有植物維管組織特異表達(dá)啟動子的表達(dá)載體為pJIT166-pPeTLP2-GFP融合表達(dá)載體和pBin-pPeTLP2-GUS融合表達(dá)載體。該植物維管組織特異表達(dá)啟動子可以驅(qū)動目的基因在轉(zhuǎn)基因植株的維管部位高效特異表達(dá)，在其他部位不表達(dá)。應(yīng)用本發(fā)明的啟動子在楊樹育種工程中，可用來培育抗真菌病楊樹新品種。
文檔編號A01H5/00GK102876678SQ20121038284
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者諸葛強(qiáng), 王立科, 楊立恒, 周潔, 于娟, 董靜 申請人:南京林業(yè)大學(xué)