專利名稱：一種大蒜試管鱗莖的誘導方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術領域，涉及大蒜組織培養(yǎng)與快繁的方法，更具體的說是一種誘導大蒜的試管鱗莖培養(yǎng)基及其快繁的方法。
背景技術：
大蒜(Alliumsatira )是無性繁殖植物，由于長期的無性繁殖,大蒜積累了大量的病毒，嚴重影響了大蒜的品質(zhì)、產(chǎn)量以及商品性。以色列科學家通過低溫誘導、光周期調(diào)控和營養(yǎng)控制促使大蒜開花，獲得大蒜種子，通過種子繁殖和改良大蒜品種取得了可喜進展，然而，由于大蒜種子的生物量小，獲得實生苗的數(shù)量有限，加上種子獲得要求條件高，所以通過大蒜開花接種子來繁殖大蒜仍然處于探索階段。到目前為止，大蒜的快繁、脫毒、種質(zhì)創(chuàng)新主要靠離體培養(yǎng)的方法。大蒜離體脫毒快繁主要有三種途徑
第一是愈傷組織途徑大蒜通過外植體(莖尖、莖盤等)誘導愈傷組織培養(yǎng)，繼而誘導再生苗是一種重要快繁手段，但愈傷組織途徑快繁，由于需要經(jīng)過細胞脫分化和再分化過程獲得組織培養(yǎng)苗，大量的遺傳變異和組培苗難以移栽成活嚴重影響了人們對這種方法在生產(chǎn)實踐中的推廣；
第二，離體誘導叢生苗途徑該方法不通過愈傷組織誘導培養(yǎng)，而是直接用大蒜外植體誘導不定芽，不定芽培養(yǎng)成叢生苗，叢生苗通過誘導生根形成試管苗，該方法避免了細胞脫分化和再分化對大蒜遺傳變異的影響，對大蒜種質(zhì)保持有重要的積極作用(徐培文等，山東農(nóng)業(yè)科學，1998)。上述兩種方法制約大蒜繁殖系數(shù)的瓶頸問題是試管苗移栽成活率不高(宋淑敏等，黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2012)；
第三是利用氣生鱗莖和試管鱗莖途徑
(1)氣生鱗莖繁殖法研究表明，有些工作者用大蒜的氣生鱗莖(天蒜)做種子進行大蒜的脫毒、快繁，取得了一定的進展，且早在1964年吳鵬(1964，中國農(nóng)業(yè)科學)通過精細挑選和合理栽培，實現(xiàn)了氣生鱗莖第一年結(jié)出分瓣大蒜。更多的報導是，利用天蒜做種子繁殖大蒜，由于只有成熟的天蒜才能做種子，不成熟或幼嫩的天蒜(確切的說是氣生鱗芽)做種子，因其營養(yǎng)不足，出苗率降低，降低了繁殖效率。同時，為了獲得更多的成熟的、可以用作種子的天蒜，人們不得不讓留天蒜的蒜薹充分生長，這樣，其生長必然會爭奪地蒜的營養(yǎng)，影響地蒜的產(chǎn)量，降低種蒜的收益。張紹文等(中國蔬菜，1994)對大蒜氣生鱗莖利用價值進行研究，用的是成熟的天蒜，用天蒜作播種材料其增殖倍數(shù)均在30倍以上，但留天蒜植株的地蒜重量較不留株減產(chǎn)22. 6%-33% ；
(2)試管鱗莖繁殖法
由于試管苗(不管是從愈傷組織中還是叢生苗中獲得的)馴化作為微繁殖與大田生產(chǎn)相銜接的關鍵環(huán)節(jié)，需要非常嚴格的馴化條件和管理操作，馴化過程中試管苗在離體條件下形成的根系往往不能發(fā)揮作用，需要發(fā)生新根系，導致恢復生長緩慢，死苗率高，而試管鱗莖具有較強的抗逆性，不需馴化即可直接移栽到大田，并且試管鱗莖具有較好的貯藏性，可以不受大田生長季節(jié)的限制，所以試管鱗莖的培育為大蒜脫毒種苗商品化生產(chǎn)提供有效途徑(劉高瓊等，南京農(nóng)業(yè)大學學報，1996;萬麗，南京農(nóng)業(yè)大碩士論文，2004;)。張素芝等(2007，山東農(nóng)業(yè)大學學報)建立了大蒜花苞不定芽再生體系，他們用大蒜花苞為外植體，在不同的激素配比條件下(MS+NAA+KT)，體外誘導不定芽，平均每個花苞誘導不定芽的個數(shù)最多為19. 2，在不加激素的培養(yǎng)基上，這些不定芽誘導成試管鱗莖的頻率最高可達82. 9%。這種方法有效地利用了大蒜花苞具有誘導不定芽能力強的特點，同時借鑒了前人利用試管鱗莖快繁效率高的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開了一種大蒜試管鱗莖的誘導方法，它是按如下的步驟進行
(1)大蒜花苞采摘及處理 田間種植的大蒜甩辮后7-10天，采摘花苞200個，每個花苞帶15-20cm的假莖，置太陽下晾曬，將花苞平均分成2份，用硫酸紙將帶假莖的花苞包好，外套敞口的塑料保鮮袋；
(2)低溫誘導氣生鱗芽
將幼嫩大蒜花苞在4-6°C冰箱中低溫誘導30天，待長出氣生鱗芽后將將外衣和假莖去除備用；
(3)復壯氣生鱗芽
A.以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在IL培養(yǎng)基中加a-萘乙酸0.5mg，激動素2.5mg，蔗糖30g，瓊脂7. 5g，定容至1000ml，pH值調(diào)為5. 8，在121 °C、I. Ikg / cm高溫高壓滅菌20min，待滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至60°C時，分裝到IOOml的培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml培養(yǎng)基，把口封好以防染菌，備用；
B.將低溫誘導生出的氣生鱗芽解剖，剝離單個氣生鱗芽，流水沖洗5-10min，75%酒精消毒l_3min，10%安替福民消毒4-8min，蒸餾水沖洗3-5次，超凈臺上接種；在人工氣候箱中復壯培養(yǎng)，培養(yǎng)條件25°C，光照12h/d，光強度2000LX ；
(4)試管鱗莖的誘導
以MS為基本培養(yǎng)基，在ILMS基本培養(yǎng)基中加入60g/L蔗糖，然后再將復壯的氣生鱗芽直接接種到此培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件是25°C，光照12h/d，光強度2000LX，40天后統(tǒng)計試管鱗
莖誘導率。本發(fā)明所述的NAA是a_萘乙酸(1-naphthlcetic acid),簡稱NAA ；
KT是激動素(Kinetin)，簡稱KT ；
所述的MS基本培養(yǎng)基配方
每 IL基本培養(yǎng)基中含有KNO3 1900mg, NH4NO3 1650mg, MgSO4 7H20 370 mg, KH2PO4170 mg, CaCl2 2H20 440 mg, MnSO4 4H20 22. 3 mg, ZnSO4 7H20 8. 6 mg, H3BO3 6. 2mg, KI 0. 83 mg, Na2MO3 2H20 0. 25 mg, CuSO4 5H20 0. 025 mg, CoCl2 6H20 0. 025mg, Na2-EDTA 37. 7 mg, FeSO4 7H20 27. 8 mg,甘氨酸 2. 0 mg,鹽酸硫胺素 0. 4 mg,鹽酸批唆素0. 5 mg,煙酸0. 5 mg,肌醇100 mg。本發(fā)明用到的復壯氣生鱗芽培養(yǎng)基為常規(guī)的培養(yǎng)基，主要用在大蒜不定芽誘導(張素芝，2004)；
試管鱗莖誘導的培養(yǎng)基，主要用于從試管鱗芽到試管鱗莖的誘導。
寶坻大蒜是天津市重要經(jīng)濟作物，具有獨特的風味和重要的醫(yī)用及商品價值。寶坻大蒜系早抽薹型大蒜，本發(fā)明通過適時摘取大蒜花苞，經(jīng)過低溫物理方法處理獲得大蒜氣生鱗芽，再在加激素培養(yǎng)基上(2. 5mg KT和0. 5mg NAA)復壯氣生鱗芽，進而在無激素培養(yǎng)基上誘導試管鱗莖，提高了繁殖效率。下面本發(fā)明以典型的天津市寶坻大蒜快繁為代表，更加具體的說明實施方案
一、大蒜花苞采摘及處理
田間種植的天津?qū)氎娲笏?六瓣紅)甩辮后7-10天，此時蒜薹尚嫩，氣生鱗莖初步形成但沒有成熟，這時采摘，既不影響氣生鱗芽的形成率，也不會爭奪地蒜的營養(yǎng)而影響地蒜的收益。采摘前一天用自來水仔細沖洗花苞去除灰塵和病蟲等，上午晴好天氣，10-12點采摘花苞200個，每個花苞帶15-20cm的假莖，置太陽下晾曬以使假莖斷口處水分蒸發(fā)并稍有萎蔫。將花苞平均分成2份，用硫酸紙將帶假莖的花苞包好，外套敞口的塑料保鮮袋，一份放A 4°C冰箱中，低溫誘導30d ;—份放在室溫下做對照。 二、低溫誘導氣生鱗芽
在室溫下放置的花苞，兩周后假莖腐爛，連帶花苞染菌腐爛，有較小的氣生鱗芽長出，但由于染菌不再作為試管鱗莖誘導實驗材料。經(jīng)過低溫誘導30天的花苞，在其所連帶的假莖提供的營養(yǎng)下，繼續(xù)生長、熟化，原來的幼嫩的花苞里面，擠滿了飽滿的氣生鱗芽(


圖1)，這時的氣生鱗芽一部分已經(jīng)發(fā)育成較為成熟的氣生鱗莖(圖I箭頭I所示，紅色的氣生鱗芽)，但大部分的氣生鱗芽沒有成熟(圖I箭頭2所示，白色的氣生鱗芽)，花苞外衣已被撐破，假莖營養(yǎng)已經(jīng)消耗殆盡，黃化萎蔫，復壯培養(yǎng)前將花苞外衣和假莖去除。本發(fā)明用4°C低溫誘導大蒜花苞100個，每一個花苞均有氣生鱗芽誘導出來，誘導率為100%。每個花苞中平均誘導氣生鱗芽25個。三、氣生鱗芽復壯
低溫誘導的氣生鱗芽不適合直接用于種植，因為這樣的鱗芽生物量小，很難成長為可以大田種植、收獲大蒜的的幼苗。本發(fā)明以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在IL培養(yǎng)基中加NAA
0.5mg, KT 2. 5mg,蔗糖 30g，瓊脂 7. 5g，定容至 1000ml，pH值調(diào)為 5. 8，在 121°C、I. Ikg /cm高溫高壓滅菌20min。待滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至60°C時，分裝到IOOml的培養(yǎng)瓶中，每瓶約20ml培養(yǎng)基，把口封好以防染菌，備用。將低溫誘導的花苞解剖，剝離單個氣生鱗芽，流水沖洗5min，75%酒精消毒lmin，10%安替福民消毒4min，蒸餾水沖洗5次，超凈臺上接種。其接種的方法用滅菌的鑷子小心夾取氣生鱗芽，輕輕按壓到培養(yǎng)基中，然后迅速蓋上培養(yǎng)瓶蓋。每瓶中接種氣生鱗芽5顆，共20瓶；在人工氣候箱(德國MMM公司產(chǎn)，型號MC001640)中復壯培養(yǎng)，培養(yǎng)條件25°C，光照12h/d，光強度2000LX。四、試管鱗莖的誘導
復壯的氣生鱗芽直接接種到試管鱗莖誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件是25°C，光照12h/d，光強度2000LX。40天后統(tǒng)計試管鱗莖誘導率。試管鱗莖誘導培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，通過不同的激素配比和碳量供給，共設6組處理，表I是不同激素和碳配比對試管鱗莖誘導率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第I組培養(yǎng)基配比試管鱗莖的誘導率最高,為100%。由此得出結(jié)論，氣生鱗芽在進行試管鱗莖誘導時不需要外加激素。
表I不同激素和碳配比對試管鱗莖誘導率的影響
權利要求
1.一種大蒜試管鱗莖的誘導方法，其特征在于按如下的步驟進行 (1)大蒜花苞采摘及處理 田間種植的大蒜甩辮后7-10天，采摘花苞200個，每個花苞帶15-20cm的假莖，置太陽下晾曬，將花苞平均分成2份，用硫酸紙將帶假莖的花苞包好，外套敞口的塑料保鮮袋； (2)低溫誘導氣生鱗芽 將幼嫩大蒜花苞在4-6°C冰箱中低溫誘導30天，待長出氣生鱗芽后將將外衣和假莖去除備用； (3)復壯氣生鱗芽 A.以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在IL培養(yǎng)基中加a-萘乙酸0.5mg，激動素2.5mg，蔗糖30g，瓊脂7. 5g，定容至1000ml，pH值調(diào)為5. 8，在121 °C、I. Ikg / cm高溫高壓滅菌20min，待滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至60°C時，分裝到IOOml的培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml培養(yǎng)基，把口封好以防染菌，備用； B.將低溫誘導生出的氣生鱗芽解剖，剝離單個氣生鱗芽，流水沖洗5-10min，75%酒精消毒l_3min，10%安替福民消毒4-8min，蒸餾水沖洗3_5次，超凈臺上接種；在人工氣候箱中復壯培養(yǎng)，培養(yǎng)條件25°C，光照12h/d，光強度2000LX ； (4)試管鱗莖的誘導 以MS為基本培養(yǎng)基，在ILMS基本培養(yǎng)基中加入60g/L蔗糖，然后再將復壯的氣生鱗芽直接接種到此培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件是25°C，光照12h/d，光強度2000LX，40天后統(tǒng)計試管鱗莖誘導率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大蒜試管鱗莖誘導的新方法。主要用4℃低溫處理大蒜幼嫩花苞誘導氣生鱗芽，在MS+2.5mgKT+0.5mgNAA培養(yǎng)基上復壯氣生鱗芽，在不加激素的MS+60g/L蔗糖培養(yǎng)基上誘導試管鱗莖，提高用氣生鱗莖做種子進行大蒜快繁的繁殖效率，降低了成本。本發(fā)明的積極效果是，利用該方法氣生鱗芽誘導率可達到100%(每個花苞均可以誘導出氣生鱗芽)，每個花苞平均可誘導出25顆氣生鱗芽，氣生鱗芽全部可以誘導成試管鱗莖，試管鱗莖誘導率達100%。由于在整個誘導過程中，沒有發(fā)生細胞脫分化和再分化，從而降低了遺傳突變幾率,該發(fā)明為大蒜快繁工廠化育苗提供重要的可能性。
文檔編號A01H4/00GK102792887SQ201210263069
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權日2012年7月27日
發(fā)明者王振英, 李轉(zhuǎn)春, 彭愛芳, 劉曉穎, 范寶莉, 陳宏 申請人:天津師范大學