專利名稱：培育蛹蟲草抗退化菌種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 屬于真菌的制種領(lǐng)域，具體涉及一種蛹蟲草菌種培育的新技術(shù)。通過這種方法，能得到抗退化的優(yōu)質(zhì)菌種。
背景技術(shù)：
蛹蟲草子實(shí)體[Cordyceps militaris]又稱北冬蟲夏草子實(shí)體或子座,簡(jiǎn)稱北蟲草，子囊菌亞門，麥角菌科，蟲草屬。近年來(lái)人工培養(yǎng)子實(shí)體遍及城鄉(xiāng)，已成為我國(guó)的一個(gè)新興產(chǎn)業(yè)。但無(wú)論是專業(yè)人員還是專業(yè)公司，在栽培實(shí)踐中往往出現(xiàn)只長(zhǎng)菌絲不長(zhǎng)草(子實(shí)體)、不轉(zhuǎn)色，或草的產(chǎn)量低、質(zhì)量差等問題。有效成份含量極少且不穩(wěn)定，不但難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，甚至使眾多生產(chǎn)者絕收破產(chǎn)。究其原因，主要是菌種退化，菌種不能繼代使用。菌種往往只能使用一次，勉強(qiáng)繼代使用也不超過兩代。眾多技術(shù)人員為防止菌種退化，用盡了各種傳統(tǒng)的制種辦法，如組織分離優(yōu)選部位、孢子分離選優(yōu)、提純復(fù)壯、引進(jìn)優(yōu)種、雜交選優(yōu)等，但始終阻止不了菌種的快速退化。盡管諸多專家學(xué)者發(fā)表了不少論文意見，但理論要變成實(shí)踐意義上的生產(chǎn)力尚需要漫長(zhǎng)的時(shí)間。蛹蟲草菌種的快速退化，已成為該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。對(duì)廣大生產(chǎn)者來(lái)說，菌種快速退化問題亟待解決。本發(fā)明就是在多年的生產(chǎn)實(shí)踐中總結(jié)出來(lái)的簡(jiǎn)便易行的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種培育蛹蟲草抗退化菌種的方法，所得到的蛹蟲草抗退化菌種，可連續(xù)十次繼代使用。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種培育蛹蟲草抗退化菌種的方法，包括下列步驟(I)培養(yǎng)優(yōu)勝種制備有伴生菌生長(zhǎng)的蛹蟲草母種管，PDA培養(yǎng)基+氯霉素，先斜面接種伴生菌擬青霉或被毛孢菌種，進(jìn)行培養(yǎng)，再接入蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種(Cordyceps militaris)保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏日2011年12月12日，保藏號(hào)=CGMCC No. 5577，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，使蛹蟲草生長(zhǎng)旺盛并全部吞沒伴生菌，得到蛹蟲草種優(yōu)勝種；(2)將優(yōu)勝種管置于O _20°C的環(huán)境中培養(yǎng)不少于30天，然后將其置于18
25°C條件下恢復(fù)生長(zhǎng)3 5天；(3)將恢復(fù)后的優(yōu)勝種管去掉管塞，置于15 25°C的雜菌環(huán)境中培養(yǎng)5 7天；然后再蓋上管塞將其置于28 36°C的雜菌環(huán)境中培養(yǎng)5 7天；或先將恢復(fù)后的優(yōu)勝種管置于28 36°C的雜菌環(huán)境中培養(yǎng)5 7天；然后再去掉管塞置于15 25°C的雜菌環(huán)境中培養(yǎng)5 7天；(4)經(jīng)上述(I) (3)步驟培養(yǎng)后，試管菌種變色，雜菌生長(zhǎng)，其中有少量具有生命活力的蛹蟲草菌絲，將其分離于PDA培養(yǎng)基上，置于18 25°C條件下培養(yǎng)6 8天后，按制種常規(guī)提純復(fù)壯，得到蛹蟲草抗退化菌種。優(yōu)選的是，上述培養(yǎng)優(yōu)勝種的具體步驟為制備伴生菌管多只，PDA培養(yǎng)基+氯霉素，45ug/1000ml,管斜面中間接O. 8 2mm擬青霉或被毛孢種一塊為伴生菌，置于10 18°C條件下培養(yǎng)7 10天，待菌種定植并長(zhǎng)開時(shí)，在斜面兩端距伴生菌Icm之外，分別接入蛹蟲草菌種2 5_各一塊，將菌管置于18 20°C條件下培養(yǎng)3 5天后,待蛹蟲草菌種定植并散開生長(zhǎng)之時(shí)，將培養(yǎng)溫度提高到24 26°C，3 5天后蛹蟲草生長(zhǎng)旺盛，并全部吞沒了伴生菌，得到蛹蟲草種優(yōu)勝種。適應(yīng)性培養(yǎng)是本技術(shù)的主要特征，即制備有低溫伴生菌生長(zhǎng)的蛹蟲草母種管，置于低溫、高溫、缺氧及雜菌生長(zhǎng)的環(huán)境中培養(yǎng)菌種，經(jīng)培養(yǎng)后的母種再提純復(fù)壯，得到蛹蟲草抗退化菌種，然后再進(jìn)入原種和栽培種的應(yīng)用階段。實(shí)踐證實(shí)，抗退化菌種用于栽培中，連續(xù)十次繼代使用不會(huì)退化 ，生物轉(zhuǎn)化率在70%左右，得到的蛹蟲草子實(shí)體，表現(xiàn)為色澤深金黃，保持原始特性，正常培養(yǎng)工藝范圍內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定，經(jīng)檢測(cè)其有效成份，蟲草素含量不少于O. I %，腺苷含量不少于O. 055%,多糖含量不少于2. 5%，符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部公告2009年第3號(hào)》關(guān)于批準(zhǔn)蛹蟲草為新資源食品的公告規(guī)定的指標(biāo)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明需要蛹蟲草優(yōu)質(zhì)首代轉(zhuǎn)管母種，該母種經(jīng)組織分離、孢子分離得到或引進(jìn)的均可。該菌種也可在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心獲取，保藏號(hào)為CGMCCNo. 5577。伴生菌為擬青霉或被毛孢中的一種。擬青霉(Paecilomyces hepiali)和被毛孢(Hirsutella sinensis)可通過商業(yè)渠道獲得,如河南省泌陽(yáng)縣真菌研究所、山東省濟(jì)寧市光大食用菌研究所等均有銷售。本發(fā)明蛹蟲草抗退化菌種的培育方法，具體步驟如下I、培養(yǎng)優(yōu)勝種。制備有伴生菌生長(zhǎng)的蛹蟲草母種管多只，以便下述步驟的分組培養(yǎng)，一次完成多個(gè)實(shí)施例，提高培養(yǎng)效率。PDA培養(yǎng)基+氯霉素(45ug/1000ml )，管斜面中間接O. 8 2mm擬青霉或被毛孢種一塊為伴生菌，置于10 18°C條件下培養(yǎng)7 10天，待菌種定植并長(zhǎng)開時(shí)，在斜面兩端距伴生菌Icm之外,分別接入蛹蟲草菌種2 5mm各一塊,將菌管置于18 20°C條件下培養(yǎng)3 5天后，待蛹蟲草菌種定植并散開生長(zhǎng)之時(shí)，將培養(yǎng)溫度提高到24 26°C，3 5天后蛹蟲草生長(zhǎng)旺盛，并全部吞沒了伴生菌，得到蛹蟲草種優(yōu)勝種。上述各溫度條件和培養(yǎng)天數(shù)為優(yōu)選天數(shù)，實(shí)際操作中可根據(jù)伴生菌和蛹蟲草菌種的生長(zhǎng)情況適當(dāng)調(diào)整，達(dá)到菌種定植并長(zhǎng)開的狀態(tài)，進(jìn)而蛹蟲草菌吞沒伴生菌，得到蛹蟲草種優(yōu)勝種。以下的各溫度條件和培養(yǎng)天數(shù)也是同樣的道理。2、將優(yōu)勝種分為A、B兩組，同時(shí)置于O -20°C的環(huán)境中培養(yǎng)不少于30天，然后將其置于18 25°C條件下恢復(fù)生長(zhǎng)3 5天；3、將恢復(fù)后的菌管分成A、B兩組，A組去掉管塞，置于20°C左右的雜菌環(huán)境中；同時(shí)將B組用塑料布包住置于28 36°C的雜菌環(huán)境中；讓A、B組在各自的環(huán)境中培養(yǎng)5 7天。然后將A組蓋上管塞，B組去掉管塞，A、B組交換環(huán)境。按前法同樣培養(yǎng)5 7天。上述雜菌環(huán)境可以是富含各種雜菌的各種環(huán)境，如未經(jīng)處理的土壤環(huán)境、自然環(huán)境，人工增加某一種菌或幾種菌的小環(huán)境，如在一個(gè)箱體內(nèi)放置某種菌包等。4、上述I 3步驟培養(yǎng)后，試管菌種變色，雜菌生長(zhǎng)；原蛹蟲草種菌絲基本死亡，但仍有少量菌絲具有生命活力。將這些有活力的蛹蟲草菌絲細(xì)心分離于PDA培養(yǎng)基上，置于18 25°C條件下培養(yǎng)6 8天后，按制種常規(guī)提純復(fù)壯，得到蛹蟲草抗退化菌種。實(shí)施例I 20夏季,蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)伴生I. I制備伴生菌管60只，用PDA培養(yǎng)基+氯霉素45ug/1000ml，每只斜面菌管中間接蝙蝠蛾擬青霉菌種2mml ±夾，置于10 18°C的恒溫箱中培養(yǎng)7天后，菌種定植并長(zhǎng)開；在每只斜面管兩端距伴生菌Icm之外，分別接入4mm蛹蟲草菌種各一塊，所述蛹蟲草菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5577，置于18 20°C恒溫管中培養(yǎng)4天后，蛹蟲草菌種長(zhǎng)開；此時(shí)，將溫度提高到24 26°C，4天后蛹蟲草種生長(zhǎng)旺盛，并全部吞沒了伴生菌擬青霉,標(biāo)志著蛹蟲草種競(jìng)爭(zhēng)為優(yōu)勝種。I. 2將60只“優(yōu)勝種”管同時(shí)置于0°C冰箱中冷凍培養(yǎng)30天后，再將其置于18 25°C的恒溫箱中恢復(fù)生長(zhǎng)3天。
I. 3將恢復(fù)生長(zhǎng)后的菌種分為A、B兩組，再將各組分為10小組，每小組3只。A組去掉試管塞，10小組分別置于不同的室內(nèi)的不同紙箱中，箱內(nèi)放兩個(gè)生了霉菌的平菇廢菌包。室溫為18 24°C ;同時(shí)將B組的10小組分別用塑料布包住，置于田地里不同位置的20cm深的土坑內(nèi)，分別用土埋好，地溫為28 32°C ;A、B兩組各培養(yǎng)5天后，A組加蓋管塞，B組去掉管塞，交換環(huán)境，按前法同樣培養(yǎng)5天。I. 4經(jīng)過上述培養(yǎng)后的菌種均已變色，紅霉、綠霉、雜菌叢生。原蛹蟲草菌種多數(shù)死亡，但每只試管中均有一些有活力的蛹蟲草菌絲；將這些有活力的菌絲細(xì)心地分離到PDA培養(yǎng)基上，在18 25°C的恒溫箱中培養(yǎng)7天后，進(jìn)行提純復(fù)壯。共計(jì)得到55只優(yōu)質(zhì)蛹蟲草抗退化菌種管，可進(jìn)入原種和栽培種的制作和應(yīng)用階段。通過上述實(shí)施例I 20得到的菌種，用于栽培中，連續(xù)十次繼代使用，生物轉(zhuǎn)化率為68 71 %。得到的蛹蟲草子實(shí)體，表現(xiàn)色深金黃，高度4 6厘米，直徑3 4毫米，子囊果粗壯，保持原始特性。經(jīng)檢測(cè)其有效成份，蟲草素含量在O. I O. 15%之間，腺苷含量在O. 055 O. I %之間，多糖含量在2. 5 17. 6%之間，符合衛(wèi)生部2009年第三號(hào)公告的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例21 40冬季，中國(guó)被毛抱(Hirsutella sinensis)伴生2. I制備伴生菌管60只，用PDA培養(yǎng)基+氯霉素45ug/1000ml。每只斜面管中間接中國(guó)被毛孢菌種2mm—塊，置于10 18°C恒溫箱中培養(yǎng)10天后，中國(guó)被毛孢種定植并散開生長(zhǎng)；此時(shí)，在斜面菌管兩端距被毛孢種Icm之外，分別接一塊5mm大的蛹蟲草菌種各一塊，所述蛹蟲草菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5577，置于10 20°C的恒溫箱中培養(yǎng)4天后，蛹蟲草種長(zhǎng)開，此時(shí)，將培養(yǎng)溫度提高到24 26°C，5天后蛹蟲草種生長(zhǎng)旺盛，全部吞沒了被毛孢，標(biāo)志著蛹蟲草種為“優(yōu)勝種”。2. 2將60只“優(yōu)勝種”管平均分為A、B兩組，分別裝入兩個(gè)箱中，置于室外0°C以下的陽(yáng)面墻下，放置30天后，將A、B兩組再置于18 25°C恒溫箱中恢復(fù)生長(zhǎng)3天。2. 3將恢復(fù)生長(zhǎng)后的A組去掉試管塞，分成10小組，每小組3只，分別置于不同的紙箱內(nèi)，每個(gè)箱中放I 3個(gè)生了霉菌的平菇廢菌包，把紙箱置于蔬菜大棚中的不同位置的陰暗處，溫度18 21°C ;同時(shí)將B組分成10小組，每小組3只，分別用塑料布包住置于室內(nèi)的火炕上，保持在28 30°C ;A、B兩組各自培養(yǎng)7天后，A組加蓋管塞，B組去掉管塞，交換環(huán)境，按前法同樣培養(yǎng)7天。
2. 4經(jīng)過上述培養(yǎng)后的60只菌種管全部變了色，紅霉、綠霉、雜菌叢生，原蛹蟲草菌種多數(shù)死亡，但每管中均有一些有生命活力的蛹蟲草菌絲，將這些有活力的菌絲細(xì)心地分離到PDA培養(yǎng)基上，在18 25°C的恒溫箱中培養(yǎng)7天后，進(jìn)行提純復(fù)壯。共計(jì)得到50只優(yōu)質(zhì)蛹蟲草抗退化菌種管，可進(jìn)入原種和栽培種的制作和應(yīng)用階段。通過上述實(shí)施例21 40得到的菌種，用于栽培中，連續(xù)十次繼代使用，生物轉(zhuǎn)化 率為68 71%。得到的蛹蟲草子實(shí)體，表現(xiàn)色深金黃，高度4 6厘米，直徑3 4毫米，子囊果粗壯，保持原始特性。經(jīng)檢測(cè)其有效成份，蟲草素含量在O. I O. 15%之間，腺苷含量在O. 055 O. I %之間，多糖含量在2. 5 17. 6%之間，符合衛(wèi)生部2009年第三號(hào)公告的標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種培育蛹蟲草抗退化菌種的方法，其特征在于包括下列步驟 (1)培養(yǎng)優(yōu)勝種制備有伴生菌生長(zhǎng)的蛹蟲草母種管，PDA培養(yǎng)基+氯霉素，先斜面接種伴生菌擬青霉或被毛孢菌種，進(jìn)行培養(yǎng)，再接入蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種(Cordycepsmilitaris)保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日2011年12月12日，保藏號(hào)=CGMCC No. 5577，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，使蛹蟲草生長(zhǎng)旺盛并全部吞沒伴生菌，得到蛹蟲草種優(yōu)勝種管； (2)將優(yōu)勝種管置于O _20°C的環(huán)境中培養(yǎng)不少于30天，然后將其置于18 25°C條件下恢復(fù)生長(zhǎng)3 5天； (3)將恢復(fù)后的優(yōu)勝種管去掉管塞，置于15 25°C的雜菌環(huán)境中培養(yǎng)5 7天；然后蓋上管塞再將其置于28 36°C的雜菌環(huán)境中培養(yǎng)5 7天；或 先將恢復(fù)后的優(yōu)勝種管置于28 36°C的雜菌環(huán)境中培養(yǎng)5 7天；然后再去掉管塞將其置于15 25°C的雜菌環(huán)境中培養(yǎng)5 7天； (4)經(jīng)上述(I) (3)步驟培養(yǎng)后，試管菌種變色，雜菌生長(zhǎng)，其中有少量具有生命活力的蛹蟲草菌絲，將其分離于PDA培養(yǎng)基上，置于18 25°C條件下培養(yǎng)6 8天后，按制種常規(guī)提純復(fù)壯，得到蛹蟲草抗退化菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于培養(yǎng)優(yōu)勝種的具體步驟為制備伴生菌管多只，PDA培養(yǎng)基+氯霉素，45ug/1000ml，管斜面中間接O. 8 2mm擬青霉或被毛孢種一塊為伴生菌，置于10 18°C條件下培養(yǎng)7 10天，待菌種定植并長(zhǎng)開時(shí)，在斜面兩端距伴生菌Icm之外,分別接入蛹蟲草菌種2 5mm各一塊,將菌管置于18 20°C條件下培養(yǎng)3 5天后,待蛹蟲草菌種定植并散開生長(zhǎng)之時(shí),將培養(yǎng)溫度提高到24 26°C，3 5天后蛹蟲草生長(zhǎng)旺盛，并全部吞沒了伴生菌，得到蛹蟲草種優(yōu)勝種。
全文摘要
本發(fā)明提供一種培育蛹蟲草抗退化菌種的方法，所述方法包括制備有低溫伴生菌生長(zhǎng)的蛹蟲草母種管，置于低溫、高溫、缺氧及雜菌生長(zhǎng)的環(huán)境中培養(yǎng)菌種，經(jīng)培養(yǎng)后的母種再提純復(fù)壯，得到蛹蟲草抗退化菌種，然后再進(jìn)入原種和栽培種的應(yīng)用階段?？雇嘶N用于栽培中，連續(xù)十次繼代使用，生物轉(zhuǎn)化率70％左右，得到的蛹蟲草子實(shí)體，表現(xiàn)為色澤深金黃，保持原始特性，正常培養(yǎng)工藝范圍內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定，經(jīng)檢測(cè)其有效成份，蟲草素含量不少于0.1％，腺苷含量不少于0.055％，多糖含量不少于2.5％，符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部公告2009年第3號(hào)》關(guān)于批準(zhǔn)蛹蟲草為新資源食品的公告規(guī)定的指標(biāo)。
文檔編號(hào)A01G1/04GK102726216SQ201210248399
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者劉巧云, 周文貴, 周翔, 李璐, 楊毅, 楊洪利, 胡素花 申請(qǐng)人:楊毅