專利名稱：一種杜鵑花無性系品種的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到林木育種技術(shù)領(lǐng)域，具體指利用現(xiàn)代生物技術(shù)(物理誘變)手段獲得杜鵑花優(yōu)良無性系品種即一種杜鵑花無性系品種的育種方法。
背景技術(shù)：
西洋杜醇(Rhododendron simsii Planch),簡稱西醇，又名比利時杜醇。西洋杜匿$ 是我國優(yōu)良的觀花植物，其品種多樣，花色豐富，形態(tài)各異。鑒于杜鵑自身的生物學(xué)特性，它具有極高的觀賞和園林應(yīng)用價值。目前，國內(nèi)外對杜鵑花良種的選育方法主要是對野生資源進行引種馴化，并與栽培品種進行雜交來選育新品種，但是這種方法較為復(fù)雜、獲得優(yōu)良品種的成功概率較低。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，使用組織培養(yǎng)技術(shù)、誘變技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等新型育種技術(shù)培育新品種已經(jīng)成為可能，但成功報道的例子甚少。自然界西洋杜鵑容易產(chǎn)生芽變，目前栽培中部分優(yōu)良品種由自然芽變選擇培育成功，但自然芽變概率較低，利用人工誘變可以大大提高西洋杜鵑的變異概率，是選育西洋杜鵑優(yōu)良品種的良好途徑，但是利用人工誘變育種西洋杜鵑的方法還鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的狀況，提供一種西洋杜鵑無性系品種選育的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種西洋杜鵑無性系品種選育的方法，主要采用人工物理誘變的方式，獲得觀賞價值高、開花期早的優(yōu)良單株，該方法包括育種目標(biāo)的確定、育種材料的選取、物理誘變劑量的選擇、苗木的管理、變異單株的篩選、變異性狀的分子鑒別等，具體包括下述步驟(I)育種目標(biāo)的確定以抗病、較高的觀賞價值(如不同的花型、花色，較長的開花期等)為主要育種目標(biāo)；(2)育種材料的選取選擇具有較高觀賞價值的品種(系)、生長健壯且已進入開花盛期的植株為母株(一般秋季或春季母株的果實果皮變?yōu)楹稚螯S褐色時便可采集；浙江省一般在早春蒴果開裂前采集)，從母株上采集種子后，選擇飽滿的、發(fā)育良好的種子，分為輻射處理組和對照組；具體為900 1000粒種子為一組，共分為6組，其中I組為對照 (不采用輻射處理)，5組用于輻照處理；(3)物理誘變劑量的選擇通過預(yù)備試驗，采用50、100、150、200、250Gy分別對五
組(一組對應(yīng)一個劑量)用于輻照處理的種子進行6tlCo Y射線的急性輻射，以無輻射處理組為對照，劑量率為IOGy/min ；(4)種子的播種種子播種于25 30cm、高度20 25cm的塑料容器中，基質(zhì)為泥炭和谷殼的混合物(體積比為6 4)，基質(zhì)裝盆(塑料容器)前用高壓滅菌鍋進行消毒，盆土量為800 1500g,基質(zhì)含有有機質(zhì)35 45g · kg4,堿解氮100 120mg · kg4,速效磷 80 95mg · kg \速效鐘200 250mg · kg \ pH6. O 6· 5 ;基質(zhì)上面平鋪O. 8 I. 2厘米
4厚剪碎的苔蘚，然后澆透水；將輻射處理和對照的種子均勻播種于苔蘚上，每盆180 200 粒；容器苗置于連棟大棚內(nèi)，大棚內(nèi)的溫度保持在20 25°C，種子萌芽期間大棚內(nèi)的空氣相對濕度保持90 95%，以促萌芽，種子萌發(fā)后降至65 75%，以減少病害；播種后土壤保持濕潤，土壤相對濕度保持65 75% ;(5)苗木的管理播種后14 15天發(fā)芽，當(dāng)小苗長至2 3葉時移植于小容器中， 選用無紡布網(wǎng)袋容器單株定植，容器直徑為4 5cm,高度8 IOcm,基質(zhì)同步驟⑷中基質(zhì)；容器苗同樣置于連棟大棚內(nèi)，大棚內(nèi)的溫度保持在20 25°C，溫度過高用遮陽網(wǎng)遮蔭， 土壤相對濕度保持在65 75% ;根據(jù)苗木的生長狀況第2年以后進行換盆，培育3 6年后植株開花；(6)變異單株的篩選在苗木生長期間，仔細觀測不同處理的生物學(xué)、植物學(xué)性狀，選擇與對照(對照組)在抗性、植物生長勢、花(花色、花型、花期等)方面有明顯差異的單株；(7)變異性狀的分子鑒別選擇優(yōu)良單株，采集該優(yōu)良單株與對照組單株的幼嫩葉片，采用改良的CTAB法提取西洋杜鵑植物基因組DNA，利用SRAP標(biāo)記技術(shù)進行變異基因分析；(8)優(yōu)良單株的區(qū)域試驗和推廣通過生物學(xué)、植物學(xué)性狀以及觀賞特性的觀測， 結(jié)合分子鑒別，獲得優(yōu)良單株；將該單株進行無性繁殖(如扦插、嫁接)，選擇不同的區(qū)域進行試驗，以明確其適種范圍，并總結(jié)適合該單株的一整套栽培措施。步驟⑵中選取育種材料的品種如“皋月”、“白佳人”、“雪美人”、“紫云”等。步驟(4)中優(yōu)選為所述的盆土量為lOOOg，基質(zhì)含有有機質(zhì)SSg^kg—1，堿解氮 IlOmg · kg_\ 速效磷 87mg · kg_\ 速效鉀 237mg · kg-1, pH6. 3。步驟(7)中所述SRAP標(biāo)記技術(shù)進行變異基因分析其西洋杜鵑花SRAP-PCR反應(yīng)體系為20μ L PCR 反應(yīng)體積中，MgCl2 I. 75mmol/L, dNTPsO. 175mmol/L, Taq 聚合酶 I. 5U，引物O. 2ymol/L，10XBuffer 2. O μ L，DNA基因組為I. 5Μ ;PCR擴增反應(yīng)程序為反應(yīng)前5個循環(huán)94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin, 37。。復(fù)性lmin, 72。。延伸lmin, 5個循環(huán)反應(yīng)；94°C 變性lmin，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin, 35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0上述引物利用TGAGTCCAAACCGGATA、TGAGTCCAAACCGGAGC、TGAGTCCAAACCGGAAT、 TGAGTCCAAACCGGACC、TGAGTCCAAACCGGAAG、TGAGTCCAAACCGGTAA、TGAGTCCAAACCGGTCC、 TGAGTCCAAACCGGTGC、GACTGCGTACGAATTAAT、GACTGCGTACGAATTTGC、GACTGCGTACGAATTGAC、 GACTGCGTACGAATTTGA、GACTGCGTACGAATTAAC、GACTGCGTACGAATTGCA、GACTGCGTACGAATTCAA、 GACTGCGTACGAATTCTG、GACTGCGTACGAATTCGA、GACTGCGTACGAATTCAG、GACTGCGTACGAATTCCA 等 19條引物(共同使用)擴增出清晰的譜帶且重復(fù)性較好。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果I.本發(fā)明成功采用6tlCoY射線人工誘變，獲得變異概率高、操作安全穩(wěn)定的西洋杜鵑育種。2.本發(fā)明的西洋杜鵑育種方法，通過確定照射劑量、劑量率、照射后種子的播種環(huán)境條件控制、苗木的管理、篩選、變異性狀的分子鑒別、優(yōu)良單株的區(qū)域試驗和推廣等，得到一套完整的觀賞價值高、開花期(提早5-15天)、性狀優(yōu)良(花色為白色、紅白相間、紅色等，重瓣，抗逆性高)的單株西洋杜鵑人工誘變育種方法，成功實現(xiàn)了西洋杜鵑人工誘變育種。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述(以“皋月”杜鵑品種誘變選育新品種為例)，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例。實施例實施例以“皋月”品種為例，“皋月”杜鵑原產(chǎn)日本，我國廣為栽培，采用的“皋月” 杜鵑母本花冠鮮紅色，闊漏斗形，花絲淡紅色，利用人工誘變可以成功選育出在花色、花期等方面產(chǎn)生優(yōu)良變異的單株。(I)育種目標(biāo)的確定以較高的觀賞價值(如不同的花型、花色、較早開花等)為主要育種目標(biāo)；(2)育種材料的選取選擇具有較高觀賞價值的品種(系)、生長健壯且已進入開花盛期的植株為母株，一般秋季或春季母株的果實果皮變?yōu)楹稚螯S褐色時便可采集；浙江省一般在早春蒴果開裂前采集，種子采集后選擇飽滿的發(fā)育良好的種子，約1000粒為一組，分為6組，其中I組為對照，5組用于輻照處理；(3)物理誘變劑量的選擇通過預(yù)備試驗，采用50、100、150、200、250Gy的6ciCo Y 射線進行急性輻照，以無輻射處理為對照，劑量率為10Gy/min ；(4)種子的播種種子播種于直徑25cm、高度25cm的塑料容器中，基質(zhì)為泥炭和谷殼的混合物(體積比為6 4)，基質(zhì)裝盆前用高壓滅菌鍋進行消毒，盆土量IOOOg左右， 有機質(zhì) 38g · kg-1,堿解氮 IlOmg · kg-1,速效磷 87mg · kg-1,速效鉀 237mg · kg-1, pH6. 3,上面平鋪厚度為I厘米左右的的剪碎的苔蘚，基質(zhì)澆透水。將誘變處理組和對照組的種子均勻播種于苔蘚上，每盆200粒左右；容器苗置于連棟大棚內(nèi)，大棚內(nèi)的溫度一般保持20°C左右，種子萌芽期間大棚內(nèi)的空氣相對濕度保持90%左右，以促萌芽；種子萌發(fā)后降至70% 左右，以減少病害，播種后土壤保持濕潤，土壤相對濕度保持70%左右；(5)苗木的管理播種后15天左右發(fā)芽，當(dāng)小苗長至2 3葉時移植于小容器中， 選用無紡布網(wǎng)袋容器單株定植，其直徑為4. 5cm，高度10cm，基質(zhì)同步驟(4);容器苗同樣置于連棟大棚內(nèi)，一大棚內(nèi)的溫度一般保持20-25 V，溫度過高用遮陽網(wǎng)遮蔭，土壤相對濕度保持70%左右。根據(jù)苗木的生長狀況第2年以后進行換盆，一般培育4年后植株開花；(6)變異單株的篩選在苗木生長期間，仔細觀測不同處理的生物學(xué)、植物學(xué)性狀，選擇與對照在抗性、植物生長勢、花(花色、花型、花期等)等方面有明顯差異的單株；(7)變異性狀的分子鑒別選擇優(yōu)良單株，采集該優(yōu)良單株與對照組單株的幼嫩葉片，利用SRAP標(biāo)記技術(shù)進行變異基因分析；西洋杜鵑花最優(yōu)SRAP-PCR反應(yīng)體系為 20 μ LPCR 反應(yīng)體積中，MgCl2 I. 75mmol/L, dNTPsO. 175mmol/L, Taq 聚合酶 I. 5U,引物 O. 2 μ mol/L, IOXBuffer 2. O μ L ；PCR擴增反應(yīng)程序為反應(yīng)前5個循環(huán)94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，37°C復(fù)性 lmin，72°C延伸lmin，5個循環(huán)反應(yīng)；94°C變性lmin，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0引物采用TGAGTCCAAACCGGATA、TGAGTCCAAACCGGAGC、TGAGTCCAAACCGGAAT、 TGAGTCCAAACCGGACC、TGAGTCCAAACCGGAAG、TGAGTCCAAACCGGTAA、TGAGTCCAAACCGGTCC、TGAGTCCAAACCGGTGC、GACTGCGTACGAATTAAT、GACTGCGTACGAATTTGC、GACTGCGTACGAATTGAC、 GACTGCGTACGAATTTGA、GACTGCGTACGAATTAAC、GACTGCGTACGAATTGCA、GACTGCGTACGAATTCAA、 GACTGCGTACGAATTCTG、GACTGCGTACGAATTCGA、GACTGCGTACGAATTCAG、GACTGCGTACGAATTCCA 等 19條引物擴增出清晰的譜帶且重復(fù)性較好。(8)優(yōu)良單株的區(qū)域試驗和推廣通過生物學(xué)、植物學(xué)性狀以及觀賞特性的觀測， 結(jié)合分子鑒別，獲得一開花期(提早15天左右)、花瓣呈白但花瓣先端呈鮮紅色的雙色優(yōu)良單株；將該單株進行無性繁殖(如扦插、嫁接)，選擇不同的區(qū)域進行試驗，以明確其適種范圍，并總結(jié)適合該單株的一整套栽培措施。
權(quán)利要求
1.一種杜鵑花無性系品種的育種方法，其特征在于通過人工物理誘變的方式，獲得觀賞價值高、開花期早的杜鵑花優(yōu)良單株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種杜鵑花無性系品種的育種方法，其特征在于該育種方法具體步驟包括(1)育種目標(biāo)的確定以抗病、較高的觀賞價值為主要育種目標(biāo)；(2)育種材料的選取選擇具有較高觀賞價值的品種、生長健壯且已進入開花盛期的植株為母株；從母株上采集種子后，選擇飽滿的、發(fā)育良好的種子，分為輻射處理組和對照組，具體為900 1000粒種子為一組，共分為6組，其中I組為對照，5組用于輻照處理；(3)物理誘變劑量的選擇通過預(yù)備試驗，采用50、100、150、200、250Gy分別對五組用于輻照處理的種子進行6tlCo Y射線的急性輻射，以無輻射處理組為對照，劑量率為IOGy/ min ；(4)種子的播種種子播種于25 30cm、高度20 25cm的塑料容器中，基質(zhì)為體積比為6 4的泥炭和谷殼的混合物，基質(zhì)裝盆即塑料容器前用高壓滅菌鍋進行消毒，盆土量為800 1500g,基質(zhì)含有有機質(zhì)35 45g · kg4,堿解氮100 120mg · kg4,速效磷80 95mg · kg S速效鐘200 250mg · kg S pH6. O 6· 5 ;基質(zhì)上面平鋪O. 8 I. 2厘米厚剪碎的苔蘚，然后澆透水；將輻射處理和對照的種子均勻播種于苔蘚上，每盆180 200粒；容器苗置于連棟大棚內(nèi)，大棚內(nèi)的溫度保持在20 25°C，種子萌芽期間大棚內(nèi)的空氣相對濕度保持90 95%，以促萌芽，種子萌發(fā)后降至65 75%，以減少病害；播種后土壤保持濕潤，土壤相對濕度保持65 75% ;(5)苗木的管理播種后14 15天發(fā)芽，當(dāng)小苗長至2 3葉時移植于小容器中，選用無紡布網(wǎng)袋容器單株定植，容器直徑為4 5cm,高度8 IOcm,基質(zhì)同步驟⑷中基質(zhì)； 容器苗同樣置于連棟大棚內(nèi)，大棚內(nèi)的溫度保持在20 25°C，土壤相對濕度保持在65 75% ;根據(jù)苗木的生長狀況第2年以后進行換盆，培育3 6年后植株開花；(6)變異單株的篩選在苗木生長期間，仔細觀測不同處理的生物學(xué)、植物學(xué)性狀，選擇與對照在抗性、植物生長勢、花方面有明顯差異的單株；(7)變異性狀的分子鑒別選擇優(yōu)良單株，采集該優(yōu)良單株與對照組單株的幼嫩葉片， 采用改良的CTAB法提取西洋杜鵑植物基因組DNA，利用SRAP標(biāo)記技術(shù)進行變異基因分析；(8)優(yōu)良單株的區(qū)域試驗和推廣通過生物學(xué)、植物學(xué)性狀以及觀賞特性的觀測，結(jié)合分子鑒別，獲得優(yōu)良單株；將該單株進行無性繁殖，選擇不同的區(qū)域進行試驗，以明確其適種范圍，并總結(jié)適合該單株的一整套栽培措施。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種杜鵑花無性系品種的育種方法，其特征在于步驟(2) 中選取育種材料的品種為“皋月”、“白佳人”、“雪美人”、“紫云”中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種杜鵑花無性系品種的育種方法，其特征在于步驟(2) 中母株上種子的采集以秋季或春季母株的果實果皮變?yōu)楹稚螯S褐色時采集。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種杜鵑花無性系品種的育種方法，其特征在于步驟(4) 所述的盆土量為IOOOg,基質(zhì)含有有機質(zhì)38g kg—1,堿解氮IlOmg kg—1,速效磷87mg · kg-1, 速效鉀 237mg · kg-1, pH 6· 3。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種杜鵑花無性系品種的育種方法，其特征在于步驟(7) 中所述SRAP標(biāo)記技術(shù)進行變異基因分析其西洋杜鵑花SRAP-PCR反應(yīng)體系為20 μ L PCR反應(yīng)體積中，MgCl2 I. 75mmol/L, dNTPsO. 175mmol/L, Taq 聚合酶 I. 5U,引物 O. 2ymol/L, IOXBuffer 2. O μ L，DNA 基因組為 I. 5Μ。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種杜鵑花無性系品種的育種方法，其特征在于所述的PCR 擴增反應(yīng)程序為反應(yīng)前5個循環(huán)94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，37°C復(fù)性lmin，72°C 延伸lmin, 5個循環(huán)反應(yīng)；94°C變性lmin,50°C復(fù)性lmin,72°C延伸Imin, 35個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種杜鵑花無性系品種的育種方法，其特征在于所述的引物為 TGAGTCCAAACCGGATA、TGAGTCCAAACCGGAGC、TGAGTCCAAACCGGAAT、TGAGTCCAAACCGGACC、 TGAGTCCAAACCGGAAG、TGAGTCCAAACCGGTAA、TGAGTCCAAACCGGTCC、TGAGTCCAAACCGGTGC、 GACTGCGTACGAATTAAT、GACTGCGTACGAATTTGC、GACTGCGTACGAATTGAC、GACTGCGTACGAATTTGA、 GACTGCGTACGAATTAAC、GACTGCGTACGAATTGCA、GACTGCGTACGAATTCAA、GACTGCGTACGAATTCTG、 GACTGCGTACGAATTCGA、GACTGCGTACGAATTCAG、GACTGCGTACGAATTCCA 共 19 條引物。
全文摘要
本發(fā)明公開一種杜鵑花無性系品種的育種方法，其特征在于通過人工物理誘變的方式，獲得觀賞價值高、開花期早的杜鵑花優(yōu)良單株；具體為育種目標(biāo)確定→采集飽滿成熟的種子→物理誘變劑量50-250Gy的60Coγ射線、劑量率為10Gy/min→種子播種→3～6年苗木培育→單株選擇生物學(xué)、植物學(xué)性狀、觀賞特性的觀測等方面選擇→變異性狀的基因分析→優(yōu)良單株區(qū)域試驗→栽培措施總結(jié)→推廣。本發(fā)明方法獲得的優(yōu)良單株一般開花期可以提早5～15天，花色為白色、紅白相間、紅色等，重瓣，抗逆性高。
文檔編號A01H1/06GK102577937SQ201210004689
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者吳月燕, 李波, 王忠華 申請人:浙江萬里學(xué)院