專利名稱：一種PsPR10P1681啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別涉及一種PsPR10P1681啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是DNA上結(jié)合RNA聚合酶并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域。外源基因在轉(zhuǎn)基因作物體內(nèi)的表達(dá)依靠啟動(dòng)子對(duì)其的調(diào)控作用，表達(dá)量不足往往得不到理想轉(zhuǎn)基因植物。 因此，選擇合適的植物啟動(dòng)子是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首要問(wèn)題。根據(jù)啟動(dòng)子所控制的基因表達(dá)范圍和方式不同，啟動(dòng)子可以分成組成型啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子。在組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。外源基因在植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)不但造成浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時(shí)又可減少對(duì)植物的不利影響，近年來(lái)人們對(duì)特異性啟動(dòng)子的研究越來(lái)越重視。隨著植物根特異性表達(dá)啟動(dòng)子研究的不斷改進(jìn)，現(xiàn)已分離了一些植物根特異性表達(dá)基因和增強(qiáng)序列，這些序列能在根部特異性或優(yōu)先激活從而啟動(dòng)基因的表達(dá)，啟動(dòng)子中存在負(fù)責(zé)根特異性表達(dá)的順式作用元件，受外來(lái)因素誘導(dǎo)或特定蛋白調(diào)控，包括組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子。例如來(lái)自煙草的富含羥脯氨酸的糖蛋白(HRGP)基因，盡管其表達(dá)水平很低但是根特異性的，在煙草側(cè)根分化誘導(dǎo)過(guò)程中，在中柱鞘和內(nèi)皮層中其啟動(dòng)子表現(xiàn)短時(shí)間活躍，特別是后期根發(fā)生組織細(xì)胞中活性強(qiáng)，屬于組織特異性啟動(dòng)子。誘導(dǎo)表達(dá)是指植物細(xì)胞由于環(huán)境的變化而導(dǎo)致相關(guān)基因的表達(dá)。植物體內(nèi)存在著一套防御機(jī)制來(lái)對(duì)付不良環(huán)境，在這個(gè)過(guò)程中，環(huán)境誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子起著關(guān)鍵的作用。根對(duì)于植物從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，維持正常生長(zhǎng)具有重要作用。在環(huán)境脅迫下，最先受到影響的器官是根部組織，如果將根部誘導(dǎo)型特異性啟動(dòng)子應(yīng)用于植物抗脅迫基因工程中，使抗性基因在根部細(xì)胞中特異表達(dá)，這樣就能降低能量消耗，使轉(zhuǎn)基因植物在獲得抗性的同時(shí)，又不影響正常的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)抗逆、抗病蟲(chóng)的基因工程具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能夠調(diào)控目的基因高效特異表達(dá)于植物的根部組織的 PsPR10P1681啟動(dòng)子，并應(yīng)用于植物抗逆基因工程。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種PsPR10P1681啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子含有下列任意一組核苷酸序列a、SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列互補(bǔ)的序列；本發(fā)明不排除對(duì)上述a或b所述序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失或修飾的核苷酸序列；或與上述 a或b所述序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。進(jìn)一步，所述的PsPR10P1681啟動(dòng)子優(yōu)選為含有SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列
的啟動(dòng)子。一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含所述的PsPR10P1681啟動(dòng)子以及與之進(jìn)行
3可操作連接的基因序列。一種載體，所述載體含有所述的啟動(dòng)子或所述的DNA構(gòu)建體。一種重組細(xì)胞，所述的重組細(xì)胞包含所述的啟動(dòng)子或所述的DNA構(gòu)建體或所述的載體。進(jìn)一步，所述的重組細(xì)胞優(yōu)選為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。一種含有所述的啟動(dòng)子或所述的DNA構(gòu)建體或所述的載體或所述重組細(xì)胞的植物愈傷組織或植物。進(jìn)一步，所述的植物愈傷組織或植物優(yōu)選為煙草。所述的PsPR10P1681啟動(dòng)子在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述的PsPR10P1681啟動(dòng)子在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用為 PsPR10P1681啟動(dòng)子在抗逆轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用將抗逆基因置于PsPR10P1681啟動(dòng)子下游，構(gòu)建植物表達(dá)載體，將載體導(dǎo)入煙草，得到抗逆轉(zhuǎn)基因煙草。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子核苷酸序列來(lái)自美洲東部白松(Pinus strobus) 0本發(fā)明利用同源克隆和RACE技術(shù)獲得美洲東部白松I3sI3RlO基因上游1681bp序列啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，具體方法如下本發(fā)明從美洲東部白松根中提取DNA，根據(jù)國(guó)際基因庫(kù)(GenBank)中已經(jīng)發(fā)布的其它植物I3RlO基因上游DNA序列，設(shè)計(jì)引物，序列如下Fl :AAAAGCTTCTCGAGATGACTCTTRl :CATTTTCAACTCTCT CGCAACTA利用上述引物進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。將PCR產(chǎn)物與克隆載體(pEASY-T) 連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，然后篩選陽(yáng)性重組子，進(jìn)行序列測(cè)序，根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下F1681 :AAAAGCTTAAAAGCTTCTCGAGATGACTCR2 :AAGGATCCCATTTTCAACTCTCTCGCAAC以美洲東部白松根DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與克隆載體(pEASY_T)連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，然后篩選陽(yáng)性重組子，進(jìn)行序列測(cè)序，得到一個(gè)1681bp 啟動(dòng)子序列，將該序列命名為PsPRIOP 1681。該啟動(dòng)子序列SEQ. ID. NO. 1信.息如下
長(zhǎng)度:1681bp
類型核酸
鏈型雙鏈
來(lái)源美洲東部白松
-1681AMAGCTTCTCGAGATGACTCTTTTCCTGTGACACCTGTTGGACCAGTAGTTGTTAAACA
-1621TTGAGATCATACTTCCGCATTTAGTTCCGAAGATTCTCAACCACCTTCAACACMAAATG
-1561GCATAGCATGAGTGATATCCTTGATGATCCTGCCTCTATCCCTCTATTTGAGGMGATCT
-1501ACAAGCACTTTTAGCTATGGAGCCATCCATGCCCATGCATGCCTATATGATGCATGGATC
-1441TGATCCACAAACTTATGCAGMGCAAGTGGGCATCTTGAA TGGAMGCTGCAATGGATGA
-1381GGAATATAACTCTCTCATTGAGAAATTTGCAAGTGTTGGTAAACTTCTAAACCGGTAACT
-1321AGGATCCCCGMGATTCTCGACCACCTTCAACACMAAATGGCGTAGCATGAGTGATATC
-1261CTTGATGACCCTGCCTCTATCCCTCTATTT GAGGMGATCTACAAGAACTTTTAGCTATG
-1201GAGCCATCCATGCCCATGCATGCCTATATGATGCATGGCTCTGATCCACAAACTTATGCA
-1141GMGCAAGTGGGCATCTTGAATGGAMGCTGCAATGGATGAGGAATATAACTCTCTCATT
-1081GAGAAATTTGCAAGTGTTGGTAAACTTCTAAACCAGTAACTAGGATCCCTAGGGTGGAM
-1021TTATGGATTCCATAAAGGTGCGGTGATTACTCCAACACCCTCCCCCCCATCAAMCGCAC
-961TCGGAGMTCMTACACCCCTCAAATGCACTTGGAGGGAATCGAACCTGGGTCTATGCTC
-901TMTACCATGTAGAGGTTTGTCGTTACACCAAAACTTGCAAGTGTTGATAAACTTCTAM
-841CGGTAAGATCCCCATGATGAMATTATGAATTGCATAGAAGTATGGTGATTACTCCAACA
-781AMTCTMTCCATCAATAAAMTGTACACAAACTMTTTTCATTTAATCTTTTTCTGCCC
-721ATTTAATAAAMGATCMAATTCTGGCAGCCGAATATTTGGTCTTTTGAACTTMCGAAT
-661ATATATATATCCACTGMAAGTCATTTTGAAATATATGCATTCCACGGTAGCGATGGCAC
-601GGCGTTGGTGMTGTAGAAGCCTTTGTAAGCAATTTACGGCGTCTTTGACATTTGTGTAT
-541CTCTTCTAGATGGGTTMCAACACGGACTGACAAMCCGCGGTGGTTAGGGAAGTTAGM
-481ACGATATTCATTGAAGGATCAGCCTGTAAATAAATAAATAAAAACAAATTATCCATTTCA
-421TGTCTTATCTTGTTATCTGGTCGTATCTACTCTTTGTCATTAATCGTCTCTGAMGTGGG
-361AACCGGMCCGGAATCGTCTCTTGTCATTAGATGAGMGAGAAATMCAAATCACCATGG
-300GATCTAGAAACATCCATCCATTCCGTTTATTCAAAGTCAGCACACACAGTGGGGTCCGGG
-241GGATCGTTGTCCTTTAGGACTTATCGAAACCAGGCATGGAGCTCGGTATTGTCGGCCACA
-181AAGGCCMGGGTTCAATAAGMAACCCAAGTAGTTGGCATTATGTGCGTCCATCGGTCAG
-121TCCAAATAACMATAGTCACTTTCGAGTCTCATGTCATTACCTACGCGCTCTCTTTAATG
-61TACAGATTTTMAGGTTTGTMACGACTACTATAAATACGGGCTCGTCTAGTGCAGTTGA
-1GMCAAGGAGCTTTGTGCGATAATATTGAAGAAATATAAGTATTGTGTAGTTGCGAGAGA60 GTTGAAAATG啟動(dòng)子序列SEQ. ID. NO. 1中負(fù)號(hào)表示啟動(dòng)子序列，正號(hào)表示啟動(dòng)子下游序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一種新的 PsPR10P1681啟動(dòng)子，具有較高的根特異誘導(dǎo)表達(dá)活性，能夠提高下游基因根特異轉(zhuǎn)錄水平，從而能夠應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物抗逆工程。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此基于本生煙草生長(zhǎng)速度快、生活周期短、離體培養(yǎng)再生能力強(qiáng)和遺傳轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)，在下述實(shí)施例中以煙草為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明。氨芐LB固體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、YEP培養(yǎng)基、MS預(yù)分化培養(yǎng)基、MS 生根培養(yǎng)基、MS基本培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基及其組成均為公知常識(shí)。實(shí)施例1 調(diào)控目的基因高效特異表達(dá)于植物的根部組織的美洲東部白松 PsPR10P1681啟動(dòng)子的克隆1. DNA提取利用植物DNA提取試劑盒(TransGen，Beijing提取美洲東部白松基因組DNA，作為模板。
2. PRlO基因上游DNA序列擴(kuò)增利用引物Fl=AAA AGCTTCTCGAGATGACTCTT和Rl :CATTTTCAACTCTCT CGCAACTA進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，體系如下10XBuffer5y L，10mmoL/L dNTP 2 μ L, PCR 引物各 25pmol，DNA 模板
1μ L (約200ng)，Taq酶2U，加滅菌雙蒸水至50 μ L0PCR反應(yīng)步驟為94°C預(yù)變性5min ；93°C 變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸90sec，循環(huán)30次；最后72°C延伸lOmin。瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒(TransGen，Beijing)回收片段，將所得片段連入pEASY_T載體(TransGen，Beijing)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞CTransGen，Bei jing)，然后利用氨芐LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性重組子，并進(jìn)行PCR鑒定，然后進(jìn)行序列測(cè)序，獲得一個(gè)1750bp 序列。3. PsPR10P1681 啟動(dòng)子獲得利用引物F1681 =AAA AGC TTA AAA GCT TCT CGA GAT GAC TC 禾口 R2 :AAG GAT CCC ATT TTC AAC TCT CTC GCAAC 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，體系如下10 X Buffer 5 μ L, 10mmoL/L dNTP
2μ L，PCR引物各25pmol, DNA模板1 μ L (以1750bp序列為模板)，Taq酶2U，加滅菌雙蒸水至50 μ L。PCR反應(yīng)步驟為94°C預(yù)變性5min ；93°C變性30sec，5(TC退火30sec，72°C延伸60sec，循環(huán)30次；最后72°C延伸lOmin。1 %瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒回收片段，將所得片段連入PUC-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，然后利用氨芐LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性重組子，并進(jìn)行PCR鑒定，然后進(jìn)行序列測(cè)序，獲得一個(gè)1681bp序列，命名為PsPR10P1681啟動(dòng)子。實(shí)施例2 表達(dá)載體及重組載體的構(gòu)建1.根據(jù)實(shí)施例1分離的PsPR10P1681啟動(dòng)子核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物正向引物5，-AAAAGCTTAAAAGCTTCTCGAGATGACTC-3，劃?rùn)M線部分為HindIII酶切位點(diǎn)反向引物5，-AAGGATCCCATTTTCAACTCTCTCGCAAC-3，劃?rùn)M線部分為BamH I酶切位點(diǎn)以該啟動(dòng)子全長(zhǎng)測(cè)序質(zhì)粒為模板，利用上述正向和反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。2.取PCR產(chǎn)物2 μ L與克隆載體(pEASY-T) (TransGen, Bei jing)連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞(TRANS，北京)，然后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，篩選陽(yáng)性重組子，進(jìn)行PCR鑒定。3.利用質(zhì)粒提取試劑盒(TRANS，北京)提取上述步驟2得到的陽(yáng)性大腸桿菌質(zhì)粒，將質(zhì)粒用HindIII和BamH I酶切，與用相同限制酶酶切的pBI121表達(dá)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，然后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)生長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒酶切鑒定，獲得表達(dá)載體pBI 121。4.取5μ 1表達(dá)載體pBI121，加入200μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Agrobacterium tumefaciens)，混勻；冰浴5min，再利用液氮冷凍lmin，迅速置于37°C水浴溫育5min，然后冰浴aiiin ；加入800 μ 1 YEB液體培養(yǎng)基，在，250r/min培養(yǎng)4 證；用移液器將菌液轉(zhuǎn)移至YEB固體培養(yǎng)基(含100yg/ml利福平，50yg/ml卡那霉素)表面，均勻涂布于整個(gè)平板倒置培養(yǎng)1 2d，可看到單克隆，挑取單菌落用微量堿法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切檢測(cè)，獲得重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。實(shí)施例3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得
(1)本生煙草(Nicotiana tabacum)種子，播種于MS培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)至5_6片真葉期，備用。(2)挑取實(shí)施例2獲得的農(nóng)桿菌(攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落)接種于含50mg/ L卡那霉素的YEP培養(yǎng)基中，280C，250rpm,振蕩培養(yǎng)4 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，將菌液用MS液體培養(yǎng)基稀釋10倍待用。(3)取步驟(1)煙草葉片剪切成5mm X 5mm小塊，置于MS預(yù)分化培養(yǎng)基中，28°C， 光照為16h/d，2000Lux,預(yù)培養(yǎng)2d，獲得煙草葉片外植體。(4)將步驟(3)預(yù)培養(yǎng)后的煙草葉片外植體浸入步驟(2)菌液中5 lOmin，用滅菌濾紙吸干多余菌液，轉(zhuǎn)入MS基本培養(yǎng)基，弱光，280C，共培養(yǎng)2d。(5)將步驟(4)共培養(yǎng)后的煙草葉片外植體先用含氨芐青霉素250mg/L的無(wú)菌水洗滌3次，再用含氨芐青霉素250mg/L的MS培養(yǎng)基洗滌1次，然后用濾紙吸干，轉(zhuǎn)入含卡那霉素100mg/L，氨芐青霉素250mg/L的MS培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)，芽長(zhǎng)至Icm時(shí)，切下芽后，將芽轉(zhuǎn)入含卡那霉素50mg/L，氨芐青霉素250mg/L的MS生根培養(yǎng)基中，25 °C恒溫培養(yǎng)促進(jìn)生根，生根后，移入無(wú)菌土的花盆中，25°C溫室中培養(yǎng)收種子，獲得Tl、T2和T3代轉(zhuǎn)基因煙草種子。(6)煙草轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的獲得及鑒定將步驟(5)中獲得的T1、T2和Τ3代轉(zhuǎn)基因煙草種子先用70%乙醇消毒30 60s，10%次氯酸鈉消毒15min，用滅菌水漂洗至少4 次；去盡水加入0.2%的瓊脂，將種子均勻分布到1/2MS培養(yǎng)基(含50mg/L卡那霉素)表面；轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，葉片顏色為綠色的幼苗即為陽(yáng)性苗(煙草轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株)，并提取煙草葉片基因組DNA，利用PCR驗(yàn)證獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。實(shí)施例4 啟動(dòng)子提高根部基因表達(dá)能力分析⑶S染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)I^raiOP1681啟動(dòng)子下游⑶S基因表達(dá)活性顯著提高，達(dá)到 1300pM Hig-1Hiirr1,具有較高的根特異表達(dá)能力。該基因可以轉(zhuǎn)化水稻等農(nóng)作物，提高其抗脅迫能力，具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。
權(quán)利要求
1 一種PSPR10P1681啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子含有下列任意一組核苷酸序列 a、SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列互補(bǔ)的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的PsPR10P1681啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為含有SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列的啟動(dòng)子。
3.一種DNA構(gòu)建體，其特征在于所述DNA構(gòu)建體包含權(quán)利要求1所述的PsPR10P1681 啟動(dòng)子以及與之進(jìn)行可操作連接的基因序列。
4.一種載體，其特征在于所述載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求3所述的 DNA構(gòu)建體。
5.一種重組細(xì)胞，其特征在于所述的重組細(xì)胞包含權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求4所述的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的重組細(xì)胞，其特征在于所述的重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。
7.一種含有權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求 4所述的載體或權(quán)利要求5所述重組細(xì)胞的植物愈傷組織或植物。
8.如權(quán)利要求7所述的植物愈傷組織或植物為煙草。
9.如權(quán)利要求1或2所述的PsPR10P1681啟動(dòng)子在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的PsPR10P1681啟動(dòng)子在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為PsPR10P1681啟動(dòng)子在抗逆轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用，將抗逆基因置于 I^raiOP1681啟動(dòng)子下游，構(gòu)建植物表達(dá)載體，將載體導(dǎo)入煙草，得到抗逆轉(zhuǎn)基因煙草。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種PsPR10P1681啟動(dòng)子、DNA構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞、植物愈傷組織或植物及所述的PsPR10P1681啟動(dòng)子在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用，所述啟動(dòng)子含有下列任意一組核苷酸序列a、SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列；b、與SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列互補(bǔ)的序列；本發(fā)明PsPR10P1681啟動(dòng)子具有較高的根特異誘導(dǎo)表達(dá)活性，能夠提高下游抗逆基因根特異轉(zhuǎn)錄水平，從而能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物抗逆能力。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102392021SQ20111038432
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者徐祥彬, 王慧中 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)