專利名稱：基于微觀動(dòng)態(tài)離子流技術(shù)檢測水稻真菌性立枯病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流技術(shù)檢測水稻真菌性立枯病的方法。
背景技術(shù)：
水稻是我國第一大糧食作物，但是目前在全國各稻區(qū)生產(chǎn)中普遍存在苗期病秧、 弱秧多，尤其是近年來旱育秧技術(shù)的普遍使用，真菌性立枯病也常有發(fā)生，發(fā)病率很高。另外在水稻育種過程中如果發(fā)生真菌性立枯病會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p失，重者導(dǎo)致前期育種工作白費(fèi)，輕者浪費(fèi)時(shí)間，錯(cuò)過農(nóng)時(shí)。真菌性立枯病是由半知菌亞門的鐮刀菌感染而發(fā)生的真菌性病害，鄭雯等Q001) 分離得到了可以感染水稻的5個(gè)鐮刀菌和1個(gè)立枯絲核菌(鄭雯，臺(tái)蓮梅，王桂海，辛惠普黑龍江東部稻區(qū)水稻立枯病病原真菌的分離鑒定黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)[J]2001， 4:21-23)。蘇寶華等Q010)認(rèn)為真菌性立枯病多發(fā)生在離乳期，葉片展不開，種子和莖部根基部位交界處發(fā)生霉變，同時(shí)莖的基部發(fā)生腐爛，根變成黃褐色，真菌性立枯病嚴(yán)重危害水稻生產(chǎn)(蘇寶華寒地水稻立枯病的發(fā)病原因及防治措施中國農(nóng)村小康科技[J]2010，7 60-61)。迄今為止，對水稻真菌性立枯病的研究都是在防治角度，在病害評價(jià)角度還未見有報(bào)道。微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)，是一項(xiàng)基于Nernst方程和Fick' s第一擴(kuò)散定律計(jì)算離子和分子的濃度和流速的技術(shù)，所檢測的離子或分子的靈敏度可達(dá)10-12mol/Cm2. s，這種技術(shù)的特點(diǎn)是對材料無損的條件下對細(xì)胞、組織、器官、整株材料的外周進(jìn)行離子和分子檢測，最終獲得離子或分子的運(yùn)動(dòng)速率、方向及濃度信息等。該技術(shù)應(yīng)用廣泛，在生命科學(xué)、 環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域被廣泛采用。已有報(bào)道中對水稻真菌性立枯病的防治方法很多，如韓潤亭(申請?zhí)?200810051023) 一種防治水稻惡苗病和立枯病的農(nóng)藥；王國強(qiáng)(申請?zhí)?0103926)稀土生物農(nóng)藥水稻種衣劑。上述發(fā)明主要是針對真菌性立枯病的防治類農(nóng)藥，但是對真菌性立枯病的早期評價(jià)方法未見報(bào)道。利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)可測得真菌性立枯病發(fā)病時(shí)的離子流信息，通過與正常生長的水稻比較，獲得真菌性立枯病發(fā)病時(shí)的離子流吸收或釋放規(guī)律，利用此規(guī)律評價(jià)真菌性立枯病的發(fā)生。以往檢測離子流的方法為原子吸收分光光度法，如高葉等O008) 研究NaCl對甘薯試管苗影響時(shí)通過原子吸收分光光度法檢測離子含量判斷收脅迫的程度(高葉，趙術(shù)珍，陳敏，宋曉征，王寶山=NaCl脅迫對甘薯試管苗生長及離子含量影響， 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)[J]，2008，36 (35) :15333-15335)；郭小俊等(2008)研究ABA對NaCl脅迫下的黃瓜幼苗影響時(shí)，也利用原子吸收分光光度法檢測離子含量研究黃瓜幼苗耐鹽機(jī)理 (郭小俊，謝成俊外源ABA對NaCl脅迫下黃瓜幼苗不同離子含量的影響，中國蔬菜[J]， 2008(9)27-30)。然而，該方法不能實(shí)現(xiàn)活體生物材料的無損、動(dòng)態(tài)檢測，破壞了植物的生活狀態(tài)。因此，開發(fā)新的檢測水稻真菌性立枯病的方法具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在為水稻育苗和水稻育種提供一種快速、無損的檢測水稻真菌性立枯病的新方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測水稻真菌性立枯病的方法，其是利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)分別檢測水稻根系K+、NH4+和Ca2+的吸收能力， 檢測出感染真菌性立枯病的水稻，所述離子流流向處于外流或者是內(nèi)流幅度較對照變小即為感染真菌性立枯病。其中，檢測使用的水稻處于幼苗期。前述的方法，微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)中測試緩沖液中的測試離子濃度為 0. 05 0. 15mM。前述的方法，檢測使用的水稻處于2葉1心期，測量位置為距所述水稻苗根尖 300 500 μ m的根尖分生區(qū)的外表面20 50 μ m處。具體地，前述方法包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端1cm，再將電極前端吸入相應(yīng)的測試離子交換劑；( 將經(jīng)過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗，將其根部先放在測試緩沖液中平衡30min左右，再用校正后的電極對待測水稻苗進(jìn)行檢測10 15min ； (4)對檢測結(jié)果進(jìn)行處理和分析。其中，上述步驟(1)所述離子灌充液為80 140mM KC1、80 140mM NH4Cl和 80 140mM CaCl2 ；步驟(1)所述電極的前端吸入的測試離子交換劑的長度為K+100 200 μ m ；NH4+20 50 μ m 禾口 Ca2+15 30 μ m ；上述步驟(2)所述的校正液為Κ+0· 05 0. 15mM KCl和0. 5 1. 5mM KCl ；NH4+ 0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ :0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；上述步驟(3)所述的測試緩沖液為:K+或Ca2+ :0. 05 0. 15mM KC1、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0· 1 0· 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES ； NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2 和 0· 05 0. 15mM NH4C1。前述方法中校正后電極的能斯特方程計(jì)算理想值為K+ 56 60mV ；NH4+ 56 60mV ；Ca2+ 25 29mV。前述方法中所述K+離子流的流速為10 500pmol. cm_2. s—1，NH4+離子流的流速為 10 500pmol. cnT2. s-1，Ca2+ 離子流的流速為 10 500pmol. cnT2. s-1。本發(fā)明利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)可測得真菌性立枯病發(fā)病時(shí)的離子流信息， 通過與正常生長的水稻比較，獲得真菌性立枯病發(fā)病時(shí)的離子流吸收或釋放規(guī)律，利用此規(guī)律評價(jià)真菌性立枯病的發(fā)生，從而實(shí)現(xiàn)對水稻真菌性立枯病的快速、無損檢測，檢測后的植株材料還能夠正常生長，避免了珍貴水稻苗的損失，檢測結(jié)果對比明顯，方法可靠，為水稻育苗和水稻育種提供了一種快速、無損的檢測水稻真菌性立枯病的新方法。


圖1是本發(fā)明基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)檢測水稻真菌性立枯病的實(shí)驗(yàn)過程圖。
圖2是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的K+離子流分析圖(實(shí)時(shí)流速)。圖3是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的K+離子流分析圖(平均流速)。圖4是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的NH4+離子流分析圖(實(shí)時(shí)流速)。圖5是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的NH4+離子流分析圖(平均流速)。圖6是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的Ca2+離子流分析圖(實(shí)時(shí)流速)。圖7是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的Ca2+離子流分析圖(平均流速)。圖8所示為利用微電極檢測時(shí)，電極距離根尖的位置。其中，圖2、圖4和圖6中縱坐標(biāo)為離子流速，單位為pmol. cm_2. 橫坐標(biāo)為時(shí)間， 單位為s ；圖3、圖5和圖7中縱坐標(biāo)為離子流速，單位為pmol. cm_2. S—1。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。其中，水稻品種龍粳26購自黑龍江省農(nóng)科院佳木斯水稻研究所。實(shí)施例1.實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件材料為水稻品種龍粳沈，種子經(jīng)過曬種，鹽水6/25 (m/v) 篩選后，浸種，25°C催芽，播種在育苗秧盤中，土壤營養(yǎng)土 = 3 1，施底肥硫酸銨(1斤 /1000斤土壤)和磷酸二銨O斤/1000斤土壤)，自然光照，培養(yǎng)地點(diǎn)在北京農(nóng)業(yè)信息技術(shù)研究中心溫室，秧苗在2葉1心時(shí)水稻真菌性立枯病開始發(fā)生，此時(shí)開始離子流檢測。2.實(shí)驗(yàn)儀器及耗材離子流檢測用非損傷微測系統(tǒng)(BIO-OOlBJoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)， 軟件imFlux，采用尖端直徑為2-4 μ m的玻璃微電極。3.實(shí)驗(yàn)試劑及溶液(1)液態(tài)離子交換劑包括K+ 貨號 Potassium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103，USA ；NH4+ 貨號 Ammonium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103, USA ；Ca2+ 貨號 Calcium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103，USA ；(2)測試緩沖液離子流測試時(shí)，測試不同的離子需要不同的測試液，如下K+離子0. ImM KCl,0. ImM CaCl2、0. ImM MgCl2、0. 5mM NaCl、0. 2mM Na2S04、0. 3mM MESNH4+離子lmM KC1、0. ImM CaCl2,0. ImM NH4ClCa2+離子0. ImM KC1、0. ImM CaCl2,0. ImM MgCl2、0. 5mMNaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mM MES(3)電極灌充液K+: IOOmM KClNH4+: IOOmM NH4ClCa2+: IOOmM CaCl2(4)校正液K+ 離子0. ImM 和 ImM KCl
NH4+ 離子0. ImM 和 ImM NH4ClCa2+ 離子0. ImM 和 ImM CaCl24.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法實(shí)驗(yàn)過程如圖1所示。從電極末端灌入Icm左右的相應(yīng)測試離子的灌充液至電極尖端充滿，前端吸入適當(dāng)長度(K+ 100 200 μ m、NH4+ :20 50 μ m、Ca2+ :15 30 μ m)的離子交換劑(LIX)。將電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座。參比電極為固體低滲漏性電極(WPI)。電極在相應(yīng)的校正液中校正，其Nerst方程計(jì)算理想值分別是K+、NH4+ :56_60mV，Ca2+ :25_30mV。材料在測試前置于相應(yīng)的測試液中平衡30min左右。然后在距離水稻根尖分生區(qū) (距離根尖300 μ m左右)表面30 μ m的地方振動(dòng)檢測(圖8)，每個(gè)樣品檢測10min-15min。5.數(shù)據(jù)處理離子流處理基于Fick擴(kuò)散定律，并通過在線軟件MageFlux_3DIon Flux Plotting System(http://www. xuyue. net/magef lux/)計(jì)算得出。由3次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析，利用Exce 12003分析作圖。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-圖7所示由圖2和圖3可以看出正常水稻苗的K+離子處于內(nèi)流狀態(tài)，平均流速為-50. 32pmol. cm_2. s—1 ；發(fā)生真菌性立枯病的水稻苗K+處于明顯的外流狀態(tài)，平均流速為 12. 15pmol. cm 2· s 1O由圖4和圖5可以看出正常水稻苗的NH4+處于內(nèi)流狀態(tài)，平均流速為-118. 6pmol. cm—2, s—1 ；發(fā)生真菌性立枯病的水稻苗的NH4+處于外流狀態(tài)，平均流速為 85. 07pmol. cm 2· s 1O由圖6和圖7可以看出正常的水稻苗的Ca2+處于內(nèi)流狀態(tài)，平均流速為-105. 68pmol. cm—2· s-1，發(fā)生真菌性立枯病的水稻苗Ca2+處于外流狀態(tài)，平均流速為 56. 33pmol. cm 2· s 1O上述結(jié)果表明，水稻在發(fā)生真菌性立枯病的時(shí)候K+、NH4+和Ca2+三種無機(jī)離子由正常的內(nèi)流轉(zhuǎn)為外流，導(dǎo)致無機(jī)營養(yǎng)流失，造成生理機(jī)能的改變。通過三種無機(jī)離子的離子流向和流速可以判斷水稻是否感染了真菌性立枯病以及感染程度。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)檢測水稻真菌性立枯病的方法，其特征在于，利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)分別檢測水稻根系K+、NH4+和Ca2+的吸收能力，檢測出感染真菌性立枯病的水稻，所述離子流流向處于外流或者是內(nèi)流幅度較對照變小即為感染真菌性立枯病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測使用的水稻處于幼苗期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)中測試緩沖液中的測試離子濃度為0. 05 0. 15mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，檢測使用的水稻處于2葉1心期，測量位置為距所述水稻苗根尖300 500 μ m的根尖分生區(qū)的外表面20 50 μ m處。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端1cm，再將電極前端吸入相應(yīng)的測試離子交換劑；(2)將經(jīng)過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗，將其根部先放在測試緩沖液中平衡30min，再用校正后的電極對待測水稻苗進(jìn)行檢測10 15min ；(4)對檢測結(jié)果進(jìn)行處理和分析；其中，步驟(1)所述離子灌充液為80 140mM KC1、80 HOmMNH4Cl和80 140mM CaCl2 ；步驟(1)電極的前端吸入的測試離子交換劑的長度為K+100 200μπι ;ΝΗ4+20 50 μ m 禾口 Ca2+15 30 μ m ；步驟(2)所述的校正液為K+0. 05 0. 15mM KCl 和 0. 5 1. 5mMKCl ；NH4+ :0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ :0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；步驟(3)所述的測試緩沖液為=K+或Ca2+ 0. 05 0. 15mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2, 0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0· 1 0· 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES ；NH4+ 0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 05 0. 15mM NH4C1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，校正后電極的能斯特方程計(jì)算理想值為 K+ 56 60mV ；NH4+ 56 60mV ；Ca2+ 25 29mV。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述K+離子流的流速為10 500pmol.cnT2. s"1, NH4+離子流的流速為10 500pmol. cnT2. s"1, Ca2+離子流的流速為10 500pmol.-2 -1 cm . s ο
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)的水稻真菌性立枯病的檢測方法，其是利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)分別檢測水稻根系K+、NH4+和Ca2+的吸收能力，檢測出感染真菌性立枯病的水稻。本發(fā)明利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測技術(shù)可測得真菌性立枯病發(fā)病時(shí)的離子流信息，通過與正常生長的水稻比較，獲得真菌性立枯病發(fā)病時(shí)的離子流吸收或釋放規(guī)律，利用此規(guī)律評價(jià)真菌性立枯病的發(fā)生，從而實(shí)現(xiàn)對水稻真菌性立枯病的快速、無損檢測，檢測后的植株材料還能夠正常生長，避免了珍貴水稻苗的損失，檢測結(jié)果對比明顯，方法可靠，為水稻育苗和水稻育種提供了一種快速、無損的檢測水稻真菌性立枯病的新方法。
文檔編號A01G7/06GK102520046SQ201110364009
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者侯佩臣, 潘大宇, 王成, 王曉冬, 王紀(jì)華, 羅斌 申請人:北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心