專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速構(gòu)建水稻滲入系發(fā)掘優(yōu)良基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻基因組大片段轉(zhuǎn)化構(gòu)建滲入系的方法。
背景技術(shù)：
滲入系(Introgressing line)是通過(guò)系統(tǒng)回交和自交使供體染色體片段滲入到受體親本中而獲得的材料或植株，或者利用植物基因工程技術(shù)將供體植物基因組大片段導(dǎo)入受體親本而獲得的材料或植株。傳統(tǒng)的滲入系的構(gòu)建方法通過(guò)多代回交和自交的方法，同時(shí)借助于分子標(biāo)記圖譜和分子標(biāo)記輔助選擇的手段分析供體染色體片段，該分子標(biāo)記圖譜和分子標(biāo)記輔助選擇的手段還局限在對(duì)該方法構(gòu)建的滲入系群體的檢測(cè)分析上。該方法存在不僅工作量大，而且有后代選擇效率低、雜交轉(zhuǎn)育后往往出現(xiàn)瘋狂分離、不育或死亡的現(xiàn)象，并且育種周期長(zhǎng)等缺陷和不足。植物基因工程技術(shù)構(gòu)建滲入系是通過(guò)構(gòu)建的基因組文庫(kù)，將基因組文庫(kù)的克隆導(dǎo)入受體植物，該方法可以克服供體植物與受體植物之間的生殖障礙，但由于所構(gòu)建的基因組文庫(kù)通常含有數(shù)萬(wàn)個(gè)單克隆，如，云南藥用野生稻BIBAC文庫(kù)包含53760個(gè)克隆，在將這些單克隆導(dǎo)入受體親本時(shí)也相應(yīng)要做上萬(wàn)次導(dǎo)入，存在工作量龐大的缺陷和不足。因此， 研究提供一種能克服以上缺陷和不足的滲入系的構(gòu)建方法，是育種工作急需解決的技術(shù)問(wèn)題。野生稻(Oryza rufipogon )是水稻的原始祖先，世界上目前共有20多種野生稻種，其中中國(guó)有3種，即藥用野生稻、普通野生稻和疣粒野生稻。中國(guó)野生稻在云南省分布最廣，生太類(lèi)型多。野生稻具有栽培稻所沒(méi)有的豐富的、優(yōu)良的特異性狀，如高蛋白、分蘗力強(qiáng)、高抗褐飛虱和白葉枯病等優(yōu)良性狀，云南野生稻由于獨(dú)立起源和進(jìn)化，又具有其它藥用野生稻不具有的結(jié)實(shí)率高等重要的特異優(yōu)良性狀，這些野生稻是水稻育種的寶貴資源， 也是水稻基因工程研究和水稻育種獲得突破的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，常將這些野生稻作為供體植物構(gòu)建滲入系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明方法要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)利用基因組文庫(kù)構(gòu)建滲入系存在工作量龐大的缺陷和不足，而提供一種快速構(gòu)建水稻滲入系的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所述的一種快速構(gòu)建水稻滲入系發(fā)掘優(yōu)良基因的方法，包括如下步驟
(1)構(gòu)建BIBAC基因文庫(kù)混合池 ①一級(jí)混合池的構(gòu)建
待BIBAC基因文庫(kù)的文庫(kù)保存板中的單克隆菌液完全融化后，將每一塊文庫(kù)保存板中每一列中的16個(gè)孔內(nèi)的單克隆菌液合并成一個(gè)一級(jí)混合池，將一級(jí)混合池標(biāo)記為(X)-y，X為文庫(kù)保存板的編號(hào)，X=l，2，3，……自然數(shù)，y為每一塊文庫(kù)保存板中列的編號(hào)，y=l， 2,3,……自然數(shù)，該一級(jí)混合池命名為(X) _y號(hào)一級(jí)混合池；
②二級(jí)混合池的構(gòu)建
將每一塊文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池，將二級(jí)混合池標(biāo)記為X，X=l，2，3，……自然數(shù)，該二級(jí)混合池命名為X號(hào)二級(jí)混合池；X與文庫(kù)保存板的編號(hào)相同；
③三級(jí)混合池的構(gòu)建
按二級(jí)混合池編號(hào)順序從1號(hào)二級(jí)混合池開(kāi)始，每10個(gè)二級(jí)混合池合并成為一個(gè)三級(jí)混合池，將三級(jí)混合池記為η，η =1，2，3，……自然數(shù)，該三級(jí)混合池命名為η號(hào)三級(jí)混合池；
(2)用常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法分別將各三級(jí)混合池中的混合克隆導(dǎo)入受體植物，獲得滲入系。步驟( 所述的常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法為為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法、基因槍、花粉管通道方法中的任一種。所述的BIBAC基因文庫(kù)為野生稻BIBAC基因文庫(kù)。所述的野生稻為藥用野生稻。所述的受體植物為栽培稻。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的有益效果是
1、本發(fā)明方法將BIBAC基因文庫(kù)構(gòu)建成基因文庫(kù)混合池，將常規(guī)的藥用野生稻基因文庫(kù)包含的5萬(wàn)以上的單克隆構(gòu)建成了只有10多個(gè)的三級(jí)混合池，只需將10多個(gè)三級(jí)混合池轉(zhuǎn)化受體親本，即10多次轉(zhuǎn)化手續(xù)，即可構(gòu)建全基因組導(dǎo)入的滲入系，而將常規(guī)的藥用野生稻基因文庫(kù)全基因?qū)ЫM入受體親本，需5萬(wàn)次以上的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)才能構(gòu)建滲入系，因此， 本發(fā)明方法克服了現(xiàn)有技術(shù)超大的工作量的缺陷，節(jié)省了幾萬(wàn)次轉(zhuǎn)化手續(xù)，大幅度地減輕了科研人員的工作量，達(dá)到了簡(jiǎn)便、快速的目的。2、本發(fā)明方法因每個(gè)三級(jí)混合池含有了較多的大片段，又可簡(jiǎn)便、快速地將各三級(jí)混合池導(dǎo)入滲入系，可使該滲入系達(dá)到全基因組的插入。3、本發(fā)明方法通過(guò)三級(jí)混合池，依次可追溯到二級(jí)混合池、一級(jí)混合池，文庫(kù)保存板的某一列中的某一個(gè)孔的單克隆，因此能簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確地查找到供體植物的優(yōu)良基因定位，有利于供體優(yōu)良基因的發(fā)掘利用。


圖1為雙元細(xì)菌人工染色體BIBAC2質(zhì)粒載體物理圖。圖2為一級(jí)混合池和二級(jí)混合池的構(gòu)建示意圖，圖中(X) -1 (X) -24，表示第X 塊文庫(kù)保存板中的M個(gè)一級(jí)混合池，X表示M個(gè)一級(jí)混合池合并成的一個(gè)二級(jí)混合池。圖3為三級(jí)混合池的構(gòu)建示意圖，圖中1 10表示1號(hào)二級(jí)混合池至10號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池合并構(gòu)建1個(gè)三級(jí)混合池，1表示1號(hào)三級(jí)混合池。圖4為攜帶三級(jí)混合池BIBAC2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化克隆中nptW基因的 PCR檢測(cè)，M，DL2000 marker ；1為陽(yáng)性對(duì)照(BIBAC2載體為摸板)；2，為陰性對(duì)照；3-24為 7號(hào)三級(jí)混合池質(zhì)粒BIBAC2電擊轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌的克隆。
圖5為農(nóng)桿菌克隆中BIBAC2質(zhì)粒攜帶藥用野生稻基因片段的PCR檢測(cè)情況，M， DL2000 marker ； 1-2 陰性對(duì)照(空BIBAC2載體)；3-23 攜帶藥用野生稻片段的農(nóng)桿菌克隆。圖6為滲入系中如 基因片段的PCR檢測(cè)，M:DL2000 marker ； 1_2 陽(yáng)性對(duì)照 (BIBAC2載體為模板)；3，4 陰性對(duì)照(日本晴，中花11) ；5-14 日本晴滲入系；15-23 中花 11滲入系。圖7為滲入系中/7/7 ΙΙ基因片段的PCR檢測(cè)，M :DL2000 marker ；1-2 陽(yáng)性對(duì)照 (BIBAC2載體為模板)3，4:陰性對(duì)照(日本晴，中花11) ；5-11 日本晴滲入系；12-16 中花 11滲入系。
圖8是實(shí)施例2步驟(2)中4)轉(zhuǎn)化子的分子檢測(cè)的兩個(gè)PCR反應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序圖。 圖9是實(shí)施例3步驟2中2、滲入系的如 基因和/？辦//基因檢測(cè)的PCR擴(kuò)增程序圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)材料
1、云南藥用野生稻為供體材料，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)及種質(zhì)資源研究所提供。供體材料也可用其它水稻材料。云南藥用野生稻(漢Officiz7Wi1S Wall, ex Watt.) 是產(chǎn)于云南省，因獨(dú)立起源和進(jìn)化，具有其它藥用野生稻不具有的結(jié)實(shí)率高等重要的特意優(yōu)良性狀，因此，特別值得開(kāi)發(fā)和利用，受到本領(lǐng)域的重視。2、受體植物兩種栽培稻品種日本晴、中花11，可從商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)到。其中，日本晴的全基因組序列的測(cè)定工作已經(jīng)完成，這樣該藥用野生稻基因轉(zhuǎn)入到這兩個(gè)栽培稻中時(shí)，有利于藥用野生稻的基因克隆與定位；中花11是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因常用的受體材料，外源基因比較容易轉(zhuǎn)入其基因組。3、實(shí)施例中所有試劑均能從商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)到。實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器設(shè)備 電擊轉(zhuǎn)化儀(Bio-Rad GENE PULSER)
臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5417R/5810R)
高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN J2-M1)
超速離心機(jī)(BECKMAN Optima L-100XP)
電泳儀(Bio-RAD Model 3000X1)
脈沖場(chǎng)電泳儀(Bio-RAD CHEF MAPPER)
凝膠成像系統(tǒng)(GENE Company Limited)
移液器(Eppendorf)
PCR 儀(Bio-RAD PTC-200)
pH 計(jì)(BECKMAN 360PH/Temp/Mv Meter)
超純水系統(tǒng)(MILLIPORE ACADEMIC-Q)
高壓滅菌鍋(SANYO Labo Autoclave))
-20 °C 低溫冰箱(Shuang Lu BCD-230)
-80°C超低溫冰箱(SANYO OLTRA LOW)
制冰機(jī)(COMMERCIAL ICE SYSTEM)
恒溫?fù)u床(中國(guó)太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠THZ-C)恒溫?fù)u床(中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠HQ452) 超凈臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。實(shí)施例1云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)的構(gòu)建
云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)的構(gòu)建是按照常規(guī)的BIBAC基因文庫(kù)的構(gòu)建方法構(gòu)建的。還可參照“云南藥用野生稻BIBAC文庫(kù)的構(gòu)建及分析”(作者侯思名等，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第37卷第1期2011年2月，17-21)構(gòu)建。用現(xiàn)有的常規(guī)方法構(gòu)建的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)的克隆載體是雙元細(xì)菌人工染色體BIBAC2，大小為23. 5kb,具有單克隆酶切位點(diǎn)BamHI，如圖1所示，對(duì)卡那霉素(Km)具有抗性，具有feci 基因，當(dāng)載體有外源片段插入，可以在含5%的蔗糖和卡那霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；該云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)包括53760個(gè)克隆， 平均插入片段76 kb,保存在140塊文庫(kù)保存板中，每塊文庫(kù)保存板有M列，每列有16個(gè)孔，即每塊文庫(kù)保存板有384個(gè)孔用以貯存克隆菌液，用X表示文庫(kù)保存板的編號(hào)，X=l，2， 3，……140自然數(shù)；從第1塊文庫(kù)保存板開(kāi)始，依次，命名為第1塊文庫(kù)保存板，第2塊文庫(kù)保存板，第3塊文庫(kù)保存板，第4塊文庫(kù)保存板，第5塊文庫(kù)保存板，……到第140塊文庫(kù)保存板，其基因文庫(kù)庫(kù)容相當(dāng)于云南藥用野生稻基因組的5. 86倍。實(shí)施例2本發(fā)明的快速構(gòu)建水稻滲入系發(fā)掘優(yōu)良基因的方法
用實(shí)施例1所構(gòu)建的云南藥用野生稻基因組文庫(kù)按以下步驟構(gòu)建水稻滲入系 (1)構(gòu)建基因文庫(kù)混合池 1) 一級(jí)混合池的構(gòu)建
①待云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)的文庫(kù)保存板中的單克隆菌液完全融化后，將每一塊文庫(kù)保存板中，每一列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并成一個(gè)一級(jí)混合池，每一塊文庫(kù)保存板有M列，共合并成M —個(gè)一級(jí)混合池，具體操作是用最大量程為10 μ 1的移液槍分別吸取文庫(kù)保存板的1列中的16個(gè)孔中單克隆菌液10 μ 1，合加在一個(gè)已裝有1.5ml培養(yǎng)基的離心管中，所述的培養(yǎng)基與構(gòu)建的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)所采用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件均相同，具體是所述的培養(yǎng)基是1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，1.0% NaCl, 360mmol/LK2HP04, 132mmol/LKH2PO4, 17mmol/L, Na citrate 4mmol/L MgSO4 · 7H20，68 mmol /L (NH4)2S04，每次在吸取1個(gè)孔中的單克隆菌液之前先用移液槍將沉淀在板底的菌體重懸后再吸取菌液，每個(gè)單克隆菌液用一個(gè)無(wú)菌移液槍頭；將所建成的一級(jí)混合池放入 37°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 他(培養(yǎng)條件)；所述的百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)；
②將收集了的每一列的混合菌液離心管標(biāo)記為(X)_y，X為文庫(kù)保存板的編號(hào)，X=l， 2,3,……140自然數(shù);y為每一塊文庫(kù)保存板中列的編號(hào)，y=l，2，3，4，5，6，7，8，9，10，ll， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 ；即每一塊文庫(kù)保存板有24個(gè)一級(jí)混合池(如圖2)，一級(jí)混合池命名為(X)-y號(hào)一級(jí)混合池；因云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)有140 塊文庫(kù)保存板，所以構(gòu)成3360個(gè)一級(jí)混合池(140XM=3360)；
以下以第1塊文庫(kù)保存板，第2塊文庫(kù)保存板，第3塊文庫(kù)保存板，第140塊文庫(kù)保存板為例，更具體地說(shuō)明該文庫(kù)保存板中每一列16個(gè)孔的單克隆菌液合并在一個(gè)離心管中， 該離心管的標(biāo)記即一級(jí)混合池的標(biāo)記 第1塊文庫(kù)保存板
第1塊文庫(kù)保存板第1列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管記為(1)_1，命名為-1號(hào)一級(jí)混合池，以下類(lèi)推；(1)-2第塊文庫(kù)保存板第2列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-2，第塊文庫(kù)保存板第3列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-3，第塊文庫(kù)保存板第4列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-4，第塊文庫(kù)保存板第5列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-5，第塊文庫(kù)保存板第6列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-6，第塊文庫(kù)保存板第7列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-7，第塊文庫(kù)保存板第8列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-8，第塊文庫(kù)保存板第9列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-9，第塊文庫(kù)保存板第10列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-10,第塊文庫(kù)保存板第11列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-11,第塊文庫(kù)保存板第12列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-12，第塊文庫(kù)保存板第13列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-13，第塊文庫(kù)保存板第14列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-14，第塊文庫(kù)保存板第15列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-15，第塊文庫(kù)保存板第16列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-16，第塊文庫(kù)保存板第17列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-17，第塊文庫(kù)保存板第18列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-18，第塊文庫(kù)保存板第19列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-19，第塊文庫(kù)保存板第20列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-20，第塊文庫(kù)保存板第21列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-21，第塊文庫(kù)保存板第22列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-22，第塊文庫(kù)保存板第23列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-23，第塊文庫(kù)保存板第24列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<隆標(biāo)記為(1)-24 ；分別命名為(I)-I號(hào)一級(jí)混合池，(1)-2號(hào)一級(jí)混合池，(1)-3號(hào)一級(jí)混合池，(1)-級(jí)混合池，(1)-5號(hào)一-級(jí)混合池，(1)-6號(hào)一級(jí)混合池，(1)-7號(hào)一級(jí)混合池，(1)-8
一級(jí)混合池，(1) -9號(hào)一級(jí)混合池，(1) -10號(hào)一級(jí)混合池，(1) -11號(hào)一級(jí)混合池，(1) -12 號(hào)一級(jí)混合池，(1) -13號(hào)一級(jí)混合池，(1) -14號(hào)一級(jí)混合池，(1) -15號(hào)一級(jí)混合池， (1)-6號(hào)一級(jí)混合池，(1) -17號(hào)一級(jí)混合池，(1) -18號(hào)一級(jí)混合池，(1) -19號(hào)一級(jí)混合池，(1) -20號(hào)一級(jí)混合池，(1)-21號(hào)一級(jí)混合池，(1) -22號(hào)一級(jí)混合池，(1)-23號(hào)一級(jí)混合池，(1) 號(hào)一級(jí)混合池，以下類(lèi)推； 第2塊文庫(kù)保存板
第2塊文庫(kù)保存板第1列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管記為(2)-1， 第2塊文庫(kù)保存板第2列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -2， 第2塊文庫(kù)保存板第3列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -3， 第2塊文庫(kù)保存板第4列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -4， 第2塊文庫(kù)保存板第5列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -5， 第2塊文庫(kù)保存板第6列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -6， 第2塊文庫(kù)保存板第7列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -7，第2塊文庫(kù)保存板第8列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -8， 第2塊文庫(kù)保存板第9列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -9，
第2塊文庫(kù)保存板第10列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-10,第2塊文庫(kù)保存板第11列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-11,第2塊文庫(kù)保存板第12列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-12，第2塊文庫(kù)保存板第13列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-13，第2塊文庫(kù)保存板第14列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-14，第2塊文庫(kù)保存板第15列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-15，第2塊文庫(kù)保存板第16列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-16，第2塊文庫(kù)保存板第17列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-17，第2塊文庫(kù)保存板第18列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-18，第2塊文庫(kù)保存板第19列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-19，第2塊文庫(kù)保存板第20列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-20，第2塊文庫(kù)保存板第21列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-21，第2塊文庫(kù)保存板第22列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-22，第2塊文庫(kù)保存板第23列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-23，第2塊文庫(kù)保存板第24列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)—24
第3塊文庫(kù)保存板
第3塊文庫(kù)保存板第1列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管記為(3)-1， 第3塊文庫(kù)保存板第2列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -2 第3塊文庫(kù)保存板第3列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -3 第3塊文庫(kù)保存板第4列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -4 第3塊文庫(kù)保存板第5列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -5 第3塊文庫(kù)保存板第6列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -6 第3塊文庫(kù)保存板第7列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -7 第3塊文庫(kù)保存板第8列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -8 第3塊文庫(kù)保存板第9列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -9
第3塊文庫(kù)保存板第10列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-10第3塊文庫(kù)保存板第11列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-11第3塊文庫(kù)保存板第12列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-12第3塊文庫(kù)保存板第13列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-13第3塊文庫(kù)保存板第14列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-14第3塊文庫(kù)保存板第15列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-15第3塊文庫(kù)保存板第16列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-16第3塊文庫(kù)保存板第17列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-17第3塊文庫(kù)保存板第18列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-18第3塊文庫(kù)保存板第19列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-19第3塊文庫(kù)保存板第20列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-20第3塊文庫(kù)保存板第21列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(3)-21第3塊文庫(kù)保存板第22列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -22， 第3塊文庫(kù)保存板第23列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -23， 第3塊文庫(kù)保存板第M列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3)-24 ； 依此類(lèi)推，到第140塊文庫(kù)保存板時(shí)，合并單克隆菌液的離心管標(biāo)記是 第140塊文庫(kù)保存板第1列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管記為(140)-1， 第140塊文庫(kù)保存板第2列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-2 第140塊文庫(kù)保存板第3列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-3 第140塊文庫(kù)保存板第4列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-4 第140塊文庫(kù)保存板第5列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-5 第140塊文庫(kù)保存板第6列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-6 第140塊文庫(kù)保存板第7列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-7 第140塊文庫(kù)保存板第8列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-8 第140塊文庫(kù)保存板第9列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-9
第140塊文庫(kù)保存板第10列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(Η Ο--10第140塊文庫(kù)保存板第11列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 標(biāo)記為 (140)--11第140塊文庫(kù)保存板第12列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(Η Ο--12第140塊文庫(kù)保存板第13列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 標(biāo)記為 (140)--13第140塊文庫(kù)保存板第14列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(Η Ο--14第140塊文庫(kù)保存板第15列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 標(biāo)記為 (140)--15第140塊文庫(kù)保存板第16列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(Η Ο--16第140塊文庫(kù)保存板第17列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 標(biāo)記為 (140)--17第140塊文庫(kù)保存板第18列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(Η Ο--18第140塊文庫(kù)保存板第19列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 標(biāo)記為 (140)--19第140塊文庫(kù)保存板第20列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(Η Ο--20第140塊文庫(kù)保存板第21列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 標(biāo)記為 (140)--21第140塊文庫(kù)保存板第22列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 f標(biāo)記為(Η Ο--22第140塊文庫(kù)保存板第23列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離.心 標(biāo)記為 (140)--23第140塊文庫(kù)保存板第M列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售f標(biāo)記為(140)-24
2) 二級(jí)混合池的構(gòu)建
對(duì)步驟(1)的一級(jí)混合池再進(jìn)行組合，將每一塊文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池(圖2)，具體操作是從第1文庫(kù)保存板開(kāi)始，依次，將每一文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池中的混合菌液分別用最大量程為200 μ 1移液槍吸取50 μ 1 混合菌液，合加在一個(gè)空的1. 5ml離心管中，將離心管標(biāo)記為X，X為文庫(kù)保存板的編號(hào)， X=I,2,3,……自然數(shù)，該混合池命名為X號(hào)二級(jí)混合池；每次吸取一個(gè)一級(jí)混合池的混合菌液之前，先用該移液槍充分混勻，并且每次更換無(wú)菌移液槍頭；將構(gòu)建成的二級(jí)混合池放入37°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 他；因每一塊文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池，云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)有140塊文庫(kù)保存板，所以構(gòu)成140個(gè)二級(jí)混合池，即二級(jí)混合池的數(shù)為X，X=云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)的文庫(kù)保存板數(shù)； 以下以第1塊文庫(kù)保存板，第2塊文庫(kù)保存板，第3塊文庫(kù)保存板，第140塊文庫(kù)保存板為例，更具體地說(shuō)明各文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池及其標(biāo)記
第1塊文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池分別是(I)-I號(hào)一級(jí)混合池，(1)-2號(hào)一級(jí)混合池，(1)-3號(hào)一級(jí)混合池，(1)-4號(hào)一級(jí)混合池，(1)-5號(hào)一級(jí)混合池，(1)-6號(hào)一級(jí)混合池，(1)-7號(hào)一級(jí)混合池，(1)-8號(hào)一級(jí)混合池，(1)-9號(hào)一級(jí)混合池，(I)-IO號(hào)一級(jí)混合池，(I)-Il號(hào)一級(jí)混合池，(1)-12號(hào)一級(jí)混合池，(1)-13號(hào)一級(jí)混合池，(1)-14號(hào)一級(jí)混合池，(1)-15號(hào)一級(jí)混合池，(1)-16號(hào)一級(jí)混合池，(1)-17號(hào)一級(jí)混合池，(1)-18號(hào)一級(jí)混合池，(1)-19號(hào)一級(jí)混合池，(1)-20號(hào)一級(jí)混合池，(1)-21號(hào)一級(jí)混合池，(1)-22 號(hào)一級(jí)混合池，(1) -23號(hào)一級(jí)混合池，(1) -24號(hào)一級(jí)混合池；將這M個(gè)一級(jí)混合池按上述方法合并后的二級(jí)混合池標(biāo)記是1，X=I ；命名為1號(hào)二級(jí)混合池
第2塊文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池分別是(2)-1號(hào)一級(jí)混合池，(2)-2號(hào)一級(jí)混合池，(2)-3號(hào)一級(jí)混合池，(2)-4號(hào)一級(jí)混合池，(2)-5號(hào)一級(jí)混合池，(2)-6號(hào)一級(jí)混合池，(2)-7號(hào)一級(jí)混合池，(2)-8號(hào)一級(jí)混合池，(2)-9號(hào)一級(jí)混合池，(2)-10號(hào)一級(jí)混合池，(2)-11號(hào)一級(jí)混合池，(2)-12號(hào)一級(jí)混合池，(2)-13號(hào)一級(jí)混合池，(2)-14號(hào)一級(jí)混合池，(2)-15號(hào)一級(jí)混合池，(2)-16號(hào)一級(jí)混合池，(2)-17號(hào)一級(jí)混合池，(2)-18號(hào)一級(jí)混合池，(2)-19號(hào)一級(jí)混合池，(2)-20號(hào)一級(jí)混合池，(2)-21號(hào)一級(jí)混合池，(2)-22 號(hào)一級(jí)混合池，(2) -23號(hào)一級(jí)混合池，(2) -24號(hào)一級(jí)混合池；將這M個(gè)一級(jí)混合池按上述方法合并后的二級(jí)混合池的標(biāo)記是2，X=2 ；命名為2號(hào)二級(jí)混合池；
第3塊文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池分別是(3) -1號(hào)一級(jí)混合池，(3) -3號(hào)一級(jí)混合池，(3) -4號(hào)一級(jí)混合池，(3) -5號(hào)一級(jí)混合池，(3) -6號(hào)一級(jí)混合池，(3) -7號(hào)一級(jí)混合池，(3)-8號(hào)一級(jí)混合池，(3)-9號(hào)一級(jí)混合池，(3)-10號(hào)一級(jí)混合池，(3)-11 號(hào)一級(jí)混合池，(3) -12號(hào)一級(jí)混合池，(3) -13號(hào)一級(jí)混合池，(3) -14號(hào)一級(jí)混合池， (3) -15號(hào)一級(jí)混合池，(3) -16號(hào)一級(jí)混合池，(3) -17號(hào)一級(jí)混合池，(3) -18號(hào)一級(jí)混合池，(3) -19號(hào)一級(jí)混合池，(3) -20號(hào)一級(jí)混合池，(3) -21號(hào)一級(jí)混合池，(3) -22號(hào)一級(jí)混合池，(3) -23號(hào)一級(jí)混合池，(3) -24號(hào)一級(jí)混合池；將這M個(gè)一級(jí)混合池按上述方法合并后的二級(jí)混合池的標(biāo)記是3，X=3 ；命名為3號(hào)二級(jí)混合池；
依此類(lèi)推，到第140塊文庫(kù)保存板時(shí)，第140塊文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池分別是(140) -1號(hào)一級(jí)混合池，(140) -2號(hào)一級(jí)混合池，(140) -3號(hào)一級(jí)混合池，(140) -4 號(hào)一級(jí)混合池，(140) -5號(hào)一級(jí)混合池，(140) -6號(hào)一級(jí)混合池，(140) -7號(hào)一級(jí)混合池， (140) -8號(hào)一級(jí)混合池，(140) -9號(hào)一級(jí)混合池，(140) -10號(hào)一級(jí)混合池，(140) -11號(hào)一級(jí)混合池，(140) -12號(hào)一級(jí)混合池，(140) -13號(hào)一級(jí)混合池，(140) -14號(hào)一級(jí)混合池， (140)-15號(hào)一級(jí)混合池，(140)-16號(hào)一級(jí)混合池，(140)-17號(hào)一級(jí)混合池，(140)-18號(hào)一級(jí)混合池，(140) -19號(hào)一級(jí)混合池，(140) -20號(hào)一級(jí)混合池，(140) -21號(hào)一級(jí)混合池， (140) -22號(hào)一級(jí)混合池，(140) -23號(hào)一級(jí)混合池，(140) -24號(hào)一級(jí)混合池；將這M個(gè)一級(jí)混合池按上述方法合并后的二級(jí)混合池的標(biāo)記是140，X=140 ；命名為140號(hào)二級(jí)混合池；
3)三級(jí)混合池的構(gòu)建
按步驟(2)的二級(jí)混合池編號(hào)順序從1號(hào)二級(jí)混合池開(kāi)始，每10個(gè)二級(jí)混合池合并成為一個(gè)三級(jí)混合池(圖3)，將每10個(gè)二級(jí)混合池中混合菌液分別用最大量程為200 μ 1移液槍吸取100 μ 1混合菌液，合加在一個(gè)空的1. 5mL離心管中，將離心管標(biāo)記為1，即n=l，該混合池命名為1號(hào)三級(jí)混合池，共構(gòu)成X/10個(gè)三級(jí)混合池，X與文庫(kù)保存板的編號(hào)相同，云南藥用野生稻BIBAC基因文庫(kù)有140塊文庫(kù)保存板，即X=140，X/10=140/10=14，所以構(gòu)成 14個(gè)三級(jí)混合池；
以下從1號(hào)二級(jí)混合池開(kāi)始，將1號(hào)二級(jí)混合池至10號(hào)二級(jí)混合池的10個(gè)二級(jí)混合池合并成一個(gè)三級(jí)混合池，依次，至140號(hào)二級(jí)混合池的合并及標(biāo)記如下
將1號(hào)二級(jí)混合池，2號(hào)二級(jí)混合池，3號(hào)二級(jí)混合池，4號(hào)二級(jí)混合池，5號(hào)二級(jí)混合池，6號(hào)二級(jí)混合池，7號(hào)二級(jí)混合池，8號(hào)二級(jí)混合池，9號(hào)二級(jí)混合池和10號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為1，n=l，該混合池命名為1號(hào)三級(jí)混合池；
將11號(hào)二級(jí)混合池，12號(hào)二級(jí)混合池，13號(hào)二級(jí)混合池，14號(hào)二級(jí)混合池，15號(hào)二級(jí)混合池，16號(hào)二級(jí)混合池，17號(hào)二級(jí)混合池，18號(hào)二級(jí)混合池，19號(hào)二級(jí)混合池和20號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為2，n=2, 該混合池命名為2號(hào)三級(jí)混合池；
將21號(hào)二級(jí)混合池，22號(hào)二級(jí)混合池，23號(hào)二級(jí)混合池，M號(hào)二級(jí)混合池，25號(hào)二級(jí)混合池J6號(hào)二級(jí)混合池，27號(hào)二級(jí)混合池，觀號(hào)二級(jí)混合池，四號(hào)二級(jí)混合池和30號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為3，n=3, 該混合池命名為3號(hào)三級(jí)混合池；
將31號(hào)二級(jí)混合池，32號(hào)二級(jí)混合池，33號(hào)二級(jí)混合池，34號(hào)二級(jí)混合池，35號(hào)二級(jí)混合池，36號(hào)二級(jí)混合池，37號(hào)二級(jí)混合池，38號(hào)二級(jí)混合池，39號(hào)二級(jí)混合池和40號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為4，n=4, 該混合池命名為4號(hào)三級(jí)混合池；
將41號(hào)二級(jí)混合池，42號(hào)二級(jí)混合池，43號(hào)二級(jí)混合池，44號(hào)二級(jí)混合池，45號(hào)二級(jí)混合池，46號(hào)二級(jí)混合池，47號(hào)二級(jí)混合池，48號(hào)二級(jí)混合池，49號(hào)二級(jí)混合池和50號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為5，n=5, 該混合池命名為5號(hào)三級(jí)混合池；
將51號(hào)二級(jí)混合池，52號(hào)二級(jí)混合池，53號(hào)二級(jí)混合池，54號(hào)二級(jí)混合池，55號(hào)二級(jí)混合池，56號(hào)二級(jí)混合池，57號(hào)二級(jí)混合池，58號(hào)二級(jí)混合池，59號(hào)二級(jí)混合池和60號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為6，n=6, 該混合池命名為6號(hào)三級(jí)混合池；
將61號(hào)二級(jí)混合池，62號(hào)二級(jí)混合池，63號(hào)二級(jí)混合池，64號(hào)二級(jí)混合池，65號(hào)二級(jí)混合池，66號(hào)二級(jí)混合池，67號(hào)二級(jí)混合池，68號(hào)二級(jí)混合池，69號(hào)二級(jí)混合池和70號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為7，n=7, 該混合池命名為7號(hào)三級(jí)混合池；
將71號(hào)二級(jí)混合池，72號(hào)二級(jí)混合池，73號(hào)二級(jí)混合池，74號(hào)二級(jí)混合池，75號(hào)二級(jí)混合池，76號(hào)二級(jí)混合池，77號(hào)二級(jí)混合池，78號(hào)二級(jí)混合池，79號(hào)二級(jí)混合池和80號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為8，n=8, 該混合池命名為8號(hào)三級(jí)混合池；
將81號(hào)二級(jí)混合池，82號(hào)二級(jí)混合池，83號(hào)二級(jí)混合池，84號(hào)二級(jí)混合池，85號(hào)二級(jí)混合池，86號(hào)二級(jí)混合池，87號(hào)二級(jí)混合池，88號(hào)二級(jí)混合池，89號(hào)二級(jí)混合池和90號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為9，n=9, 該混合池命名為9號(hào)三級(jí)混合池；
將91號(hào)二級(jí)混合池，92號(hào)二級(jí)混合池，93號(hào)二級(jí)混合池，94號(hào)二級(jí)混合池，95號(hào)二級(jí)混合池，96號(hào)二級(jí)混合池，97號(hào)二級(jí)混合池，98號(hào)二級(jí)混合池，99號(hào)二級(jí)混合池和100號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為10， n=10，該混合池命名為10號(hào)三級(jí)混合池；
將101號(hào)二級(jí)混合池，102號(hào)二級(jí)混合池，103號(hào)二級(jí)混合池，104號(hào)二級(jí)混合池，105號(hào)二級(jí)混合池，106號(hào)二級(jí)混合池，107號(hào)二級(jí)混合池，108號(hào)二級(jí)混合池，109號(hào)二級(jí)混合池和 110號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為 11，n=ll，該混合池命名為11號(hào)三級(jí)混合池；
將111號(hào)二級(jí)混合池，112號(hào)二級(jí)混合池，113號(hào)二級(jí)混合池，114號(hào)二級(jí)混合池，115號(hào)二級(jí)混合池，116號(hào)二級(jí)混合池，117號(hào)二級(jí)混合池，118號(hào)二級(jí)混合池，119號(hào)二級(jí)混合池和 120號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為 12，n=12，該混合池命名為12號(hào)三級(jí)混合池；
將121號(hào)二級(jí)混合池，122號(hào)二級(jí)混合池，123號(hào)二級(jí)混合池，124號(hào)二級(jí)混合池，125 號(hào)二級(jí)混合池，126號(hào)二級(jí)混合池，127號(hào)二級(jí)混合池，128號(hào)二級(jí)混合池，129號(hào)二級(jí)混合池和130號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為13，n=13，該混合池命名為13號(hào)三級(jí)混合池；
將131號(hào)二級(jí)混合池，132號(hào)二級(jí)混合池，133號(hào)二級(jí)混合池，134號(hào)二級(jí)混合池，135號(hào)二級(jí)混合池，136號(hào)二級(jí)混合池，137號(hào)二級(jí)混合池，138號(hào)二級(jí)混合池，139號(hào)二級(jí)混合池和 140號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為 14，n=14，該混合池命名為14號(hào)三級(jí)混合池；
(2)用常規(guī)的轉(zhuǎn)基因方法分別將各三級(jí)混合池中的混合克隆導(dǎo)入受體植物，獲得滲入
系
1)三級(jí)混合池質(zhì)粒的提取
參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(2005，科學(xué)出版社)的SDS堿裂解法提取各三級(jí)混合池質(zhì)粒，具體提取過(guò)程如下
①吸取300 μ 1 -70°C保存的三級(jí)混合池菌液到30 ml LB液體培養(yǎng)基(50 mg/L km, 5%蔗糖)中，在37°C恒溫?fù)u床，225rpm培養(yǎng)過(guò)夜；
②將培養(yǎng)的單個(gè)三級(jí)混合池菌液倒入6支1.5ml離心管中收集菌體，每管分三次收集菌液，每管共收集1.5X3=4. 5mL菌液；
③向每個(gè)離心管中加入150μ ISolution I，劇烈振蕩；
④向每個(gè)離心管中加入225μ 1 Solution III，溫和顛倒5次，冰上放置15min ；
⑤4°C，12000rpm，15min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中；
⑥(為減少體積，使離心管不溢出)向離心管中加2/3體積的異丙醇，混勻， 放在一20°C，Ih ;4°C，12000rpm, 15 min,收集沉淀；
⑦用300μ 1無(wú)菌水溶解沉淀，再加等體積(300 μ 1 ) LiCl溶液(LiCl使RNA 沉淀)，室溫放置10 min, 10000 rpm ；⑧加等體積酚氯仿(1:1)振蕩混勻，12000 rpm, 10 min ；
⑨取上清，加等體積氯仿(抽提)，4°C，12000rpm, 10 min ；
⑩取上清，加2倍體積的無(wú)水乙醇，一20°C放置Ih；
4°C, 12000 rpm，15min，保留沉淀，移去上清； 加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇1 ml，洗沉淀，4°C，12000 rpm, 12000 rpm
重復(fù)步驟 ；
0待乙醇揮發(fā)完全后，加入IXTE 20μ1，(加1-2 μ 1 RNase)，將6支離心管的DNA合
并在一個(gè)離心管中，一20°C保存；
2)農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備
①挑取農(nóng)桿菌LBA4404單菌落接種于20ml YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，180 rpm,振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；
② 將菌液按1 100轉(zhuǎn)移至200 ml YEB (加抗生素STR和RFP，)培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，28°C，180rpm，振蕩培養(yǎng)至0D600=0. 5—1.0 ；
③在無(wú)菌條件下將菌液轉(zhuǎn)入200ml 20°C預(yù)冷的無(wú)菌離心管中，冰上放置 30min，4°C，5000rpm，離心 lOmin，倒盡上清；
④用100ml冰浴的無(wú)菌雙蒸水重懸，4°C，5000rpm，離心lOmin，倒盡上清；
⑤重復(fù)步驟④2 3次；
⑥用50ml冰浴的10%無(wú)菌甘油懸浮菌體，4°C，5000rpm，離心lOmin，
倒盡上清；
⑦重復(fù)⑥1次，離心，倒掉上清，將離心管倒置，以回流的少量(約2-3ml) 10%甘油重懸菌體，于冰上每支1. 5 ml無(wú)菌離心管分裝200 μ 1，一80°C保存；
3)三級(jí)混合池質(zhì)粒電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞
①取出步驟(2)中2)農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備⑦獲得的農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞試管于冰上凍融，共14支試管，每個(gè)試管按1,2,3,4,5,6, 7,8,9, 10，11，12，13，14 依次編號(hào)，并每個(gè)試管的編號(hào)標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的三級(jí)混合池的標(biāo)記；如1號(hào)試管對(duì)應(yīng)的三級(jí)混合池是1號(hào)三級(jí)混合池，標(biāo)記為1 ；2號(hào)試管對(duì)應(yīng)的三級(jí)混合池是2號(hào)三級(jí)混合池，標(biāo)記為 2，3號(hào)試管對(duì)應(yīng)的三級(jí)混合池是3號(hào)三級(jí)混合池，標(biāo)記為3 ；以此類(lèi)推，14號(hào)試管對(duì)應(yīng)的三級(jí)混合池是14號(hào)三級(jí)混合池，標(biāo)記為14 ；
②分別吸取2μ1步驟(2)中1)三級(jí)混合池質(zhì)粒的提取所提取的三級(jí)混合池質(zhì)粒，分別加入到上述已編號(hào)的試管中，用移液槍槍頭輕輕攪拌均勻，并迅速轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的-20°C預(yù)冷的電擊杯中，電極間距為0. Icm,吸干電擊杯表面的水；將電擊杯放入ΒΙΟ-PULSE電轉(zhuǎn)化儀的電極之間，在1. Skv高壓下電擊；
③取出電擊杯，在每支試管中分別加入ImlYEB培養(yǎng)液，用移液槍混勻，分別吸出每支試管中的菌液分別轉(zhuǎn)入1.5ml無(wú)菌離心管中，28°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)池；④分別將步驟3)中③經(jīng)培養(yǎng)的每支試管中的50 μ 1菌液涂在含有50 mg/L Km的YEB 固體平板上J8°C，倒置培養(yǎng)1. 5 2d，觀察轉(zhuǎn)化子；用沒(méi)有加三級(jí)混合池質(zhì)粒的農(nóng)桿菌 LBA4404感受態(tài)細(xì)胞在同樣條件下電擊，以做陰性對(duì)照；
4)轉(zhuǎn)化子的分子檢測(cè)
將步驟(2)中3)④獲得的轉(zhuǎn)化子取出，用無(wú)菌牙簽在YEB固體培養(yǎng)基上(添加50 mg/L Km，100 mg/L Sm)劃線，每次每個(gè)平板上劃20個(gè)左右的克隆，并標(biāo)上相應(yīng)三級(jí)混合池的編號(hào)，在下暗培養(yǎng)3d;用無(wú)菌勺子輕輕刮取每個(gè)農(nóng)桿菌克隆長(zhǎng)出的菌苔，按相等的量分別接入盛有200 ml YEB液體培養(yǎng)基(添加50 mg/L Km，100 mg/L Sm)的三角瓶(500 ml) 中搖菌，28°C，180r/min避光培養(yǎng)12h(0D600=l. 0左右)，由此制備成轉(zhuǎn)化子的檢測(cè)樣品，并用未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404做陰性對(duì)照；
對(duì)獲得的每個(gè)農(nóng)桿菌克隆以基因引物進(jìn)行PCR法檢測(cè)，所述的新霉素基因 (/7/7 II)特異引物的堿基序列是
5' -TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3‘ 5’ -AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3 ‘
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5ul反應(yīng)液，用1.0%的瓊脂糖電泳分離，電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察結(jié)果并照相，經(jīng)檢測(cè)，7號(hào)三級(jí)混合池有陽(yáng)性克隆，如圖4所示；
對(duì)獲得的每個(gè)農(nóng)桿菌克隆以fecB基因5’端引物和/7辦11基因5’端引物進(jìn)行PCR法檢測(cè)，
nptll基因5’端引物序列 5’ -TGTCTGTTGTGCCCAGTCATAG-3’ ， McB基因5’端引物 5， -TACCTGTTCACTGACTCCC3，，
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5ul反應(yīng)液，用1.0%的瓊脂糖電泳分離，電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察結(jié)果并照相，如圖5所示，表明農(nóng)桿菌克隆中BIBAC2質(zhì)粒攜帶了藥用野生稻基因片段；
上述兩個(gè)的PCR反應(yīng)體系如下①10XPCR Buffer: 2. 5 μ 1②dNTP混合液(2. 5 mmol/L):2y 1, (3) Mgcl2 (25mmol/L) :1. 5 μ 1,④ 10mmol/L 引物(正、反)各 1. 25 μ 1，⑤ Taq 酶(5υ/μ 1) :0. 3uL ⑥ DNA:2y 1，⑦ ddH2o: 15. 2 μ 1，總體積為 25 μ 1。最后在反應(yīng)體系上覆蓋一層液體石蠟油；上述兩個(gè)的PCR反應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序見(jiàn)圖8 ；
5)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克隆的保存
根據(jù)步驟4)轉(zhuǎn)化子的分子檢測(cè)的結(jié)果所得到的陽(yáng)性克隆，分別用無(wú)菌牙簽挑到裝有ImlYEB液體培養(yǎng)基(添加50 mg/L Km, 100 mg/L Sm, 12%甘油)的1. 5ml離心管中(每管挑一個(gè)克隆)，8°C，180r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，離心管上標(biāo)上對(duì)應(yīng)三級(jí)混合池的編號(hào)，待培養(yǎng)到0D600=0. 5左右時(shí)，放到一80°C保存?zhèn)溆茫?br> 6)以日本晴、中花11栽培稻品種為受體植物采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法將步驟(2)中 5)所保存的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克隆分別導(dǎo)入所述的栽培稻獲得滲入系。 實(shí)施例3滲入系中轉(zhuǎn)基因DNA分子鑒定 1、水稻總DNA的提取
分別取兩種滲入系幼嫩葉片0. 2-1. 0g，用CTAB法抽提基因組DNA，所述的滲入系是7號(hào)三級(jí)混合池轉(zhuǎn)化獲得的日本晴抗性苗和花U抗性苗； 2、滲入系的如 基因和基因檢測(cè)
分別用潮霉素基因(如 )引物和新霉素基因(/^ ΙΙ)引物分別對(duì)步驟1提取的滲入系基因組DNA和對(duì)照植株基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)； 所述的潮霉素基因(Mpt)特異引物的堿基序列是 5’ -GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’， 5' -CTTCTACACAGCCATCGGTCCAGA-3‘ 所述的新霉素基因(《/7 ΙΙ)特異引物的堿基序列是 5' -TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3‘ 5’ -AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3 ‘
PCR反應(yīng)體系如下① 10XPCR Buffer: 2. 5 μ 1 ② dNTP 混合液(2. 5 mmol/L):2y 1, ③ Mgclj25mmol/L) :1· 5μ 1，④ 10mmol/L 引物(正、反)各 1· 25 μ 1，⑤ Taq 酶(5U/ μ 1) :0. 3μ 1,⑥D(zhuǎn)NA:2yl，⑦ddH2o: 15. 2 μ 1，總體積為25 μ 1。最后在反應(yīng)體系上覆蓋一層液體石蠟油；
PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序見(jiàn)圖9 ；
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ 1反應(yīng)液，用1. 0 %的瓊脂糖電泳分離，電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察結(jié)果并照相(如圖6、圖7所示)。擴(kuò)增產(chǎn)物分別為85^ρ的如 片段和72^ρ的nptW片段。從圖6，圖7可以看出，用如 ，/7辦11基因引物對(duì)獲得的滲入系進(jìn)行基因組PCR 擴(kuò)增，分別顯示出852bp和722bp大小的目的條帶。片段大小與陽(yáng)性對(duì)照的條帶一致，證明 hpt,nptll基因已整合到日本晴、中花11植株的基因組中。綜合圖5-圖7所示，即可證明已得到了攜帶云南藥用野生稻大片段基因的滲入系材料。實(shí)驗(yàn)涉及的主5試■及培養(yǎng)基的配置
FreeEmffer _存儲(chǔ)存観)！ IL
藥!!名稱(chēng)配方中的量SS方終濃度
TrvptoncIUg1.0%
Yeast Extract5gO 5%
NaCJ10g〗0%
K2HPO46 27g36nM
ICH2PO4丨 SOg]3.2raM
sodium citr ate(X 50 g17 mM
MgSCvTH2OO-ICig0.4mM
(NKikSOi0.90g6 SmM
*上面的藥S充分8 后，定容〗L,倒出44ml,加入44 ml甘油。1211K 20mmM aifiife
細(xì)來(lái)廿《
Tris-HClfl.0M,pH8.0) IL
藥品名稱(chēng) 配方中的量配方終濃度
Tris-base 121.Ig1.0M HCl 42ml 加ddH20至1L,調(diào)節(jié)pH為8.0, 121'C滅菌20mm,室溫保存。 Ti0Ei(pH8.0) IL
藥品名稱(chēng) S己方中的量Sfi方終濃度
Tris-HClCl. OM,PH5.0) IOmlIOmM
EDTA(0.5M,PH5.0) 2mlImM 加ddH20至1L, J.2.fC滅菌20mm,室溫保存。
權(quán)利要求
1.一種快速構(gòu)建水稻滲入系發(fā)掘優(yōu)良基因的方法，包括如下步驟 Cl)構(gòu)建BIBAC基因文庫(kù)混合池①一級(jí)混合池的構(gòu)建待BIBAC基因文庫(kù)的文庫(kù)保存板中的單克隆菌液完全融化后，將每一塊文庫(kù)保存板中每一列中的16個(gè)孔內(nèi)的單克隆菌液合并成一個(gè)一級(jí)混合池，將一級(jí)混合池標(biāo)記為(X)-y， X為文庫(kù)保存板的編號(hào)，X=l，2，3，……自然數(shù)，y為每一塊文庫(kù)保存板中列的編號(hào)，y=l， 2,3,……自然數(shù)，該一級(jí)混合池命名為(X) _y號(hào)一級(jí)混合池；②二級(jí)混合池的構(gòu)建將每一塊文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池，將二級(jí)混合池標(biāo)記為X，X=l，2，3，……自然數(shù)，該二級(jí)混合池命名為X號(hào)二級(jí)混合池；X與文庫(kù)保存板的編號(hào)相同；③三級(jí)混合池的構(gòu)建按二級(jí)混合池編號(hào)順序從1號(hào)二級(jí)混合池開(kāi)始，每10個(gè)二級(jí)混合池合并成為一個(gè)三級(jí)混合池，將三級(jí)混合池記為η，η =1,2,3,……自然數(shù)，該三級(jí)混合池命名為η號(hào)三級(jí)混合池；(2)用常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法分別將各三級(jí)混合池中的混合克隆導(dǎo)入受體植物，獲得滲入系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速構(gòu)建水稻滲入系發(fā)掘優(yōu)良基因的方法，其特征在于步驟(2)中所述的常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法、基因槍、花粉管通道方法中的任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速構(gòu)建水稻滲入系發(fā)掘優(yōu)良基因的方法，其特征在于所述的BIBAC基因文庫(kù)為野生稻BIBAC基因文庫(kù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速構(gòu)建水稻滲入系發(fā)掘優(yōu)良基因的方法，其特征在于所述的野生稻為藥用野生稻。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的一種快速構(gòu)建水稻滲入系發(fā)掘優(yōu)良基因的方法，其特征在于所述的受體植物為栽培稻。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速構(gòu)建水稻滲入系發(fā)掘優(yōu)良基因的方法，該方法包括的一級(jí)混合池的構(gòu)建是將每一塊文庫(kù)保存板中每一列中的16個(gè)孔內(nèi)的單克隆菌液合并成一個(gè)一級(jí)混合池；二級(jí)混合池的構(gòu)建是將每一塊文庫(kù)保存板所對(duì)應(yīng)的一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池；三級(jí)混合池的構(gòu)建是按二級(jí)混合池編號(hào)順序從1號(hào)二級(jí)混合池開(kāi)始，每10個(gè)二級(jí)混合池合并成為一個(gè)三級(jí)混合池；然后用常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法將各三級(jí)混合池中的混合克隆導(dǎo)入受體植物，獲得滲入系。該方法節(jié)省了幾萬(wàn)次轉(zhuǎn)化手續(xù)，大幅度地減輕了科研人員的工作量，達(dá)到了簡(jiǎn)便、快速，可使該滲入系達(dá)到全基因組的插入，還能簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確地查找到供體植物的優(yōu)良基因定位，有利于供體優(yōu)良基因的發(fā)掘利用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102344928SQ20111025687
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者付堅(jiān), 余騰瓊, 劉艷平, 張敦宇, 曾黎瓊, 李娥賢, 李定琴, 李維蛟, 殷富有, 王玲仙, 程在全, 羅紅梅, 鐘巧芳, 黃興奇 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所