專利名稱：Oxhs4基因在控制水稻抗旱性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠通過控制根的生長，提高干旱耐受能力的水稻基因0XHS4在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明采用候選基因篩選方法，克隆到控制水稻抗旱基因0XHS4，通過苗期和成株期干旱脅迫實驗發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)0XHS4基因可以提聞轉(zhuǎn)基因水稻抗干旱的能力，而突變體oxhs4表現(xiàn)出對干旱敏感，證實了該基因的功能及應(yīng)用途徑。
背景技術(shù)：
水稻作為我國乃至世界主要的糧食作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)受到干旱、鹽潰和低溫等非生物逆境嚴(yán)重制約，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、甚至對社會生活有極其重要的影響。發(fā)掘一些與逆境相關(guān)的新基因，深入了解它們的抗逆機(jī)制，對提高水稻的抗逆性，改良水稻品種具有重要的實 際意義。根系是植物直接吸收水分的重要器官，它對植物的耐旱功能具有至關(guān)重要的作用。作物根系的發(fā)展與改善有利于干旱條件下水分的吸收，發(fā)達(dá)的根系有利于增加植株的生存和復(fù)原抗性的能力。因此根系深度及闊度的發(fā)展是作物躲避干旱的主要策略之一?？v深發(fā)達(dá)的根系系統(tǒng)可使植物充分吸收利用貯存在土壤中的水分，使植物度過干旱期。隨著對根結(jié)構(gòu)認(rèn)識的深入，發(fā)現(xiàn)皮層通氣組織(RCA)發(fā)達(dá)程度直接影響著植株的抗旱能力，發(fā)達(dá)的通氣組織在干旱條件下可以使植株減弱代謝消耗，用于增強(qiáng)根的生長來獲取更多的水分(Zhu et al.，2010)。為了更好的了解根系在干旱條件下的生長機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄水平上，對玉米初生根的根冠以及伸長區(qū)的基因在水分充足和脅迫下的的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在遭遇水分脅迫后，不同途徑相關(guān)基因的表達(dá)在空間上存在著很大差異，在根冠中，活性氧和碳代謝類的基因在水分脅迫前后差異最大；在伸長區(qū)，細(xì)胞伸長相關(guān)基因的表達(dá)差異最大(Spollen etal.，2008)，這揭示了相關(guān)基因在植物遭遇水分脅迫后在各自不同的區(qū)域發(fā)揮著重要的功能，這也為我們研究在根中不同區(qū)域特異表達(dá)的基因功能以及根發(fā)育相關(guān)突變體在干旱中的作用指明了方向。隨著QTL的運用，芯片數(shù)據(jù)的開發(fā)和突變體的大量篩選，許多與根的發(fā)育相關(guān)同時又影響植物抗旱性的基因被發(fā)現(xiàn)。擬南芥中，激活基因HDGll表達(dá)的EDTl和超表達(dá)植株HDG11，相比野生型都具有更長的主根和更多的側(cè)根，發(fā)達(dá)的根系顯著地增強(qiáng)了植物的抗旱性(Yu et al.，2008)。水稻中的OsNACIO在根特異表達(dá)啟動子RCc3的驅(qū)動下，相比野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株的根徑增加了 I. 25倍，由此而給正常生長條件下的轉(zhuǎn)基因植株帶來了 5% -14%的增產(chǎn)，根系增強(qiáng)而帶來抗旱性的增加使超表達(dá)植株在干旱條件下增產(chǎn)了 25%-42% (Jeong et al.，2010)。在棉花中超量表達(dá)擬南芥基因AVPl激活了生長素在根中的運輸而刺激了根的迅速生長，增強(qiáng)了根在干旱條件下的吸收水分的能力(Pasapulaet al. ,2010)。在擬南芥中超表達(dá)一個來自木本植物的親環(huán)蛋白(cyclophilin)顯著增強(qiáng)了根在滲透脅迫下的生長(Sekhar et al. ,2010) AtSQE負(fù)責(zé)根中固醇的生物合成，SQEl的缺失導(dǎo)致根的生長出現(xiàn)了缺陷，抗旱性明顯下降(Pose et al.，2009)。擬南芥突變體hrd-D的次生根增多，根皮層增厚，因而增加了植物的水分利用效率而導(dǎo)致的抗旱性增強(qiáng)(Karabaet al. ,2007) 由上可知，根的生長對植物的抗旱能力具有重要的作用。同時，激素對根發(fā)育的調(diào)控不僅僅體現(xiàn)在正常條件下，在逆境條件下這種聯(lián)系更是加強(qiáng)了?？购禉C(jī)制的差別我們可以發(fā)現(xiàn)將這些基因分為兩類，一類是調(diào)控著根系的生長發(fā)育，而其本身并不受干旱脅迫的誘導(dǎo)的基因；另一類是控制著根系的生長同時又受到干旱的誘導(dǎo)的基因，這類基因的改良對提高作物的抗旱性具有更重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的涉及一個XHS蛋白家族成員0XHS4基因在控制水稻抗旱性改良中的應(yīng)用。0XHS4編碼62 8個氨基酸，是一個結(jié)構(gòu)域完整的典型XHS蛋白，包含Zf_XS、XS、Coiled-Coil和XH結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明分離和應(yīng)用一種包含0XHS4基因的cDNA片段，該片段賦予水稻在干旱條件下抗旱性增強(qiáng)的能力。其中，所述的含有0XHS4基因的cDNA序列如序列表SEQ NO: I所示，序列長度為2215bp，其中ORF (編碼區(qū))為1887bp，它對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO :1中63-1949位所示，編碼628個氨基酸。它的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQID NO 2 所示。攜帶有本發(fā)明0XHS4基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接 DNA轉(zhuǎn)化,微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998,Method forPlant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp. 411-463 ；Geiserson andCorey，1998，Plant Molecular Biology (2ndEdition)。可使用包括本發(fā)明的0XHS4基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育抗旱植物品種。本發(fā)明基因是受干旱誘導(dǎo)表達(dá)的，因此可將本發(fā)明的基因與任何感興趣的干旱誘導(dǎo)啟動子結(jié)合后連入合適的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在干旱條件下可誘導(dǎo)表達(dá)基因，提高植物抗旱性。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明分離克隆的包含有0XHS4基因編碼區(qū)的核苷酸序列，它對應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，氨基酸序列為628個。圖I. 0XHS4基因在多種逆境和激素處理下的表達(dá)情況。各處理樣品為干旱(drought)處理 Oh (CK) ,0. 5h, 2h, 4h, 8h ；高鹽(salt)處理 Oh, 0. 25h, 0. 5h, lh, 2h ；低溫(cold)處理 0h，0. 5h，lh，3h，6h ;脫落酸(ABA)處理 0h，0. 5h，2h，4h，8h。圖2. 0XHS4超表達(dá)、突變體以及互補(bǔ)植株的鑒定。A，0XHS4超表達(dá)植株的Northernblot檢測(5和14為鑒定的超表達(dá)家系，WT為野生型對照)；B，突變體oxhs4中T-DNA插入位置確定(M5和M8為鑒定的純合家系)；C，0XHS4表達(dá)量的檢測；D_E，互補(bǔ)植株(CP)的陽性(D)和表達(dá)量(E)檢測(1-17為17株突變體互補(bǔ)植株，WT和oxhs4作為檢測的對照)。圖3. 0XHS4超表達(dá)、突變體以及互補(bǔ)植株在苗期干旱脅迫下的表型鑒定。A-B，轉(zhuǎn)基因植株在脅迫前(A)以及脅迫復(fù)水后(B)的生長狀態(tài)；C，脅迫后的存活率統(tǒng)計；D，脅迫前后的游離脯氨酸測定，CK表示脅迫前的脯氨酸含量；Dr表示脅迫后的脯氨酸含量。標(biāo)準(zhǔn)誤基于三次生物學(xué)重復(fù)。(U5和U14為超表達(dá)家系，M5和M8為突變體純合家系，CP為互補(bǔ)植株陽性家系，HY和ZHll分別為突變體和超表達(dá)的野生型對照)
圖4. 0XHS4超表達(dá)和突變體植株成株期的干旱脅迫以及根長和根體積的測定。A和D為干旱脅迫前的生長狀態(tài)，B、C、E和F為干旱脅迫后的生長狀態(tài)。G-L，正常生長和不同干旱脅迫程度下的根的表型。M-0,正常生長(M)，中等程度干旱脅迫下(N)和嚴(yán)重干旱脅迫下(0)的相對根長和相對根體積的統(tǒng)計。和‘**’分別表示t-測驗的P值小于0. 05和0. 01。(U5和U14為超表達(dá)家系，M5和M8為突變體純合家系，HY和ZHll分別為突變體和超表達(dá)的野生型對照)圖5. 0XHS4超表達(dá)以及突變體植株在成株期中度程度干旱脅迫下的相對產(chǎn)量(A)和相對結(jié)實率(B)的統(tǒng)計。‘**’表示t-測驗的P值小于0. 01。(0X表示超表達(dá)家系，oxhs4表示突變體純合家系，HY和ZHll分別為突變體和超表達(dá)的野生型對照)
具體實施方式
以下實施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在克隆包含有0XHS4基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，分離0XHS4的T-DNA插入突變體，以及驗證0XHS4基因功能的方法。根據(jù)以下的描述的全部或部分實施步驟，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。實施例II、檢測水稻內(nèi)源0XHS4基因受逆境誘導(dǎo)水平為初步判斷0XHS4基因是否與抗逆相關(guān)，本發(fā)明首先檢測了水稻內(nèi)源基因0XHS4是否受逆境誘導(dǎo)。選用秈稻品種明恢63(0ryza sativa L. ssp. Indica,來自福建省農(nóng)科院)作為表達(dá)譜分析的材料。種子催芽后，在正常生長條件下至四葉期時進(jìn)行各種逆境和激素的處理。干旱處理是將幼苗直接從暴露于空氣中失水，在0h、0.5h、2h、6h取樣。高鹽脅迫是將幼苗移入含有200mmol/L NaCl的水培液中，在Omin、15min、30min、lh、2h取樣。低溫脅迫是把幼苗放入4°C冷處理，在0h、0. 5h、lh、6h取樣。激素處理是分別用100 u mol/L脫落酸(ABA)均勻的噴灑植株表面后，按時間點取樣。所有的處理和取樣過程都是在持續(xù)光照的條件下進(jìn)行的。水稻總RNA的提取采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)提取，提取方法按照上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉(zhuǎn)錄酶SSIII (購自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(方法根據(jù)Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書)，反應(yīng)條件為650C 5min,50°C 120min,70°C IOmin0以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物(0XHS4-1F 5’-TGACGAGGTCTACAAGGCCGT-3’和 0XHS4-1R : 5 ’-ACACCACGTAGCTGCCGCT-3 ’)對 0XHS4 基因進(jìn)行特異的 PCR 擴(kuò)增。同時用引物(AF : 5 ’ -TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3 ’和 AR : 5 ’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)對水稻Actin基因(登錄號X16280)做特異擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長76bp)，以作為內(nèi)對照進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，40個循環(huán)。反應(yīng)過程中進(jìn)行熒光檢測實時定量分析。結(jié)果表明(圖1)，0XHS4基因(SEQ NO I)在干旱脅迫后誘導(dǎo)上升表達(dá)，在其它處理中表達(dá)變化不明顯。2、0XHS4基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化為了能確認(rèn)0XHS4基因的抗逆功能，申請人首先將其在水稻中超量表達(dá)，期望從轉(zhuǎn)基因植株的表型來研究該基因的功能。超量表達(dá)載體構(gòu)建方法如下首先通過查找在水稻基因組注釋網(wǎng)站RGAP(http://rice, plantbiology. msu. edu/) 0XHS4 基因注釋號L0C_0s02gl9130,與 KOME (http://cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/) 0XHS4注釋號AK242745 (該基因的完整核苷酸序列見SEQ IDN0:1所示，序列全長為2215bp。該基因的編碼區(qū)的核苷酸序列長度為1887bp，其對應(yīng)的氨基酸序列為628個)。以該編碼區(qū)序列為參考設(shè)計引物。以秈稻品種明恢63幼穗cDNA為模板 ，用引物0XHS40XF (5，-AGGAGGCGCTTCAGGTCT-3，，序列特異弓I物外加接頭KpnI位點)和0XHS40XR(5’ -GCATAATCTTCCAGTITCAG-3’，序列特異引物外加接頭BamHI位點)，擴(kuò)增出包含0XHS4基因完整編碼區(qū)的cDNA片斷，本擴(kuò)增產(chǎn)物就是本發(fā)明的序列42-2063bp。反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性 5min ；94V 40sec,50°C 40sec,72°C 2min，32 個循環(huán)；72°C 延伸5min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的全長基因。選取陽性克隆質(zhì)粒用KpnI+BamHI酶切，回收外源片段；同時，用同樣的方法酶切攜帶Ubiquitin啟動子的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301U(pCAMBIA1301U是在國際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體PCAMBIA1301基礎(chǔ)上改建的，攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米u(yù)biquitin啟動子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體)，酶切完畢，用氯仿異戊醇(體積比為24 I)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含0XHS4基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA1301U載體做連接反應(yīng)，其后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlO ^ (該大腸桿菌DHlO ^菌株購自Promega公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得的重組質(zhì)粒載體被命名為0XHS4-0X-pl301U(載體上的0XHS4基因序列就是SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，序列長度為2215bp，其中第63-1949位為編碼區(qū)(序列長度為1887bp)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法(其具體步驟如下所述)將上述超表達(dá)載體0XHS4-0X-pl301U轉(zhuǎn)入到水稻品種“中花11”(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(中花11)遺傳轉(zhuǎn)化方法(體系)在Hiei等人報道的方法(Hiei等，Efficienttransformation of rice, Oryza sativa L. , mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J,6 :271-282,1994)基礎(chǔ)上改良進(jìn)行。本實施例的具體遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下(I)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6_芐基腺嘌呤)；CN();KT(Kinetin，激動素);NAA(萘乙酸);IAA(吲哚乙酸):2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)HN(潮霉素)；二甲基亞砜(DMSO) ;N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(IOX)]的配制
硝酸鉀(KNO3)28.3 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0 g
硫酸銨((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸鎂(MgSO4 .7H20)1.85 g
氯化鈣(CaCl2CH2O)1.66 g
逐一溶解,然后室溫下定容至1000ml。2) N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制
碘化鉀(KI)0.08 g
硼酸(H3BO3)0.16 g
硫酸錳(MnS04.4H20)0.44 g
硫酸鋅(ZnS04.7H20)0.15 g室溫下溶解并定容至1000ml。 3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小時，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制
煙酸(Nicotinic acid)0.1 g
維生素BI (Thiamine HCl)0.1 g
維生素B6 (Pyridoxine HCl)0.1 g
甘氨酸(Glycine)0.2 g
肌醇(Inositol)IOg加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制 硝酸銨(NH4NO3)16.5 g
硝酸鉀19.0 g
磷酸二氫鉀1.7 g
硫酸鎂3.7 g
氯化鈣4.4 g室溫下溶解并定容至1000ml。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制
碘化鉀0.083 g
硼酸0.62 g
硫酸猛0.86 g
鑰酸鈉(Na2MoOJH2O)0.025 g
硫酸銅(CuS04.5H20)0.0025 g室溫下溶解并定容至1000ml。7)2,4-D|C存液(lmg/ml)的配制秤取2，4-D IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml,于室溫下保存。8)6-BA|C存液(lmg/ml)的配制秤取6-BA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(lmg/ml)的配制秤取NAA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IAA)貯存液(lmg/ml)的配制秤取IAA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶 解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)湓谝粋€大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵 (FeSO4 7H20) 2. 78g。在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水用。11)葡萄糖貯存液(0. 5g/ml)的配制秤取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS貯存液的配制秤取AS 0. 392g, DMSO 10ml,分裝至I. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?3) IN氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5. 6g，并用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方I)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
2,4-D 貯存液2_5 ml
脯氨酸(Proline)0.3 g
CH0.6 g
鹿糖(Sucrose)30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)IOml Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
2.4-D貯存液2.0 ml 脯氨酸0.5 g CH0.6 g 蔗糖30 g Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2.4-D貯存液0.75 ml CH0.15 g 蔗糖5g 瓊脂粉(Agarose)1.75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2.4-D貯存液0.75 ml CH0.2 g 蔗糖5g
瓊脂粉1.75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)5 ml
N6mix 母液(100X)0.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)0.5 ml
維生素貯存液(100X)I ml
2,4-D 貯存液0.2 ml
CH0.08 g
蔗糖2g 加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個IOOml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入Iml葡萄糖貯存液和100 u I AS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2,4-D IC存液0.625 ml
CH0.15 g
蔗糖7.5 g
瓊脂粉1.75 g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 ylHN和400ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
6-BA貯存液0.5 ml
KT貯存液0.5 ml
NAA JC存液50
IAA貯存液50 |il
CH0.15 g
蔗糖7.5 g
瓊脂粉1.75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 u IHN和200ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/ M )。
8)分化培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
6-BA貯存液2 ml
KT貯存液2 ml
NAA貯存液0.2 ml
IAA貯存液0.2 ml
CHI g
鹿糖30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. O。煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基
MSmax 母液(IOX)50 ml
MSmix 母液(100X)5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)5 ml
維生素貯存液(100X)5 ml
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟4. I愈傷誘導(dǎo)(I)將成熟的水稻種子去殼，依次用70%的乙醇處理I分鐘，0. 15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；(2)用滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1°C。4. 2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度 25±1°C。4. 3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1°C。
4. 4農(nóng)桿菌培養(yǎng)(I)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室林擁軍教授贈送)兩天，培養(yǎng)溫度28°C ；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時。4. 5農(nóng)桿菌侵染(I)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6J). 8-1. 0 ；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，溫度19-20。。。4. 6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(I)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次潮霉素篩選濃度為400ppm,第二次以后為250ppm)4. 7 分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26°C。4. 8 生根(I)剪掉分化時產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。4. 9 移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入大田生長至收種。3、0XHS4超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻干旱脅迫實驗本發(fā)明采用Northern雜交方法對上述第2步獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株中0XHS4基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。提取葉片的總RNA(Trizc)I試劑，購自Invitrogen公司)后按《分子克隆》(科學(xué)出版社，1999)有關(guān)實驗操作方法進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)膜，并以0XHS4為探針進(jìn)行Northern雜交。表達(dá)量檢測結(jié)果顯示(圖2A)，絕大部分轉(zhuǎn)基因植株中0XHS4基因的表達(dá)量相對于野生型(中花11)顯著提高。為了驗證這一推測，申請人對0XHS4的超表達(dá)植株進(jìn)行了苗期的干旱脅迫。將2個超表達(dá)家系(U5和U14)以及所對應(yīng)的野生型植株中花11在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽(超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系種子在含有50mg/L的潮霉素的培養(yǎng)基發(fā)芽，排除轉(zhuǎn)基因陰性植株)，將發(fā)芽一周的植株移栽到裝有等量砂土的小紅桶中，每桶種植轉(zhuǎn)基因植株和野生型(中花11號)水稻各20株，生長到三、四葉期時(圖3A)對每個小紅桶中的植株進(jìn)行斷水處理。斷水至葉片全卷，葉尖開始發(fā)白時給植株復(fù)水，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因家系及其對應(yīng)野生型植株的存活率。從圖3B可以看到，復(fù)水7天后野生型植株中花11幾乎都枯死而超量表達(dá)家系(本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植株)部分植株仍然活著。進(jìn)一步對存活率統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(圖3C)，野生型中花11只有不到20%的存活率，而轉(zhuǎn)基因超表達(dá)家系的存活率則在50%左右，顯著(t-測驗P值小于、0.05)高于同桶種植的野生型對照。植物在受外界逆境脅迫時體內(nèi)脯氨酸的含量會顯著上升，脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗逆性強(qiáng)的植物往往會積累更多的脯氨酸，因此 測定脯氨酸的含量可以作為反映植物抗逆性的重要生理指標(biāo)。脯氨酸含量的測定與干旱脅迫結(jié)果是吻合的，在脅迫前，所有植株體內(nèi)的脯氨酸含量是一致的，干旱脅迫后，超表達(dá)植株體內(nèi)的脯氨酸含量的增幅要顯著(t-測驗P值小于0.05)高過野生型植株(圖3E)。干旱脅迫實驗結(jié)果都說明0XHS4超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在苗期比野生型對照有更強(qiáng)的抗旱性。在PVC管中對0XHS4的超表達(dá)家系(U5和U14)進(jìn)行了不同程度的成株期干旱脅迫。將超表達(dá)植株移植到PVC管中，同時每根PVC管中種入對應(yīng)的野生型植株(中花11號)做對照，每個家系種4棵，重復(fù)3次。由于在水稻成株期幼穗分化至花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期即幼穗約5-lOcm時對環(huán)境條件反應(yīng)最為敏感，是決定穎花能否健全發(fā)育及谷粒容積大小的關(guān)鍵時期，缺水會導(dǎo)致穎花大量退化，出穗延遲、結(jié)實率下降。考慮到斷水到植株感受到缺水需要一段時間，所以我們一般在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂前期開始斷水15-20天(具體根據(jù)天氣情況而定，雨天有可移動遮雨棚覆蓋)，再復(fù)水生長。在正常生長條件下超表達(dá)植株的各項農(nóng)藝性狀和野生型中花11沒有明顯的差別，PVC管中的生長情況也是一樣的(圖4A)。但是在嚴(yán)重干旱脅迫復(fù)水后申請人發(fā)現(xiàn)對照中花11號即“ZH11”都已經(jīng)枯黃，而超表達(dá)植株仍然保持綠色，維持繼續(xù)生長的活力(圖4B和C)。對0XHS4超表達(dá)植株在正常條件和中度干旱脅迫下的單株產(chǎn)量和結(jié)實率進(jìn)行統(tǒng)計(嚴(yán)重干旱脅迫下植株難于結(jié)實，所以沒有考察產(chǎn)量和結(jié)實率)。由于環(huán)境影響，我們選擇相對產(chǎn)量(脅迫植株的單株產(chǎn)量/正常生長下的植株單株產(chǎn)量)和相對結(jié)實率(脅迫植株的結(jié)實率/正常生長下的結(jié)實率)作為比較指標(biāo)。結(jié)果顯示，超表達(dá)植株的相對產(chǎn)量(圖5A)和相對結(jié)實率(圖5B)都顯著高于野生型ZH11。以上結(jié)果表明，超表達(dá)0XHS4能提高水稻的耐旱能力。除了對地上部分的各項農(nóng)藝性狀的考察外，還對根進(jìn)行了根長和根體積兩項指標(biāo)的考察。0XHS4的啟動子在滲透脅迫下根中的表達(dá)是顯著增強(qiáng)的，因此進(jìn)一步探討0XHS4的抗旱機(jī)制是否與根的生長有聯(lián)系是非常重要的。結(jié)果如圖4G-L所示，在正常生長條件下，超表達(dá)植株的根的生長要好過野生型ZHll (圖4H);而這些差異隨著干旱脅迫程度的加重后就變得越來越明顯，特別是在嚴(yán)重脅迫下(圖4L)。對正常生長(圖4M)，中等程度(圖4N)和嚴(yán)重干旱脅迫(圖40)下的相對根長和相對根體積的統(tǒng)計也證實了上述表型(相對水平是指轉(zhuǎn)基因植株在根長和體積上與同一 PVC管中野生型的比值，對應(yīng)的比值在圖4M-0中的柱狀圖上已標(biāo)注)。在根的生長過程中，根尖的伸長主要是依賴于伸長區(qū)細(xì)胞的延伸，使得根尖不斷向土壤深處推進(jìn)，能夠獲取更多的水分和營養(yǎng)以度過干旱時期。結(jié)果表明，0XHS4可能通過控制根的生長來介導(dǎo)水稻的抗旱性。4、分離基因0XHS4突變體為了進(jìn)一步驗證0XHS4在干旱中的功能，申請人對0XHS4突變體進(jìn)行了干旱脅迫實驗。從水稻突變體庫 Rice T-DNA Insertion Sequence Database (RISD)中挑取 0XHS4基因位點相應(yīng)的T-DNA插入突變體1C_03064(本發(fā)明的起始材料即突變體1C-03064，檢索地址http://signal, salk. edu/cgi-bin/RiceGE，韓國 P0STECH 植物功能基因組實驗室(Plant Functional Genomics Laboratory)。產(chǎn)生這個突變體株系的載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化方法可參照相關(guān)文獻(xiàn)(Jeong 等 Generation ofa flanking sequence-tag databasefor activation-tagging lines injaponica rice. Plant J. 2006,45 :123-32.),限于篇幅本說明書不再展開描述。其中在上述網(wǎng)站突變體庫中所登錄的0XHS4T-DNA突變體1C-03064的側(cè)翼序列(該序列長度為560bp)如下ATCAACTCACCTGGTACCTGGTACCTCGGATCCGTGACCTCAAGCTCTGGGAANCCAGGTGGATGAGTCGTAGGCAATGAAAAGTTCANATGCCCATTC TGTCATGGGTGAAGTAAGAATGCAGGACTACCGTTNCAACNAGCTACTTCANCATGCCATTGGGGTATGGCGCATCCAATCGCTCTCCAAAGGTGAAGGCANACCANNTGGNCTTGGCCANTCTTCTCMGAACNACTATGCTGATGCANCAGGCTCATTGCCATCACGACAGGCCATTGGACCAAGTAATCCTCCAAGGCCATTGCAAGATCAGGAAGCGTATGTTTGGCCATGGATGGGCATCCTTGCAAATGTTCCAGCTGAGAAAACAAAGGAGGATGGANCTAGTCTGATGCANCAGCTANCTAATTTCAATCCCTTGCAGTTTACTGCTG CGCTCTGCTCCCAGGTAGGTATACTGGTTATGCAGTTGTCCGTTTCNCANANATNGGATTGGGTTCACGAACNCCTTG剛NTTNCANAACTNCTTNAAATCNNACGTCTGGNNANAAAGATTGCC (注N 表示測序不確定的核苷酸)。根據(jù)T-DNA插入位點，在插入位點兩側(cè)設(shè)計引物(A :5’ -TGAACACACATCAGTGAGTT-3’ 和 B :5’ -CACCAAATACTTGCTCTTAG-3’ )及載體邊界引物(T 5’ -TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC-3’ )，通過PCR檢測其插入位點的正確性，結(jié)果顯示插入位點位于ATG下游IOObp處(見圖2B)，分離出兩個純合家系M5和M8。RT-PCR檢測了純合突變體植株的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0XHS4被完全抑制住(見圖2C)，所用引物為(0XHS4RTF 5’-CCGTGTCTGGTCTGGAAAA-3’和 0XHS4RTR :5' -TCTTGAGTCCGATGGTGCT-3')，同時以 Actin作為內(nèi)對照進(jìn)行定量分析。5、突變體干旱脅迫表型的鑒定將已鑒定好基因型的突變體oxhs4純合家系M5和M8以及野生型Hwayoung (購自韓國P0STECH植物功能基因組實驗室)催芽后直播到小圓桶中。試驗用的土壤為中國南方水稻土與粗沙按體積比為2 3混合而成，每圓桶等量均勻沙土加等體積水，水自行滲漏確保土壤的緊實度一致，試驗設(shè)3次重復(fù)。對健康生長的4葉期的植株進(jìn)行斷水干旱脅迫6-10天(具體根據(jù)天氣情況而定)，然后復(fù)水恢復(fù)5-7天。與野生型對照相比，T-DNA純合植株表現(xiàn)為干旱敏感表型(圖3B)。復(fù)水后，純合家系存活率低于30%，而野生型家系仍有60%以上的存活率(圖3C)。干旱脅迫后，純合突變體植株體內(nèi)的脯氨酸含量的增幅要顯著(t-測驗P值小于0.05)小于野生型植株(圖3E)。為了鑒定這些表型是否真是由于0XHS4的缺失造成的，還是由于其他插入位點或是功能獲得性導(dǎo)致的，申請人通過超表達(dá)0XHS4轉(zhuǎn)入oxhs4純合愈傷組織中檢測上述表型能否得到恢復(fù)來驗證上述的推測。將0XHS4的全長連接到PCAMBIA1301U上，轉(zhuǎn)入到oxhs4純合種子誘導(dǎo)的愈傷組織中，共得到轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株(CP) 17棵。利用本施例步驟4的引物A、B和T進(jìn)行陽性檢測發(fā)現(xiàn)這17棵TO代轉(zhuǎn)基因植株全是陽性的(圖2D)，表明0XHS4的全長序列是已經(jīng)轉(zhuǎn)入oxsh4純合植株中。通過Real-Time PCR檢測了 0XHS4在1-17互補(bǔ)植株幼穗中的表達(dá)量，以野生型Hwayoung (簡稱HY)和純合突變體 oxhs4 為對照，所用引物(0XHS4QF :5’-GTGACCCAGITGGTAGGTnTTG-3’和0XHS4QR :5’ -TTGCGAGACAGGTCATTTTCC-3J )。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0XHS4在互補(bǔ)植株的表達(dá)量都明顯高于在HY和oxhs4中的表達(dá)(圖2E)，表明外源片段0XHS4全長的轉(zhuǎn)入在突變體oxhs4中是表達(dá)的。苗期干旱脅迫實驗顯示互補(bǔ)植株相比突變體oxhs4表現(xiàn)出耐旱表型(圖3B)，存活率顯著增強(qiáng)(圖3D)。這些結(jié)果表明0XHS4的缺失會造成水稻的耐旱性減弱。同時申請人也在PVC管中對突變體oxhs4進(jìn)行了成株期的干旱脅迫實驗，實驗方法同實施例的第3部分所述。在中度干旱脅迫過程中，純合突變體植株葉片已完全卷曲，而野生型植株HY葉片仍然展開著，表現(xiàn)出較oxhs4好的生長態(tài)勢(圖4E);嚴(yán)重干旱脅迫復(fù)水后，如圖4F所示，野生型HY恢復(fù)迅速，生長良好；而0處84已經(jīng)枯死(圖4F)。根長和根體積的測定結(jié)果顯示，在正常生長條件下，突變體根的生長要比野生型HY差一些(圖4G); 而這些差異隨著干旱脅迫程度的加重后就變得越來越明顯，特別是在嚴(yán)重脅迫下(圖41和K)。對正常生長(圖4M)，中等程度(圖4N)和嚴(yán)重干旱脅迫(圖40)下的相對根長和相對根體積的統(tǒng)計也證實了上述表型。在中度干旱脅迫下，突變體oxhs4的相對產(chǎn)量(圖5A)和相對結(jié)實率(圖5B)都顯著低于野生型HY。由此可見，0XHS4的缺失導(dǎo)致了根的生長減慢，在缺水的環(huán)境下變得更為明顯，造成水稻的耐旱能力減弱。
權(quán)利要求
1.水稻0XHS4基因在控制水稻根系生長的抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第63-1949位所示。
2.水稻0XHS4基因在控制水稻根系生長的抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于該基因的編碼的氣基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所不。全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠通過控制根的生長，提高干旱耐受能力的水稻基因OXHS4在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明采用候選基因篩選方法，克隆到控制水稻抗旱基因OXHS4，通過苗期和成株期干旱脅迫實驗發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)OXHS4基因可以提高轉(zhuǎn)基因水稻抗干旱的能力，而突變體oxhs4表現(xiàn)出對干旱敏感，證實了該基因的功能及應(yīng)用途徑。
文檔編號A01H5/00GK102732528SQ20111009403
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者熊立仲, 覃永華 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)