專利名稱：一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法
技術領域：
本發(fā)明涉及菌株的創(chuàng)制方法，特別是涉及一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法。
背景技術：
金針菇以其菌蓋滑嫩、柄脆、營養(yǎng)豐富、味美適口而著稱于世。據測定，金針菇氨基酸的含量非常豐富，高于一般菇類，金針菇干品中含蛋白質8. 87%，碳水化合物60. 2%，粗纖維達7. 4%，經常食用可防治潰瘍病，金針菇既是一種美味食品，又是較好的保健食品，國內外市場日益廣闊，金針菇通過人工栽培技術進行栽培，能獲得穩(wěn)定可靠的產量。金針菇的種類較多，不同金針菇的口感、菌體色質以及栽培周期均不相同，常見的有黃色金針菇和白色金針菇兩大類，黃色金針菇幼菇菌蓋淡黃至黃褐色，菌柄上部色淡，為淺黃色，下部色深，為金黃至暗褐色，出菇早，栽培周期短，但如管理方法不當，易造成菌柄基部顏色加深，為褐色。白色金針菇尤以其鮮嫩柔軟，色澤極佳而鮮銷海外，其子實體中等大、菌柄白色、粗壯、基部往往有絨毛、粘連度高、可食率較低，而且白色金針菇栽培周期較長。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的即在于提供一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，將黃色金針菇中早熟、菌柄基部無絨毛的性狀轉入白色金針菇菌種中，創(chuàng)制出子實體為白色、早熟、菌柄基部無絨毛的菌株，并適宜多種栽培技術模式生產。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現的一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，包括以下步驟
(1)單核體分離與鑒定，操作方法如下
a、孢子收集，取出黃色金針菇菌株“金絲”的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置12 M小時，直至無菌紙上出現孢子印為止。b、孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至50 100個/毫升，取1毫升孢子液涂布培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)基為酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在20 下培養(yǎng)4 6天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在20 下培養(yǎng)。C、單核體鑒定取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400 倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株。(2)雜交配對，操作方法如下
a、將黃色金針菇菌株的單核體菌株30 50個分別接種在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上，同時接種白色金針菇菌株F092的雙核體菌株，在20 下培養(yǎng)到菌絲體生長相互接觸為止。b、雜交種鑒定，在黃色金針菇菌株單核體一側取直徑為0. 3 0. 5cm大的菌種塊， 接種在試管裝斜面酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在20 下培養(yǎng)，待菌絲生長1 3cm長時，取菌絲體放在玻璃片上用水展開，蓋上蓋玻片，在顯微鏡400倍下觀察，將有鎖狀聯合標記的菌種初步確定為雜交種，再進行拮抗鑒定，拮抗鑒定方法為將初步確定的雜交種接種在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上，中部接種雜交菌種，兩側接種親本菌株，相距2 3cm，在20 下培養(yǎng)至菌絲生長接觸后，再在自然光照培養(yǎng)7 10天，凡是與兩親本菌株之間出現溝狀、或隆起、或隔離現象的確定為雜交種。(3)雜交種篩選方法，操作方法如下
a、雜交種栽培，首先制作雜交種培養(yǎng)基，其配方重量百分比為棉籽殼75 85%，麩皮 15 25%，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1 :1. 1 1 :1. 2，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用塑料薄膜或者瓶蓋封口，在高壓滅菌鍋內0. 14兆帕下滅菌處理3 4小時，冷卻至30°C以下時，將雜交種接種在瓶內，在20 25°C下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在10 18°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到3 4cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到18 20cm時采收。b、將雜交種農藝性狀與親本菌株進行比較，篩選具有雙親菌株共有性狀的雜交菌株，即雜交種子實體菌蓋為黃白色，介于黃色與白色之間，菌蓋形狀為半球形，與白色金針菇菌株相似，菌柄白色、粗壯，基部無絨毛，不粘連。(4)雜交種自交
a、雜交菌株單核體分離與鑒定
取雜交菌株的孢子，進行單孢分離培養(yǎng)獲得單核體菌株，單核體分離與鑒定方法同步驟(1)，獲得50 100個單核體菌株。b、構建自交菌株
在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上配對，采取兩兩配對方法進行配對，在同一平板培養(yǎng)上接種2個單核體菌株，相距1 2cm，在20 下培養(yǎng)，待菌絲生長接觸后，取接觸部位的菌絲體轉接于斜面酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，當菌絲生長距離達到1 3cm時，取菌絲進行鑒定，在顯微鏡下觀察有無鎖狀聯合，將有鎖狀聯合的菌種，確定為雙核體菌株，得到自交代菌株。C、出菇篩選，出菇篩選方法步驟(3)，以黃色金針菇菌株和白色金針菇菌株為對照，定向篩選生長周期與黃色金針菇一致，子實體為白色，菌柄基部無絨毛，不粘連的菌種。d、自交菌株性狀固定
將篩選出的自交菌株，取菌蓋組織進行組織分離獲得遺傳穩(wěn)定的菌株F212-1。所述的酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的配方為酵母粉3 5克，葡萄糖18 20克，瓊脂18 20克，水1000毫升。所述的菌株F212-1的菇體為白色，菌蓋半球形，直徑0.47 cm 0. 92cm ；菌柄直徑0.20 cm 0.37cm，長度15 cm 18 cm，菌柄基部無絨毛，不粘連。本發(fā)明所述的一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，以黃色金針菇菌株“金絲”和白色金針菇菌株F092為親本，通過雙單雜交方法，創(chuàng)制出一種白色金針菇菌株F212-1，其方法包括以下步驟單核體分離與鑒定、雜交配對、雜交種篩選、雜交種自交菌株構建，本發(fā)明創(chuàng)制出的白色金針菇菌株具有以下特性子實體為白色，早熟、菌柄基部無絨毛，既保持了黃色金針菇早熟和菌柄基部無絨毛的性狀，又保持了白色金針菇子實體為白色的性狀，縮短了栽培時間，并且適宜多種栽培技術模式生產。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明進一步的描述，本發(fā)明的保護范圍不限于實施例。實施例1，一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，包括以下步驟 (1)單核體分離與鑒定，操作方法如下
a、孢子收集，取出黃色金針菇菌株“金絲”的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置20小時，直至無菌紙上出現孢子印為止。b、孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至80個/毫升，取1毫升孢子液涂布培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)基為酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在25°C下培養(yǎng)5天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在25°C下培養(yǎng)。C、單核體鑒定，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400 倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株。(2)雜交配對，操作方法如下
a、雜交配對。將黃色金針菇菌株的單核體菌株40個分別接種在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上，同時接種白色金針菇菌株F092的雙核體菌株，在下培養(yǎng)到菌絲體生長相互接觸為止。b、雜交種鑒定，在黃色金針菇菌株單核體一側取直徑為0. 4cm大的菌種塊，接種在試管裝斜面酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在25°C下培養(yǎng)，待菌絲生長2. 5cm長時，取菌絲體放在玻璃片上用水展開，蓋上蓋玻片，在顯微鏡400倍下觀察，將有鎖狀聯合標記的菌種初步確定為雜交種，再進行拮抗鑒定，拮抗鑒定方法為將初步確定的雜交種接種在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上，中部接種雜交菌種，兩側接種親本菌株，相距3cm，在下培養(yǎng)至菌絲生長接觸后，再在自然光照培養(yǎng)8天，凡是與兩親本菌株之間出現溝狀、或隆起、或隔離現象的菌種確定為雜交種。(3)雜交種篩選方法，操作方法如下
a、雜交種栽培篩選方法。首先制作雜交種培養(yǎng)基，其配方重量百分比為棉籽殼80%， 麩皮20%，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1:1.1，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用塑料薄膜封口，在高壓滅菌鍋內 0. 14兆帕下滅菌處理3小時，冷卻至22°C時，將雜交種接種在瓶內，在25°C下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在15°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到3cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到19cm時采收。b、將雜交種農藝性狀與親本菌株進行比較，篩選具有雙親菌株共有性狀的雜交菌株，即雜交種子實體菌蓋為黃白色，顏色介于黃色與白色之間，菌蓋形狀為半球形，與白色金針菇菌株F092相似，菌柄白色、粗壯，基部無絨毛，不粘連。(4)自交種構建方法
a、雜交菌株單核體分離與鑒定
取雜交菌株的孢子，進行單孢分離培養(yǎng)獲得單核體菌株，其操作方法如下首先進行孢子收集，取出上一步驟得到的雜交種菌株的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置20 小時，直至無菌紙上出現孢子印；其次進行孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至80個/毫升，取1毫升孢子液涂布平板酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在25°C下培養(yǎng)5天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在25V下培養(yǎng)；最后進行單核體鑒定，待白色菌落生長菌絲至生長接觸后，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株，獲得80個單核體菌株。b、構建自交菌株
在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上配對，采取兩兩配對方法進行配對，在同一平板培養(yǎng)上接種2個單核體菌株，相距1. 5cm,在下培養(yǎng)，待菌絲生長接觸后，取接觸部位的菌絲體轉接于斜面酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，當菌絲生長距離達到3cm時，取菌絲進行鑒定，在顯微鏡下觀察有無鎖狀聯合，將有鎖狀聯合的菌種，確定為雙核體菌株，得到自交代菌株。C、出菇篩選，首先制作培養(yǎng)基，其配方重量比為棉籽殼80%，麩皮20%，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為 1:1.1，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用瓶蓋封口，在高壓滅菌鍋內0. 14兆帕下滅菌處理3小時，冷卻至22°C時，將上一步驟得到的自交菌株接種在瓶內，在25°C下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在15°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到3cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到19cm時采收，最后進行自交菌株篩選，以黃色金針菇菌株和白色金針菇菌株為對照， 定向篩選生長周期與黃色金針菇一致，子實體為白色，菌柄基部無絨毛，不粘連的菌種。d、自交菌株性狀固定
將篩選出的F2代菌株，取菌蓋組織進行組織分離獲得遺傳穩(wěn)定的菌株F212-1。所述的酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基的配方為酵母粉5克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水 1000毫升。所述的菌株F212-1的菇體為白色，菌蓋半球形，直徑0. 92cm，菌柄直徑0. 37cm，長度18 cm，菌柄基部無絨毛，不粘連。實施例2，一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，包括以下步驟 (1)單核體分離與鑒定，其操作方法如下
a、孢子收集，取出黃色金針菇菌株“金絲”的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置M小時，直至無菌紙上出現孢子印。b、孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至100個/毫升，取1毫升孢子液涂布培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)基為酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)4天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在下培養(yǎng)。C、單核體鑒定，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400 倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株。(2)雜交配對，操作方法如下
a、將黃色金針菇菌株的單核體菌株50個分別接種在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上，同時接種白色金針菇菌株F092的雙核體菌株，在下培養(yǎng)到菌絲體生長相互接觸為止。
b、雜交種鑒定，在黃色金針菇菌株單核體一側取直徑為0. 5cm大的菌種塊，接種在試管裝斜面酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在下培養(yǎng)，待菌絲生長2cm長時，取菌絲體放在玻璃片上用水展開，蓋上蓋玻片，在顯微鏡400倍下觀察，將有鎖狀聯合標記的菌種初步確定為雜交種，再進行拮抗鑒定，拮抗鑒定方法為將初步確定的雜交種接種在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上，中部接種雜交菌種，兩側接種親本菌株，相距3cm，在下培養(yǎng)至菌絲生長接觸后，再在自然光照培養(yǎng)7天，凡是與兩親本菌株之間出現溝狀、或隆起、或隔離現象的確定為雜交種。(3)雜交種篩選方法，操作方法如下
a、雜交種栽培，首先制作雜交種培養(yǎng)基，其配方重量百分比為棉籽殼85%，麩皮 15%，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1:1.2，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用塑料薄膜封口，在高壓滅菌鍋內0. 14 兆帕下滅菌處理4小時，冷卻至時，將雜交種接種在瓶內，在25°C下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在18°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到4cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到 20cm時采收。b、將雜交種農藝性狀與親本菌株進行比較，篩選具有雙親菌株共有性狀的雜交菌株，即雜交種子實體菌蓋為黃白色，介于黃色與白色之間，菌蓋形狀為半球形，與白色金針菇菌株相似，菌柄白色、粗壯，基部無絨毛，不粘連。(4)雜交種自交
a、雜交菌株單核體分離與鑒定
取雜交菌株的孢子，進行單孢分離培養(yǎng)獲得單核體菌株，其操作方法如下首先進行孢子收集，取出上一步驟得到的雜交種菌株的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置M 小時，直至無菌紙上出現孢子??；其次進行孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至100個/毫升，取1毫升孢子液涂布平板酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在下培養(yǎng)4天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在下培養(yǎng)；最后進行單核體鑒定，待白色菌落生長菌絲至生長接觸后，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株，獲得100個單核體菌株。b、構建自交菌株
在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上配對，采取兩兩配對方法進行配對，在同一平板培養(yǎng)上接種2個單核體菌株，相距2cm，在下培養(yǎng)，待菌絲生長接觸后，取接觸部位的菌絲體轉接于斜面酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，當菌絲生長距離達到3cm時，取菌絲進行鑒定，在顯微鏡下觀察有無鎖狀聯合，將有鎖狀聯合的菌種，確定為雙核體菌株，得到自交代菌株。C、出菇篩選，首先制作培養(yǎng)基，其配方重量比為棉籽殼85%，麩皮15%，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1.1 1，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用塑料薄膜封口，在高壓滅菌鍋內0. 14兆帕下滅菌處理4小時，冷卻至時，將上一步驟得到的自交代菌株接種在瓶內，在25°C下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在18°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到4cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到20cm時采收，最后進行自交代菌株篩選，以黃色金針菇菌株和白色金針菇菌株為對照，定向篩選生長周期與黃色金針菇一致，子實體為白色，菌柄基部無絨毛，不粘連的菌種。d、自交菌株性狀固定
將篩選出的自交菌株，取菌蓋組織進行分離獲得遺傳穩(wěn)定的菌株F212-1。所述的酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的配方為酵母粉5克，葡萄糖20克，瓊脂20克， 水1000毫升。所述的菌株F212-1的菇體為白色，菌蓋半球形，直徑0. 9cm ；菌柄直徑0. 3cm，長度 17 cm，菌柄基部無絨毛，不粘連。實施例3，一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，包括以下步驟 (1)單核體分離與鑒定，其操作方法如下
a、孢子收集，取出黃色金針菇菌株“金絲”的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置12小時，直至無菌紙上出現孢子印。b、孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至50個/毫升，取1毫升孢子液涂布培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)基為酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在20°C下培養(yǎng)6天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在20°C下培養(yǎng)。C、單核體鑒定，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400 倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株。(2)雜交配對，操作方法如下
a、將黃色金針菇菌株的單核體菌株30個分別接種在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上，同時接種白色金針菇菌株F092的雙核體菌株，在20°C下培養(yǎng)到菌絲體生長相互接觸為止。b、雜交種鑒定，在黃色金針菇菌株單核體一側取直徑為0. 3cm大的菌種塊，接種在試管裝斜面酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在20°C下培養(yǎng)，待菌絲生長Icm長時，取菌絲體放在玻璃片上用水展開，蓋上蓋玻片，在顯微鏡400倍下觀察，將有鎖狀聯合標記的菌種初步確定為雜交種，再進行拮抗鑒定，拮抗鑒定方法為將初步確定的雜交種接種在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，中部接種雜交菌種，兩側接種親本菌株，相距2cm，在20°C下培養(yǎng)至菌絲生長接觸后，再在自然光照培養(yǎng)10天，凡是與兩親本菌株之間出現溝狀、或隆起、或隔離現象的確定為雜交種。(3)雜交種篩選方法，操作方法如下
a、、雜交種栽培篩選方法，首先制作雜交種培養(yǎng)基，其配方重量百分比為棉籽殼 75 %，麩皮25 %，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1:1.2，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用瓶蓋封口，在高壓滅菌鍋內0. 14兆帕下滅菌處理3小時，冷卻至20°C時，將雜交種接種在瓶內，在20°C下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在10°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到3cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到18cm時采收。b、將雜交種農藝性狀與親本菌株進行比較，篩選具有雙親菌株共有性狀的雜交菌株，即雜交種子實體菌蓋為黃白色，介于黃色與白色之間，菌蓋形狀為半球形，與白色金針菇菌株F092相似，菌柄白色、粗壯，基部無絨毛，不粘連。
(4)自交種構建方法
a、雜交菌株單核體分離與鑒定
取雜交菌株的孢子，進行單孢分離培養(yǎng)獲得單核體菌株，其操作方法如下首先進行孢子收集，取出上一步驟得到的雜交種菌株的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置12 小時，直至無菌紙上出現孢子??；其次進行孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至50個/毫升，取1毫升孢子液涂布平板酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在20°C下培養(yǎng)6天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在20°C下培養(yǎng)；最后進行單核體鑒定，待白色菌落生長菌絲至生長接觸后，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株，獲得50個單核體菌株。b、構建自交菌株
在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上配對，采取兩兩配對方法進行配對，在同一平板培養(yǎng)上接種2個單核體菌株，相距l(xiāng)cm，在20°C下培養(yǎng)，待菌絲生長接觸后，取接觸部位的菌絲體轉接于斜面酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，當菌絲生長距離達到Icm時，取菌絲進行鑒定， 在顯微鏡下觀察有無鎖狀聯合，將有鎖狀聯合的菌種，確定為雙核體菌株，得到自交代菌株；
c、出菇篩選，首先制作培養(yǎng)基，其配方重量比為棉籽殼80 %，麩皮20 %，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1 :1. 2，再將培養(yǎng)基裝入750毫升塑料瓶內，用瓶蓋封口，在高壓滅菌鍋內0. 14兆帕下滅菌處理3小時，冷卻至20°C以下時，將上一步驟得到的自交代菌株接種在瓶內，在20°C下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在10°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到3cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到18cm時采收，最后進行自交代菌株篩選，以黃色金針菇菌株和白色金針菇菌株為對照， 定向篩選生長周期與黃色金針菇一致，子實體為白色，菌柄基部無絨毛，不粘連的菌種。d、自交菌株性狀固定
將篩選出的自交代菌株，取菌蓋組織進行組織分離獲得遺傳穩(wěn)定的菌株F212-1。所述的酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的配方為酵母粉3克，葡萄糖18克，瓊脂18克， 水1000毫升。所述的菌株F212-1的菇體為白色，菌蓋半球形，直徑0.47 cm ；菌柄直徑0. 20 cm, 長度15 cm，菌柄基部無絨毛，不粘連。實施例4，一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，包括以下步驟 (1)單核體分離與鑒定，其操作方法如下
a、孢子收集，取出黃色金針菇菌株的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置18 小時，直至無菌紙上出現孢子印。b、孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至70個/毫升，取1毫升孢子液涂布培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)基為酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基，在22°C下培養(yǎng)4天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在22 °C下培養(yǎng)。C、單核體鑒定，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株。(2)雜交配對，操作方法如下
a、將黃色金針菇菌株的單核體菌株50個分別接種在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上，同時接種白色金針菇菌株F092的雙核體菌株，在下培養(yǎng)到菌絲體生長相互接觸為止。b、雜交種鑒定，在黃色金針菇菌株單核體一側取直徑為0. 4cm大的菌種塊，接種在試管裝斜面酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在22°C下培養(yǎng)，待菌絲生長3cm長時，取菌絲體放在玻璃片上用水展開，蓋上蓋玻片，在顯微鏡400倍下觀察，將有鎖狀聯合標記的菌種初步確定為雜交種，再進行拮抗鑒定，拮抗鑒定方法為將初步確定的雜交種接種在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上，中部接種雜交菌種，兩側接種親本菌株，相距2cm，在下培養(yǎng)至菌絲生長接觸后，再在自然光照培養(yǎng)8天，凡是與兩親本菌株之間出現溝狀、或隆起、或隔離現象的確定為雜交種。(3)雜交種篩選方法，操作方法如下
a、雜交種栽培，首先制作雜交種培養(yǎng)基，其配方重量百分比為棉籽殼82%，麩皮 18%，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1:1.2，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用塑料薄膜封口，在高壓滅菌鍋內0. 14 兆帕下滅菌處理4小時，冷卻至22°C以下時，將雜交種接種在瓶內，在22°C下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在15°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到3. 5cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到18cm時采收。b、將雜交種農藝性狀與親本菌株進行比較，篩選具有雙親菌株共有性狀的雜交菌株，即雜交種子實體菌蓋為黃白色，介于黃色與白色之間，菌蓋形狀為半球形，與白色金針菇菌株F092相似，菌柄白色、粗壯，基部無絨毛，不粘連。(4)自交種構建方法
a、雜交菌株單核體分離與鑒定
取雜交菌株的孢子，進行單孢分離培養(yǎng)獲得單核體菌株，其操作方法如下首先進行孢子收集，取出上一步驟得到的雜交種菌株的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置18 小時，直至無菌紙上出現孢子印；其次進行孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至70個/毫升，取1毫升孢子液涂布平板酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在22°C下培養(yǎng)4天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在22°C下培養(yǎng)；最后進行單核體鑒定，待白色菌落生長菌絲至生長接觸后，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，覆蓋蓋玻璃片，在400倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株，獲得60個單核體菌株。b、構建自交代菌株
在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基平板上配對，采取兩兩配對方法進行配對，在同一平板培養(yǎng)上接種2個單核體菌株，相距2cm，在22°C下培養(yǎng)，待菌絲生長接觸后，取接觸部位的菌絲體轉接于斜面酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，當菌絲生長距離達到1. 5cm時，取菌絲進行鑒定，在顯微鏡下觀察有無鎖狀聯合，將有鎖狀聯合的菌種，確定為雙核體菌株，得到自交代菌株。C、出菇篩選，首先制作培養(yǎng)基，其配方重量比為棉籽殼82%，麩皮18%，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1.1 1. 2，再將培養(yǎng)基裝入850毫升塑料瓶內，用塑料薄膜封口，在高壓滅菌鍋內0. 14兆帕下滅菌處理4小時，冷卻至22°C時，將上一步驟得到的自交代菌株接種在瓶內，在22°C下培養(yǎng)， 待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在15°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到3. 5cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到18cm時采收，最后進行自交代菌株篩選，以黃色金針菇菌株和白色金針菇菌株為對照，定向篩選生長周期與黃色金針菇一致，子實體為白色，菌柄基部無絨毛，不粘連的菌種。d、自交代菌種性狀固定，
將篩選出的自交菌株，取菌蓋組織進行分離獲得遺傳穩(wěn)定的菌株F212-1。所述的酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基的配方為酵母粉5克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水 1000毫升。所述的菌株F212-1的菇體為白色，菌蓋半球形，直徑0. 6cm.，菌柄直徑0. 32cm，長度17 cm，菌柄基部無絨毛，不粘連。實施例5，一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，包括以下步驟 (1)單核體分離與鑒定，其操作方法如下
a、孢子收集，取出黃色金針菇菌株“金絲”的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置20小時，直至無菌紙上出現孢子印。b、孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至90個/毫升，取1毫升孢子液涂布培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)基為酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在26°C下培養(yǎng)5天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在26 °C下培養(yǎng)。C、單核體鑒定，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400 倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株。(2)雜交配對，操作方法如下
a、雜交配對。將黃色金針菇菌株的單核體菌株40個分別接種在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，同時接種白色金針菇菌株F092的雙核體菌株，在^TC下培養(yǎng)到菌絲體生長相互接觸為止。b、雜交種鑒定，在黃色金針菇菌株單核體一側取直徑為0. 3cm大的菌種塊，接種在試管裝斜面酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在^TC下培養(yǎng)，待菌絲生長3cm長時，取菌絲體放在玻璃片上用水展開，蓋上蓋玻片，在顯微鏡400倍下觀察，將有鎖狀聯合標記的菌種初步確定為雜交種，再進行拮抗鑒定，拮抗鑒定方法為將初步確定的雜交種接種在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，中部接種雜交菌種，兩側接種親本菌株，相距3cm，在^TC下培養(yǎng)至菌絲生長接觸后，再在自然光照培養(yǎng)7天，凡是與兩親本菌株之間出現溝狀、或隆起、或隔離現象的確定為雜交種。(3)雜交種篩選方法，操作方法如下
a、雜交種栽培，首先制作雜交種培養(yǎng)基，其配方重量百分比為棉籽殼78%，麩皮 22%，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1 :1. 1，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用瓶蓋封口，在高壓滅菌鍋內0. 14兆帕下滅菌處理3小時，冷卻至時，將雜交種接種在瓶內，在下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在17°c，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到4cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到20cm 時采收。b、將雜交種農藝性狀與親本菌株進行比較，篩選具有雙親菌株共有性狀的雜交菌株，即雜交種子實體菌蓋為黃白色，介于黃色與白色之間，菌蓋形狀為半球形，與白色金針菇菌株相似，菌柄白色、粗壯，基部無絨毛，不粘連。(4)自交種構建方法
a、雜交菌株單核體分離與鑒定
取雜交菌株的孢子，進行單孢分離培養(yǎng)獲得單核體菌株，其操作方法如下首先進行孢子收集，取出上一步驟得到的雜交種菌株的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置20 小時，直至無菌紙上出現孢子??；其次進行孢子萌發(fā)培養(yǎng)，取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至90個/毫升，取1毫升孢子液涂布平板酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在26°C下培養(yǎng)5天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基上，在^TC下培養(yǎng)；最后進行單核體鑒定，待白色菌落生長菌絲至生長接觸后，取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，覆蓋蓋玻璃片，在400倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株，獲得80個單核體菌株。b、構建自交代菌株
在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上配對，采取兩兩配對方法進行配對，在同一平板培養(yǎng)上接種2個單核體菌株，相距2cm，在^TC下培養(yǎng)，待菌絲生長接觸后，取接觸部位的菌絲體轉接于斜面酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，當菌絲生長距離達到3cm時，取菌絲進行鑒定， 在顯微鏡下觀察有無鎖狀聯合，將有鎖狀聯合的菌種，確定為雙核體菌株，得到自交代菌株。C、出菇篩選，首先制作培養(yǎng)基，其配方重量比為棉籽殼78%，麩皮22%，將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1 1.1，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用塑料薄膜封口，在高壓滅菌鍋內0. 14兆帕下滅菌處理3小時，冷卻至^rc時，將上一步驟得到的自交代菌株接種在瓶內，在^rc下培養(yǎng)， 待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在147°c，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到4cm時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到20cm時采收，最后進行自交代菌株篩選，以黃色金針菇菌株和白色金針菇菌株為對照，定向篩選生長周期與黃色金針菇一致，子實體為白色，菌柄基部無絨毛，不粘連的菌種。d、自交代菌種性狀固定，
將篩選出的自交菌株，取菌蓋組織進行分離獲得遺傳穩(wěn)定的菌株F212-1。所述的酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基的配方為酵母粉5克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水 1000毫升。所述的菌株F212-1的菇體為白色，菌蓋半球形，直徑0. 85cm ；菌柄直徑0. 3cm,長度16 cm，菌柄基部無絨毛，不粘連。
權利要求
1. 一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，其特征在于所述的早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法包括以下步驟(1)單核體分離與鑒定，操作方法如下a、孢子收集取出黃色金針菇菌株“金絲”的成熟子實體菌蓋，將其放置在無菌紙上，放置12 M小時，直至無菌紙上出現孢子印為止；b、孢子萌發(fā)培養(yǎng)取下無菌紙上的孢子印放入無菌水中，制作成孢子液，再用無菌水稀釋孢子液至50 100個/毫升，取1毫升孢子液涂布培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)基為酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在20 下培養(yǎng)4 6天，直至孢子萌發(fā)成白色菌落，取單個白色菌落轉接在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在20 下培養(yǎng)；c、單核體鑒定取菌絲體放在玻璃片上，用水展開菌絲體，蓋上蓋玻璃片，在400倍顯微鏡下觀察，將無鎖狀聯合的菌種，確定為單核體菌株；(2)雜交配對，操作方法如下a、雜交配對將黃色金針菇菌株的單核體菌株30 50個分別接種在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，同時接種白色金針菇菌株F092的雙核體菌株，在20 觀°C下培養(yǎng)到菌絲體生長相互接觸為止；b、雜交種鑒定在黃色金針菇菌株單核體一側取直徑為0.3 0. 5cm大的菌種塊，接種在試管裝斜面酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在20 下培養(yǎng)，待菌絲生長1 3cm長時， 取菌絲體放在玻璃片上用水展開，蓋上蓋玻片，在顯微鏡400倍下觀察，將有鎖狀聯合標記的菌種初步確定為雜交種；再進行拮抗鑒定，拮抗鑒定方法為將初步確定的雜交種接種在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，中部接種雜交菌種，兩側接種親本菌株，相距2 3cm， 在20 下培養(yǎng)至菌絲生長接觸后，再在自然光照培養(yǎng)7 10天，凡是與兩親本菌株之間出現溝狀、或隆起、或隔離現象的確定為雜交種；(3)雜交種篩選方法，操作方法如下a、雜交種栽培篩選方法首先制作栽培培養(yǎng)基，其配方以重量百分比為棉籽殼75 85%，麩皮15 25% ；將棉籽殼和麩皮按比例混合后，加入水攪拌均勻，加水量為棉籽殼麩皮混合物與水的比例為1 :1. 1 1 :1. 2，再將培養(yǎng)基裝入1100毫升塑料瓶內，用塑料薄膜或者瓶蓋封口，在高壓滅菌鍋內0. 14兆帕下滅菌處理3 4小時，冷卻至30°C以下時，將雜交種接種在瓶內，在20 25°C下培養(yǎng)，待菌絲生長滿瓶后，將菌種瓶移到菇房內，溫度控制在10 18°C，待子實體形成后，揭取塑料薄膜進行出菇，當子實體生長高度達到3 4cm 時，在子實體上套上塑料筒培育子實體，當子實體高度達到18 20cm時采收；b、將雜交種農藝性狀與親本菌株進行比較篩選具有雙親菌株共有性狀的雜交菌株， 即雜交種子實體菌蓋為黃白色，顏色介于黃色與白色之間，菌蓋形狀為半球形，與白色金針菇菌株相似，菌柄白色、粗壯，基部無絨毛，不粘連；(4)自交種構建方法a、雜交菌株單核體分離與鑒定取雜交菌株的孢子，進行單孢分離培養(yǎng)獲得單核體菌株，單核體分離與鑒定方法同步驟(1)，獲得50 100個單核體菌株；b、構建自交菌株在酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上配對，采取兩兩配對方法進行配對，在同一平板培養(yǎng)上接種2個單核體菌株，相距1 2cm，在20 下培養(yǎng)，待菌絲生長接觸后，取接觸部位的菌絲體轉接于斜面酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，當菌絲生長距離達到1 3cm時，取菌絲進行鑒定，在顯微鏡下觀察有無鎖狀聯合，將有鎖狀聯合的菌種，確定為雙核體菌株， 得到自交代菌株；c、出菇篩選方法出菇篩選方法步驟(3)，以黃色金針菇菌株和白色金針菇菌株為對照，定向篩選生長周期與黃色金針菇一致，子實體為白色，菌柄基部無絨毛，不粘連的菌種；d、自交菌株性狀固定將篩選出的自交菌株，取菌蓋組織進行分離獲得遺傳穩(wěn)定的菌株F212-1。
2.根據權利要求1所述的一種早熟白色金針菇菌株的制作方法，其特征在于所述的菌株F212-1的菇體為白色，菌蓋半球形，直徑0. 47 cm 0. 92cm,菌柄直徑0. 20 cm 0.37cm，長度15 cm 18 cm，菌柄基部無絨毛，不粘連。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種早熟白色金針菇菌株的創(chuàng)制方法，以黃色金針菇菌株“金絲”和白色金針菇菌株F092為親本，通過雙單雜交方法，創(chuàng)制出一種白色金針菇菌株F212-1，其方法包括以下步驟單核體分離與鑒定、雜交配對、雜交種篩選、雜交種自交菌株構建，本發(fā)明創(chuàng)制出的白色金針菇菌株具有以下特性子實體為白色，早熟、菌柄基部無絨毛，既保持了黃色金針菇早熟和菌柄基部無絨毛的性狀，又保持了白色金針菇子實體為白色的性狀，縮短了栽培時間，并且適宜多種栽培技術模式生產。
文檔編號A01G1/04GK102177810SQ20101060729
公開日2011年9月14日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權日2010年12月27日
發(fā)明者王波, 甘炳成, 黃忠乾 申請人:四川省農業(yè)科學院土壤肥料研究所