專利名稱：一串紅植株的再生方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農業(yè)領域，特別涉及一串紅通過愈傷組織獲得再生植株的方法。
背景技術：
一串紅(Salvia splendens Ker-Gawl)屬于唇形科(Labiatae)，鼠尾草屬(Salvia L)多年生草本植物，原產南美洲熱帶地區(qū)，現在中國各地普遍栽培，常作一年生栽培。一 串紅以其生長周期短、植株矮壯、適應性強、花色艷麗等特點，被廣泛用來布置城市廣場、花 壇、花境、道路、庭院等，而且其花萼、花冠的紅艷色澤為其他花草所不及，宜與淺色花卉配 合布置，是中國節(jié)日里裝點環(huán)境、烘托節(jié)日喜慶氣氛的最為常用的紅色草花(李鳳蘭等，東 北農業(yè)大學學報,2008，39 (8) :131-135)。當前生產上一串紅顏色比較單一，只有紅色系、白色系和紫色系，而且我國一串紅 主要應用在“五一”至“十一”期間，這期間我國南方的大部分省份溫度遠超過一串紅的生長 適溫，由于受種質資源和其它條件的限制，目前我國還沒有抗高溫的專用一串紅品種，因此 如果要提高一串紅的園林利用價值，就必須培育出新的花色和抗逆性好的一串紅品種。利 用遺傳改良培育觀賞植物新品種是減輕環(huán)境脅迫條件對花卉觀賞品質不利影響的有效措 施，也是改變觀賞植物花色、提高觀賞品質的一條捷徑。目前常用的植物轉基因方法較成熟 的還是通過農桿菌介導，但通過農桿菌介導，植物必須建立起通過愈傷組織途徑獲得再生 植株的再生體系。因此，建立穩(wěn)定的一串紅組織培養(yǎng)再生體系則是開展一串紅遺傳轉化的 基礎，目前，通過莖段、葉片、根尖等外植體誘導愈傷組織及其分化這一途徑獲得再生植株 的機率相當低，只是偶然性，有時甚至得不到分化苗(楊曉紅等，2007，12，農業(yè)科技通迅)， 因此難以滿足外源基因的遺傳轉化要求。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種一串紅通過愈傷組織途徑獲得再生植株的 方法，采用該方法能獲得大量的一串紅再生植株，今后可用于一串紅外源基因的遺傳轉化。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種一串紅植株的再生方法，依次包括以下 步驟1)、一串紅種子消毒2)、無菌培養(yǎng)將消毒后的一串紅種子接種在MS固體基本培養(yǎng)基上進行無菌培養(yǎng)22 ^h，培養(yǎng) 條件25士 1°C，暗培養(yǎng)；3)、愈傷組織的誘導將無菌培養(yǎng)后所得的種子縱切成兩半，然后去掉種皮后切面朝下接種于誘導愈傷 培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 20天，培養(yǎng)條件25 士 1°C，暗培養(yǎng)；4)、愈傷組織繼代1 2次將步驟幻所得誘導后產物(包括愈傷組織和長大的子葉等)接種在另一份新的誘導愈傷培養(yǎng)基上繼代1 2次，每次15 20天(直至子葉邊緣有較多愈傷組織出現為 止)，培養(yǎng)條件25 士 1°C，弱光培養(yǎng)，光照強度為50 IOOmol m_2 · s—1 ；得繼代后愈傷組織；5)、愈傷組織的分化選取步驟4)所得的生長良好的繼代后愈傷組織(即選取較為膨松、且質地較硬無 玻璃化的繼代后愈傷組織)轉接到分化培養(yǎng)基上進行不定芽的分化，直至長出3 5cm的 不定芽；培養(yǎng)條件25士 1°C，需光培養(yǎng)，光照強度為200 300mol m_2 · s"1 ；6)、再生苗的生根培養(yǎng)割取步驟幻所得的不定芽作為小苗轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；直至小 苗上長出至少3條且長度> 2cm的不定根；得到可出瓶移栽的種苗；培養(yǎng)條件25士 1°C，需 光培養(yǎng)，光照強度200-300mol m_2 · s—1 ；上述步驟1) 步驟6)均在無菌環(huán)境中進行。作為本發(fā)明的一串紅植株的再生方法的改進MS固體基本培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+瓊脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L ；pH值為 5. 7 5. 9 ；誘導愈傷培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+瓊脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+6_BA 0. 8 1. 2mg/L+2，4-D 1. 8 2. 2mg/L+水解酪蛋白 0. 4 0. 6g/L+脯氨酸 0. 4 0. 6g/L, PH值為5. 7 5. 9; 分化培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+瓊脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+TDZ 1. 8 2. 2mg/L+KT 0. 8 1. 2mg/L+ 水解酪蛋白 0. 4 0. 6g/L+ 脯氨酸 0. 4 0. 6g/L，pH 值為 5. 7 5. 9 ；生根培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基+瓊脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+NAA 0. 4 0. 6mg/L, pH值為5. 7 5. 9作為本發(fā)明的一串紅植株的再生方法的改進步驟1)的消毒 為在無菌操作臺上，選取一串紅優(yōu)質種子放置于帶有過濾網的球狀殼體內，先用質量濃度 75%酒精消毒lmin，然后用無菌蒸溜水洗3次，再用質量濃度0. 1% HgCl2溶液消毒8min， 最后用無菌蒸溜水沖洗3次。在本發(fā)明中6-BA 6-芐氨基腺嘌呤，6_Benzylaminopurine ；2，4-D :2，4_ 二氣苯氧乙酸，2，4-dichlorophenoxyacetic acid ；TDZ 噻苯隆，thidiazuron ；KT :6-HMSBln^,6-Furfurylamino purine ；；NAA :1-萘乙酸。本發(fā)明采用成熟的一串紅種子為外植體，通過誘導種子成熟胚產生愈傷組織并分 化形成不定芽可以獲得大量一串紅再生植株；本發(fā)明較好地解決了一串紅通過愈傷組織難 以獲得再生植株的技術難題。本發(fā)明的一串紅植株的再生方法，能為通過轉基因技術來進 行一串紅育種提供技術支持。采用本發(fā)明的方法，步驟5)的愈傷組織分化所需培養(yǎng)時間約為20 25天，步驟 6)的再生苗生根培養(yǎng)所需培養(yǎng)時間約為10 20天；因此一般僅需60 80天即可得到可 出瓶種植的種苗。本發(fā)明通過種子誘導愈傷組織及其分化這一途徑獲得再生植株的機率為70%以上，遠遠高于現有技術的偶然性。本發(fā)明的一串紅植株的再生方法，是一種不受季節(jié)等因素影響，能高效、快速提供 大量一串紅再生苗的方法，該方法可為今后大規(guī)模工廠化生產一串紅種苗和通過轉基因等 生物技術手段進行一串紅品種改良提供技術支持。


下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1為本發(fā)明的步驟1中所用的消毒滅菌用裝置。
具體實施例方式實施例1、一串紅植株的再生方法，依次進行以下步驟注以下步驟中所用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基(配制完成后)、蒸餾水以及一串紅種子的 消毒滅菌用裝置等要在使用前進行滅菌，滅菌條件在1. 1個大氣壓、121°c條件下滅菌20 分鐘。1)、一串種子的消毒在超凈工作臺上，選取一串紅品種優(yōu)質種子100 150粒放置于如圖1所示的消 毒滅菌用裝置內，該消毒滅菌用裝置由2個半球狀的殼體1組合而成，半球狀的殼體1上設 有過濾網2。該消毒滅菌用裝置可通過市購方式獲得。先用質量濃度75%酒精消毒Imin后用無菌蒸餾水洗3次，再用質量濃度0. 1% HgCl2溶液消毒8min，消毒完后再用無菌蒸溜水沖洗3次。由于一串紅種子在水中浸泡后會迅速在表面形成較粘的凝膠物質，這些凝膠物質 嚴重影響一串紅種子的滅菌效果，因此選用上述裝置可以使一串紅種子消毒充分且易于沖 冼。2)、無菌培養(yǎng)將消毒后的一串紅種子于MS固體基本培養(yǎng)基上進行無菌培養(yǎng)Mh，培養(yǎng)條件: 25 士 1°C，暗培養(yǎng)；MS固體基本培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH值為5. 8 ；其制 備方法如下在IL MS基本培養(yǎng)基內加入瓊脂7g和蔗糖30g，利用lmol/L的KOH或lmol/ L的HCl調節(jié)pH為5.8。3)、愈傷組織的誘導將步驟2)無菌培養(yǎng)后所得的種子縱切成兩半，去掉種皮后切面朝下接種于誘導 愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng)18天；培養(yǎng)條件25士 1°C，暗培養(yǎng)；得誘導后產物(包括愈傷組織和長 大的子葉等)；誘導愈傷培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+6_BA lmg/L+2, 4-D 2mg/L+水解酪蛋白0. 5g/L+脯氨酸0. 5g/L，pH值為5. 8 ；其制備方法如下在IL的 1/2MS基本培養(yǎng)基(即大量元素減半，其他物質同MS基本培養(yǎng)基)內加入瓊脂7g、蔗糖30g、 6-BA lmg、2，4-D 2mg、水解酪蛋白 0. 5g和脯氨酸0. 5g，利用 lmol/L 的KOH或 lmol/L 的HCl 調節(jié)PH為5. 8。4)、愈傷組織繼代1次-2次
將步驟幻所得的誘導后產物(包括愈傷組織和長大的子葉等)在新的誘導愈傷 培養(yǎng)基上繼代2次，每次15天，此時子葉邊緣有較多愈傷組織出現，培養(yǎng)條件25士 1°C，弱 光培養(yǎng)(光照強度50 IOOmol πΓ2·^)；得繼代后愈傷組織；該誘導愈傷培養(yǎng)基同步驟3) 中所用的誘導愈傷培養(yǎng)基。5)、愈傷組織的分化選取步驟4)所得的生長良好的繼代后愈傷組織(即選取較為膨松、且質地較硬無 玻璃化的繼代后愈傷組織)轉接到分化培養(yǎng)基上進行不定芽的分化，直至長出3 5cm的 不定芽(一般約為20 25天)；培養(yǎng)條件25士 1°C，光照強度200D 300mol πΓ2 · s—1 ；
分化培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+TDZ 2mg/L+KT lmg/ L+0. 5g/L水解酪蛋白+脯氨酸0. 5g/L，pH值為5. 8 ；其制備方法如下在IL的1/2MS基本 培養(yǎng)基內加入瓊脂7g、蔗糖30g、TDZ 2mg、KT lmg、水解酪蛋白0. 5g和脯氨酸0. 5g，利用 lmol/L 的 KOH 或 lmol/L 的 HCl 調節(jié) pH 為 5. 8。6)、再生苗的生根培養(yǎng)將步驟幻所得的不定芽作為小苗轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；直至小苗 上長出至少3條且長度> 2cm的不定根(一般需要15天左右)；得可出瓶種植的種苗。培 養(yǎng)條件:25士 1°C，需光培養(yǎng)(光照強度200 300mol m_2 · s-1)。生根培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 5mg/L, pH值為 5. 8 ；其制備方法如下在IL的1/2MS基本培養(yǎng)基內加入瓊脂7g、蔗糖30g和NAA 0. 5mg，利 用 lmol/L 的 KOH 或 lmol/L 的 HCl 調節(jié) pH 為 5. 8。上述步驟1) 步驟6)均在無菌環(huán)境中進行，整個過程一般需60 80天。通過種子誘導愈傷組織及其分化這一途徑獲得再生植株(即可出瓶種植的種苗) 的機率為70%以上。實施例2、再生植株的馴化與移栽將實施例1所得的再生植株(即可出瓶種植的種苗)連同培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)室內取出 放在溫室內進行煉苗，此時不打開瓶蓋，1周后敞開瓶口，并加入少量水(加水的量一般控 制在培養(yǎng)基上有一層水即可)煉苗2 3天后進行移栽，溫室內的環(huán)境為25士2°C，自然光 照。在溫室內對一串紅再生苗進行移栽，移栽時洗去根部的培養(yǎng)基，將苗移栽到營養(yǎng) 缽中(土質為營養(yǎng)土和珍珠巖重量比例為8 1)。待小苗長到5cm以上高度時，帶基質移 栽至6X IOcm的塑料花盆中，并放于單體棚中，單體棚的環(huán)境為自然光照，溫度25-30°C。 移栽后要適當遮蔭并定時澆水，成活率可達75%以上。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容 直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一串紅植株的再生方法，其特征是依次包括以下步驟1)、一串紅種子消毒2)、無菌培養(yǎng)將消毒后的一串紅種子接種在MS固體基本培養(yǎng)基上進行無菌培養(yǎng)22 培養(yǎng)條 件25士 1°C，暗培養(yǎng)；3)、愈傷組織的誘導將無菌培養(yǎng)后所得的種子縱切成兩半，然后去掉種皮后切面朝下接種于誘導愈傷培養(yǎng) 基上培養(yǎng)15 20天，培養(yǎng)條件25 士 1°C，暗培養(yǎng)；4)、愈傷組織繼代1 2次將步驟幻所得誘導后產物接種在誘導愈傷培養(yǎng)基上繼代1 2次，每次15 20天， 培養(yǎng)條件25士 1°C，弱光培養(yǎng)，光照強度為50-100mol m_2 · s—1 ；得繼代后愈傷組織；5)、愈傷組織的分化選取步驟4)所得的生長良好的繼代后愈傷組織轉接到分化培養(yǎng)基上進行不定芽的分 化，直至長出3 5cm的不定芽；培養(yǎng)條件25 士 1°C，需光培養(yǎng)，光照強度為200 300mol m_2 · s—1 ；6)、再生苗的生根培養(yǎng)割取步驟幻所得的不定芽作為小苗轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；直至小苗上 長出至少3條且長度> 2cm的不定根；得到可出瓶移栽的種苗；培養(yǎng)條件25士 1°C，需光培 養(yǎng)，光照強度200 300mol m_2 · s-1 ；上述步驟1) 步驟6)均在無菌環(huán)境中進行。
2.根據權利要求1所述的一串紅植株的再生方法，其特征是所述MS固體基本培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+瓊脂6 8g/L+蔗糖觀 32g/L ；pH值 為 5. 7 5. 9 ；所述誘導愈傷培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+瓊脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+6_BA 0. 8 1. 2mg/L+2，4-D 1. 8 2. 2mg/L+ 水解酪蛋白 0. 4 0. 6g/L+ 脯氨酸 0. 4 0. 6g/L, PH值為5. 7 5.9 ；所述分化培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+瓊脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+TDZ 1. 8 2. 2mg/L+KT 0. 8 1. 2mg/L+ 水解酪蛋白 0. 4 0. 6g/L+ 脯氨酸 0. 4 0. 6g/L，pH 值為 5. 7 5. 9 ；所述生根培養(yǎng)基為=IAMS固體培養(yǎng)基+瓊脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+NAA 0. 4 0. 6mg/L, pH 值為 5. 7 5. 9。
3.根據權利要求2所述的一串紅植株的再生方法，其特征是所述步驟1)的消毒為在無菌操作臺上，選取一串紅優(yōu)質種子放置于帶有過濾網的球狀殼體內，先用質量濃度75 %酒精消毒lmin，然后用無菌蒸溜水洗3次，再用質量濃度0. 1 % HgCl2溶液消毒 8min，最后用無菌蒸溜水沖洗3次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一串紅植株的再生方法，依次包括以下步驟1)一串紅種子消毒；2)無菌培養(yǎng)；3)將無菌培養(yǎng)后所得的種子縱切成兩半，然后去掉種皮后切面朝下接種于誘導愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng)；4)將步驟3)所得誘導后產物接種在誘導愈傷培養(yǎng)基上繼代1～2次；5)選取步驟4)所得的生長良好的繼代后愈傷組織轉接到分化培養(yǎng)基上進行不定芽的分化；6)割取步驟5)所得的不定芽作為小苗轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；直至小苗上長出至少3條且長度≥2cm的不定根；得到可出瓶移栽的種苗；上述步驟1)～步驟6)均在無菌環(huán)境中進行。采用該方法能獲得大量的一串紅再生植株。
文檔編號A01H4/00GK102090333SQ20101054273
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月11日 優(yōu)先權日2010年11月11日
發(fā)明者傅巧娟, 劉輝, 張國平, 方獻平, 沈國正, 陳一 申請人:杭州市農業(yè)科學研究院, 浙江大學