專(zhuān)利名稱：花生高效轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，尤其涉及一種花生高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)能打破物種界限，利用常規(guī)手段難以利用的優(yōu)異基因，從而創(chuàng)造出抗 各種生物與非生物脅迫或優(yōu)質(zhì)的植物新品種，同時(shí)還是基因分離及基因功能分析的重要工具?；ㄉ粌H是主要的油料作物，而且是重要的優(yōu)質(zhì)食用植物蛋白來(lái)源。通過(guò)轉(zhuǎn)基因 技術(shù)提高花生抗黃曲霉侵染或產(chǎn)毒的能力，有望解決嚴(yán)重影響人體健康的黃曲霉毒素污染 問(wèn)題。對(duì)某些病毒病而言，花生種質(zhì)抗源貧乏，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可用于增強(qiáng)花生品種對(duì)這些病毒 病的抗性。利用RNA干涉技術(shù)下調(diào)花生過(guò)敏原基因表達(dá)，也已展現(xiàn)出良好的前景。轉(zhuǎn)基因 技術(shù)可望用于改善花生蛋白質(zhì)氨基酸組成、提高含油量。由于可以生食，花生被普遍認(rèn)為是 一種良好的生產(chǎn)人用或動(dòng)物用口服疫苗或其它醫(yī)用產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，而基于油質(zhì)體的表 達(dá)系統(tǒng)，可為分離純化目的產(chǎn)品提供便利。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍轟擊法是花生上目前普遍采用的轉(zhuǎn)基因方法。研究表明， 根癌農(nóng)桿菌侵染花生的效果因菌株、細(xì)菌密度、預(yù)處理、接種方法、花生基因型和外植體類(lèi) 型而異。印度國(guó)際半干旱熱帶作物研究所(ICRISAT)建立的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生轉(zhuǎn)基因 技術(shù)在西班牙型花生幾24上取得了成功。成熟種子子葉在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周，再轉(zhuǎn) 至芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周。摘取外植體帶芽的部分做2-3次、每次4周的繼代培養(yǎng)。伸長(zhǎng) 到3-4cm的芽在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周誘導(dǎo)生根。獲得一代轉(zhuǎn)基因花生所需時(shí)間較長(zhǎng)， 至少需要7-8個(gè)月。且此法僅適用于西班牙型花生品種。美國(guó)佐治亞大學(xué)的Peggy Ozias-Akins實(shí)驗(yàn)室建立的花生基因槍法轉(zhuǎn)基因流程， 已被多個(gè)實(shí)驗(yàn)室直接采用或略加修改后采用。此法的靶組織是胚性組織，源自培養(yǎng)于含 3-30mg/L毒莠定MS或FN-Lite培養(yǎng)基上的未成熟子葉、幼葉或成熟種子胚芽。從開(kāi)始培養(yǎng)到 獲得一致的培養(yǎng)物需要3-6個(gè)月時(shí)間。長(zhǎng)期培養(yǎng)物用于轉(zhuǎn)化常會(huì)產(chǎn)生不育問(wèn)題。hph基因作 為選擇標(biāo)記效果極好。轟擊的組織在含20mg/L潮霉素的半固體或液體培養(yǎng)基上篩選3個(gè)月。 再生與繁殖各需3和5個(gè)月。此法獲得一代轉(zhuǎn)基因花生所需時(shí)間較長(zhǎng)，至少需要15-19個(gè)月。 在四個(gè)市場(chǎng)型(弗吉尼亞型、蘭娜型、西班牙型和瓦倫西亞型)品種上均有成功的報(bào)道?；ㄉ蠎?yīng)用的轉(zhuǎn)基因方法還有PEG介導(dǎo)法及花粉管通道法等。作為籽粒豆類(lèi)，花 生組培難度較大，再生體系只在少數(shù)幾個(gè)基因型上建立起來(lái)，因此除花粉管通道法外的其 它方法普遍具有基因型依賴性的缺陷，由于組培再生耗時(shí)較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株常常遭受不育 性的困擾。依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)需要較多設(shè)備。這已成為花生轉(zhuǎn)基因技術(shù)規(guī)?；?應(yīng)用的主要障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)效果能夠克服上述缺陷，提供一種花生高效轉(zhuǎn)基因方法，其彌補(bǔ)現(xiàn)行花生轉(zhuǎn)化率低，操作繁瑣的不足。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案其包括基因注入步驟，基因注入是指 將含目的基因的植物表達(dá)載體在特定時(shí)間注入田間生長(zhǎng)的特定花生花器內(nèi)；所述的目的基 因表達(dá)載體，是指濃度為600-1800ng/ml的載體溶液；所述的特定時(shí)間，是指花生盛花期特 定時(shí)段；所述的花器，是指花朵翼瓣間和/或花萼管。以田間生長(zhǎng)的花生花器為受體，注入一定量含特定目的基因的植物表達(dá)載體，此 法操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴設(shè)備?；谥芄庥?1974)提出的將外源DNA直接導(dǎo)入植物的設(shè)想及其在棉花、水稻等作 物上應(yīng)用的成功經(jīng)驗(yàn)，在花生上初步建立了植株水平的花器注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)。開(kāi)花當(dāng)日上 午7 9時(shí)將外源DNA或目的基因構(gòu)建體溶液緩緩注入受體花器，注射量滴于翼瓣間的以 注滿為止；注入花萼管的，以花生龍骨瓣處內(nèi)冒出氣泡為止。這一方法的有效性已為斑點(diǎn)雜 交、PCR-Southern雜交、gus活性分析以及蛋白質(zhì)電泳所證實(shí)。用該法將野生種A. glabrata 總DNA導(dǎo)入花17、魯花8號(hào)、魯花9號(hào)等花生栽培品種，其后代的形態(tài)、產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀均 產(chǎn)生了明顯變異。創(chuàng)造出耐旱性增強(qiáng)、顯著增產(chǎn)或蛋白質(zhì)含量提高1.9個(gè)百分點(diǎn)的新種質(zhì)。 將牛胸腺DNA和酪蛋白DNA基因?qū)牖ㄉ贩N白沙1016和魯花10號(hào)，發(fā)現(xiàn)0:代株形、分枝、 果形、熟性、育性等性狀均出現(xiàn)較大分離，總變異率為34. 94. 1%。用質(zhì)粒通過(guò)此法轉(zhuǎn) 化花生，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率在0. 4% 0. 5%之間。將海灘鹽生植物秋茄和海邊月見(jiàn)草總DNA導(dǎo)入 花生獲得的后代種子(T2)在140mMNaCl溶液中浸種催芽，發(fā)芽率分別為47. 5%和44. 1%， 而對(duì)照種只有15. 7%。將mtlD基因轉(zhuǎn)入花生，對(duì)后代進(jìn)行耐鹽性測(cè)定、PCR及Southern雜 交分析，表明該基因已整合入花生基因組中，轉(zhuǎn)基因1代種子在140mM NaCl溶液中發(fā)芽率 是原品種的1. 4倍。由于不需要組織培養(yǎng)的步驟，易獲得后代種子，這種轉(zhuǎn)基因方法應(yīng)具有 廣泛的基因型適用性。該轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作簡(jiǎn)單，不需貴重儀器，便于普及推廣。受花器注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)的啟發(fā)，本發(fā)明將化學(xué)誘變劑注入花生花器，成功獲得了 花生莢果顯著變大和變小的突變體和高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的花生突變體，并積累了大量經(jīng)驗(yàn)。本發(fā)明 就是在前述研究工作的基礎(chǔ)上提出的，極大地提高了花生的基因轉(zhuǎn)化率。與現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，本發(fā)明不需要進(jìn)行組織培養(yǎng)、所需設(shè)備簡(jiǎn)單低廉、耗時(shí) 短，載體用量少、費(fèi)用低，尤其轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化率高，可以滿足花生規(guī)?；D(zhuǎn)基因的要求，對(duì)于 花生轉(zhuǎn)基因研究、重要功能基因的分離及分析等均具有重要意義。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述圖1是注射EGFP基因后收獲的一粒花生種子EGFP基因擴(kuò)增產(chǎn)物部分測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式EGFP基因?qū)胍弧⒃囼?yàn)材料及表達(dá)載體材料本試驗(yàn)采用4個(gè)基因型，包括花生品種(系)花育22號(hào)、花育31號(hào)、魯花12 號(hào)、06-測(cè) B8。載體帶有EGFP基因的植物表達(dá)載體。
二、試驗(yàn)方法1.基因?qū)胗诟綦x區(qū)內(nèi)進(jìn)行花生轉(zhuǎn)基因操作。濃度為600 1800ng/ml的含EGFP基因的植物 表達(dá)載體注入，由不同時(shí)間、不同部位組合的4種注射方法4181、4182、4182、々282，在2009 年6月26-30日進(jìn)行。處理的花在枝條相應(yīng)節(jié)位栓繩標(biāo)記。統(tǒng)計(jì)注射花數(shù)量、收獲種子粒 數(shù)。2. PCR鑒定轉(zhuǎn)化體收獲的花生籽仁分別編號(hào)，按本室建立的利用小部分子葉組織快速提取DNA方法 制備PCR模板。50 u 1 PCR體系內(nèi)含DNA模板2 yl、10 y M EGFP特異引物(EGFP-F1 :5，-GACCATGTGATCGCGCTTCTCGTT-3，，EGFP-R1 :5，-ACCCTCGTGACCACCCTGACCTAC-3，)各 1 U 1> Tiangen 2XTaq Platinum PCR Master Mix 25ul。程序?yàn)?94°C 3min ;94°C lmin， 61.6°C 40sec,72°C lmin，35個(gè)循環(huán)；最后于72 °C延伸5min。EGFP特異擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 483bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有預(yù)期長(zhǎng)度PCR產(chǎn)物后，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。陽(yáng)性對(duì)照以帶 有EGFP的質(zhì)粒DNA做模板，陰性對(duì)照取未注射的相應(yīng)花生基因型的種子提取DNA做模板。 得到的DNA序列以DNAStar軟件包中的SeqMan構(gòu)建疊連群，進(jìn)行比較。計(jì)算測(cè)試種子數(shù)/ 注射花朵數(shù)、PCR陽(yáng)性種子數(shù)/測(cè)試種子數(shù)、PCR陽(yáng)性種子數(shù)/注射花朵數(shù)。三、結(jié)果統(tǒng)計(jì)EGFP基因載體注入4個(gè)花生基因型，總共處理了 6200朵花，收獲種子994粒，其中 925粒經(jīng)PCR測(cè)試，369粒呈陽(yáng)性。平均而言，PCR測(cè)試種子粒數(shù)占處理花朵數(shù)的14. 92%, PCR陽(yáng)性種子粒數(shù)占全部測(cè)試種子粒數(shù)的35. 87%,占處理花朵數(shù)的5. 33%。4個(gè)花生基因 型均得到了 PCR陽(yáng)性種子。共提交39?；ㄉN子EGFP特異引物PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，其結(jié) 果與EGFP序列完全相同(部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1)。A1B2處理效果(統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表 1)總體好于其它3種處理，A1B2處理中4個(gè)基因型均以載體濃度為1000-1300ng/ml效果 最優(yōu)，轉(zhuǎn)化率(陽(yáng)性種子粒數(shù)/處理花朵數(shù))為11. 33% 32. 00%。下表為A1B2注射法注入DNA不同濃度對(duì)花生基因轉(zhuǎn)化率的影響
5 注表中 I 代表 600-800ng/ml ；II 代表 1000_1300ng/ml ；III 代表 1500_1800ng, ml。
權(quán)利要求
一種花生高效轉(zhuǎn)基因方法，包括基因注入步驟，其特征在于，基因注入是指將含目的基因的植物表達(dá)載體在特定時(shí)間注入田間生長(zhǎng)的特定花生花器內(nèi)；所述的目的基因表達(dá)載體，是指濃度為600-1800ng/ml的載體溶液；所述的特定時(shí)間，是指花生盛花期特定時(shí)段；所述的花器，是指花朵翼瓣間或/和花萼管。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生高效轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于基因表達(dá)載體的注入量， 滴于翼瓣間的以注滿為止。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生高效轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于基因表達(dá)載體的注入量， 注入花萼管的，以花生龍骨瓣處內(nèi)冒出氣泡為止。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，尤其涉及一種花生高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)。本發(fā)明的花生高效轉(zhuǎn)基因方法，包括基因注入步驟，基因注入是指將含目的基因的植物表達(dá)載體在特定時(shí)間注入田間生長(zhǎng)的特定花生花器內(nèi)；所述的目的基因表達(dá)載體，是指濃度為600-1800ng/ml的載體溶液；所述的特定時(shí)間，是指花生盛花期特定時(shí)段；所述的花器，是指花朵翼瓣間或/和花萼管。與現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，本發(fā)明不需要進(jìn)行組織培養(yǎng)、所需設(shè)備簡(jiǎn)單低廉、耗時(shí)短，載體用量少、費(fèi)用低，尤其轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化率高，可以滿足花生規(guī)模化轉(zhuǎn)基因的要求，對(duì)于花生轉(zhuǎn)基因研究、重要功能基因的分離及分析等均具有重要意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101864450SQ20101018254
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者唐月異, 姜永興, 崔鳳高, 張建成, 李貴杰, 楊偉強(qiáng), 王傳堂, 王秀貞, 禹山林, 陳殿緒 申請(qǐng)人:山東省花生研究所