專利名稱：產(chǎn)生ω-3脂肪酸的酶和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在重組細(xì)胞(例如酵母或植物細(xì)胞)中合成長鏈多不飽和脂肪酸(特別是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸)的方法。本發(fā)明還提供產(chǎn)生長鏈多不飽和脂肪酸的重組細(xì)胞或植物。此外，本發(fā)明涉及一組新的酶，它們具有去飽和酶或延長酶活性，可用于合成長鏈多不飽和脂肪酸的方法。具體地，本發(fā)明提供具有新活性的ω 3 去飽和酶、Δ5延長酶和Δ6去飽和酶。本發(fā)明還提供用于以多種基因瞬時和/或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞(特別是植物細(xì)胞)的方法和DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在廣泛認(rèn)為ω -3長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA和VLC-PUFA)是關(guān)乎人和動物健康的重要化合物。可從膳食來源或通過轉(zhuǎn)換亞油酸(LA，18:2gj6)或α-亞麻酸(ALA， 18:3 ω 3)而獲得這些脂肪酸，LA和ALA被認(rèn)為是人類膳食中的必需脂肪酸。盡管人和許多其他脊椎動物能夠?qū)⒅参飦碓吹腖A或ALA轉(zhuǎn)換為VLC-PUFA，但這種轉(zhuǎn)換的速率很慢。此外， 大多數(shù)現(xiàn)代社會的飲食不平衡，其中至少90%的多不飽和脂肪酸(PUFA)是ω6脂肪酸，而非理想的4 1或更低的ω6 ω 3脂肪酸的比例(Trautwein，2001)。對于人類，VLC-PUFA 例如二十碳五烯酸(ΕΡΑ，20:5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6co3)的直接來源主要是來自魚類或魚油。因此，健康專家們推薦將含有高水平VLC-PUFA的魚類常規(guī)納入人類飲食。 例如，來源于魚類的VLC-PUFA油被越來越多地添加到食品和嬰兒配方奶中。不過，鑒于全球和國家魚業(yè)的下滑，需要找到這些有益健康的油類的替代來源。與動物不同，高等植物不能合成鏈長超過18個碳原子的多不飽和脂肪酸。具體地，農(nóng)作物和園藝植物以及其他被子植物不具有合成長鏈ω 3脂肪酸例如衍生自ALA的 ΕΡΑ、二十二碳五烯酸(DPA，22:5co3)和DHA所需的酶。因此，植物生物技術(shù)的一個重要目的是通過遺傳工程學(xué)方法改造出產(chǎn)生大量VLC-PUFA的農(nóng)作物，由此提供這些化合物的替代來源。VLC-PUFA牛物合成涂徑生物體(例如微藻類、苔蘚和真菌)中VLC-PUFA的生物合成通常是一系列的依賴氧的去飽和作用和延長反應(yīng)(圖1)。這些生物體中產(chǎn)生EPA的最常見的途徑包括Δ 6-去飽和作用、Δ 6-延長作用和Δ 5-去飽和作用(稱為Δ 6-去飽和作用途徑)，較不常見的途徑則使用Δ 9-延長作用、Δ 8-去飽和作用和Δ 5-去飽和作用(稱為Δ 9-去飽和作用途徑)。這些連續(xù)的去飽和作用和延長反應(yīng)可以從ω6脂肪酸底物L(fēng)A開始，見圖1左上部分(ω6)，或從ω 3底物ALA開始，見圖1右下部分(ω 3)。如果起始的Δ 6_去飽和作用在 ω 6底物L(fēng)A上進(jìn)行，該系類三種酶的VLC-PUFA產(chǎn)物會是ω 6脂肪酸ARA。合成VLC-PUFA的生物體可利用ω3_去飽和酶將ω6脂肪酸轉(zhuǎn)換為ω 3脂肪酸，如圖1所示的將花生四烯酸 (ARA，20:4 ω 6)轉(zhuǎn)換為EPA的Δ17-去飽和酶步驟。ω 3_去飽和酶家族的一些成員可作用于從LA到ARA的大量底物。植物ω 3_去飽和酶通常特異性催化由LA到ALA的Δ 15-去飽和作用，而真菌和酵母ω 3-去飽和酶對由ARA到EPA的Δ 17-去飽和作用具有特異性(Pereira等，200 ；Zank等，200 。一些報道提示可能存在非特異性的ω 3_去飽和酶，可將多種ω 6底物轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的ω 3產(chǎn)物(Siang等，2007)。其他ω 3_去飽和酶可對ω3底物具有偏向性(Sayanova等，2003)。在這些生物體中，EPA轉(zhuǎn)換為DHA相對簡單，包括通過Δ 5_延長作用由EPA產(chǎn)生 DPA，隨后通過Δ 4-去飽和作用產(chǎn)生DHA (圖1)。相反，哺乳動物則利用所謂的“Sprecher” 途徑，通過不依賴于Δ 4去飽和酶的3個分開的反應(yīng)將DPA轉(zhuǎn)換為DHA (Sprecher等，1995)。前端去飽和酶通常存在于植物、苔蘚、微藻類和低等動物(例如秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans))中，主要接受與磷酯酰膽堿(PC)底物的sn-2位置發(fā)生酯化的脂肪酸底物。這些去飽和酶因此稱為?；?PC脂質(zhì)連接的前端去飽和酶(Domergue等， 2003)。相反，高等動物前端去飽和酶通常接受酰基輔酶A底物，其中脂肪酸底物連接于CoA 而非 PC (Domergue 等，2005)。PUFA和VLC-PUFA延長反應(yīng)各自包括由多組分蛋白復(fù)合體催化的4個步驟首先，縮合反應(yīng)給脂肪酸加上來自丙二酰-CoA的2C單元，導(dǎo)致形成β -酮?；虚g體，然后通過NADPH將其還原，隨后脫水產(chǎn)生烯醇基中間體，該中間體最后被再次還原，產(chǎn)生延長的脂肪酸。通常認(rèn)為這4個反應(yīng)中的縮合步驟具有底物特異性，而其他步驟則不具有。在實踐中，這意味著，只要引入對VLC-PUFA具有特異性的縮合酶(典型地稱為“延長酶”)， 植物中的天然延長機制便能夠延長VLC-PUFA，只不過植物中的天然延長機制延長非天然 VLC-PUFA底物的效率可能是低的。2007年鑒定并表征了酵母延長作用循環(huán)脫水酶(Denic and Weissman,2007) ο在植物、苔蘚和微藻類中，VLC-PUFA去飽和作用天然發(fā)生在主要屬于?；?PC庫的脂肪酸底物，而延長作用則發(fā)生在酰基-CoA庫的底物。脂肪酸從酰基-PC分子轉(zhuǎn)移至 CoA載體是由磷脂酶類(PLA)進(jìn)行的，而酰基-CoA脂肪酸轉(zhuǎn)移至PC載體是由溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶類(LPCAT)進(jìn)行的(圖2) (singh等，2005)。在去飽和作用可以跟上延長作用之前必需發(fā)生酰基交換(反之亦然)，由此引起的流量下降可通過使用對?；o酶A底物具有特異性的去飽和酶而克服(Hoffmann等，2008)。遺傳工程化產(chǎn)生VLC-PUFA絕大多數(shù)VLC-PUFA代謝工程一直采用需氧Δ 6_去飽和作用/延長作用途徑進(jìn)行。1996年首次報道了使用來自藍(lán)細(xì)菌集胞藻(Synechocystis)的Δ 6_去飽和酶在煙草中生物合成Y-亞麻酸(GLA，18:3 ω 6) (Reddy and Thomas，1996)。最近，已經(jīng)在農(nóng)作物例如向日葵(73% GLA ;Knauf等，2006)和大豆(28% GLA ；Sato等，2004)中產(chǎn)生GLA。由于涉及更多的去飽和作用和延長作用步驟，因此產(chǎn)生VLC-PUFA例如EPA和DHA涉及更復(fù)雜的工程化。饑等O004)最早報道了在陸生植物中產(chǎn)生EPA，其將編碼來自球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的Δ 9_延長酶的基因、編碼來自小眼蟲(Euglenagracilis)的Δ8-去飽和酶的基因、和編碼來自高山被孢霉(Mortierella alpina)的Δ 5_去飽和酶的基因引入擬南芥， 產(chǎn)生高達(dá)3%的ΕΡΑ。隨后Abkidi等Q004)報道了使用編碼來自小立碗蘚(Pyscomitrella patens)的Δ 6_去飽和酶和Δ 6_延長酶的基因和編碼來自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的Δ 5-去飽和酶的基因在亞麻子中產(chǎn)生了高達(dá)0. 8%的EPA。WO 04/017467首次報道了產(chǎn)生DHA，并迄今為止其報道的產(chǎn)生VLC-PUFA的水平是最高的，其描述通過引入編碼異絲水霉(Saprolegnia diclina) Δ 6_去飽和酶、高山被孢霉Δ 6-去飽和酶、高山被孢霉Δ 5-去飽和酶、異絲水霉Δ 4-去飽和酶、異絲水霉Δ 17-去飽和酶、高山被孢霉Δ 6-延長酶和路氏巴夫藻(Pavlova lutheri) Δ 5_延長酶的基因，在大豆胚(而非種子)中產(chǎn)生了 3%的DHA。在也產(chǎn)生DHA的胚中，最高EPA水平是19.6%，說明EPA轉(zhuǎn)換為DHA的效率低下(W0 2004/071467)。這一發(fā)現(xiàn)與Robert等Q005)發(fā)表的結(jié)果類似，后者的從EPA到DHA的流量低下，其使用鮐(Danio rerio) Δ 5/6-去飽和酶、秀麗隱桿線蟲Δ 6-延長酶、和鹽生巴夫藻(Pavlova salina) Δ 5_延長酶和Δ 4_去飽和酶，在擬南芥中產(chǎn)生了 3% EPA和0. 5% DHA。也在2005, et al.報道使用畸雌腐霉(Pythium irregulare) Δ 6-去飽和酶、破囊壺菌(Thraustochytrid) Δ 5_去飽和酶、小立碗蘚Δ6-延長酶、金盞花(Calendula off icianalis) Δ 12-去飽和酶、破囊壺菌Δ 5_延長酶、致病疫霉 (Phytophthora infestans) Δ 17-去飽禾口酶、虹鱒(Oncorhynchus mykiss) VLC-PUFA 延長酶、破囊壺菌八4-去飽和酶和破囊壺菌^^々1\在芥菜(Brassica juncea)中產(chǎn)生了 25% ARAU5% EPA 禾口 1. 5% DHA(Wu 等，2005)。因此仍需要在重組細(xì)胞中，特別是在油料種子植物的種子中更加高效地產(chǎn)生 LC-PUFA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人首次鑒定到了能夠在重組細(xì)胞中將EPA高效轉(zhuǎn)換為DPA的Δ 5延長酶。因此，本發(fā)明還提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼具有Δ5延長酶活性的脂肪酸延長酶的外源性多核苷酸，其中當(dāng)所述延長酶由所述細(xì)胞、優(yōu)選植物細(xì)胞中的所述外源性多核苷酸表達(dá)時，所述延長酶對EPA具有活性，以至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的效率產(chǎn)生DPA。在一個實施方式中，所述延長酶包含SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :6具有至少47%相同性的氨基酸序列。在另一個實施方式中，所述細(xì)胞還包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ 8去飽和酶和/或Δ 6去飽和酶，ii) Δ9延長酶和/或Δ6延長酶，iii)A5去飽和酶，和iv)任選存在的Δ 4去飽和酶和/或ω 3去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子。本發(fā)明人還鑒定到了具有新特性的ω 3去飽和酶。所述ω 3去飽和酶可用于為產(chǎn)生ΕΡΑ、下游脂肪酸DPA和DHA、以及其他ω 3VLC-PUFA而設(shè)計的重組途徑中。因此，本發(fā)明提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼具有ω3去飽和酶活性的脂肪酸去飽和酶的外源性多核苷酸，其中當(dāng)所述去飽和酶由所述細(xì)胞中的所述外源性多核苷酸表達(dá)時，所述去飽和酶能夠進(jìn)行以下至少一種去飽和作用將ARA去飽和化為EPAJf DGLA去飽和化為ETAjf GLA去飽和化為SDAjf ARA去飽和化為EPA并將DGLA去飽和化為ETAjf ARA去飽和化為EPA并將GLA去飽和化為SDA、或所有這三種去飽和作用。所述去飽和酶優(yōu)選地是前端去飽和酶。
在另一個實施方式中，所述去飽和酶對?；溨芯哂兄辽偃齻€碳碳雙鍵的C20脂肪酸、優(yōu)選ARA具有Δ 17去飽和酶活性。在另一個實施方式中，所述去飽和酶對?；溨芯哂腥齻€碳碳雙鍵的C18脂肪酸、優(yōu)選GLA具有Δ 15去飽和酶活性。所述去飽和酶優(yōu)選地對酰基輔酶A底物的活性高于對相應(yīng)的?；?PC底物的活性。在一個實施方式中，所述?；o酶A底物是ARA-CoA，而所述?；?PC底物包含位于的PC的sn-2位置的ARA。在另一個實施方式中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，且當(dāng)所述去飽和酶由所述細(xì)胞中的所述外源性多核苷酸表達(dá)時，所述去飽和酶對ARA具有活性，以至少40%的效率產(chǎn)生EPA。在一個具體的實施方式中，所述去飽和酶包含SEQ ID N0:15、17或20所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :15具有至少35%相同性的氨基酸序列、與SEQ ID NO :17具有至少60%相同性的氨基酸序列和/或與SEQ ID NO :20具有至少60%相同性的氨基酸序列。此外，本發(fā)明人鑒定到了編碼一種Δ6去飽和酶的基因，所述Δ6去飽和酶在植物和/或酵母中對ω3脂肪酸底物的轉(zhuǎn)換效率高于對ω6脂肪酸底物的轉(zhuǎn)換效率。該Δ6去飽和酶還表現(xiàn)出Δ8去飽和酶活性。與對ω3去飽和的脂肪酸底物不具有偏向性的去飽和酶相比，在植物的重組LC-PUFA途徑中使用該Δ 6去飽和酶或其他對ω 3去飽和的脂肪酸底物具有高特異性的去飽和酶提高了 EPA、DPA和DHA的水平。因此，本發(fā)明還提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼具有Δ6去飽和酶活性的脂肪酸去飽和酶的外源性多核苷酸，其中所述去飽和酶進(jìn)一步具有至少兩種、優(yōu)選全部三種以下特性i)對作為脂肪酸底物的ALA的Δ 6去飽和酶活性高于對LA的Δ 6去飽和酶活性， 優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，ii)對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去飽和酶活性高于對作為脂肪酸底物的連接于PC的Sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，和iii)對ETrA具有Δ 8去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。本發(fā)明還提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼具有△ 6去飽和酶活性的脂肪酸去飽和酶的外源性多核苷酸，其中所述去飽和酶對ω3底物的活性高于對相應(yīng)的ω6底物的活性，且其中當(dāng)所述去飽和酶由所述細(xì)胞中的所述外源性多核苷酸表達(dá)時，所述去飽和酶對ALA具有活性，以至少5%、至少7. 5%、或至少10%的效率產(chǎn)生SDA，或當(dāng)所述去飽和酶在酵母細(xì)胞中表達(dá)時，其以至少35%的效率產(chǎn)生 SDA。在一個實施方式中，所述去飽和酶對脂肪酸底物ALA的Δ6去飽和酶活性高于對 LA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。所述Δ 6去飽和酶優(yōu)選地對ALA底物的Δ 6去飽和酶活性是對LA的至少大約2 倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。在另一個實施方式中，所述Δ 6去飽和酶對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的活性高于對作為脂肪酸底物的連接至PC的sn-2位置的ALA的活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。
所述Δ 6去飽和酶優(yōu)選地對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去飽和酶活性是對作為脂肪酸底物的連接至PC的Sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性的至少大約5倍或至少10-倍，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。所述Δ 6去飽和酶優(yōu)選地是前端去飽和酶。在另一個實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞還包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ 6 延長酶，ii) Δ 5去飽和酶，iii)A5 延長酶，和iv)任選存在的Δ 4去飽和酶和/或ω 3去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子。本發(fā)明細(xì)胞中的所述Δ 6去飽和酶優(yōu)選地對ETA不具有可檢測到的Δ 5去飽和酶活性。所述Δ 6去飽和酶優(yōu)選地包含SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :10具有至少77%相同性的氨基酸序列。在另一個實施方式中，所述Δ 6去飽和酶包含SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :8具有至少67%相同性的氨基酸序列并具有Δ 8去飽和酶活性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，表達(dá)Δ 9延長酶、Δ 8去飽和酶和Δ 5去飽和酶的重組細(xì)胞能夠更高效地將脂肪酸底物轉(zhuǎn)換為EPA、DPA和DHA。因此，本發(fā)明還提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ 9 延長酶，ii) Δ 8去飽和酶，iii)A5 去飽和酶，iv)任選存在的Δ 5延長酶，和ν)如果存在Δ 5延長酶，則任選存在的Δ 4去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，且其中所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸有至少15%、至少20%、或至少25%在它們的?；溨邪辽?0個碳和至少3個碳碳雙鍵。在一個實施方式中，本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)脂肪酸中的ARA、EPA、DPA和DHA總計占所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸的至少15%、至少20%、或至少25%。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞將油酸轉(zhuǎn)換為二十碳烯酸(C20:l)的能力與野生型植物相比是降低的，和/或在所述細(xì)胞中有低于5%的油酸被轉(zhuǎn)換為二十碳烯酸。在一個具體的實施方式中，所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸具有低于1 %的C20 1。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比具有降低的內(nèi)源性Δ 15 去飽和酶活性，和/或所述細(xì)胞中有低于10%的LA被轉(zhuǎn)換為ALA。在一個具體的實施方式中，所述內(nèi)源性Δ 15去飽和酶對?；?PC底物的活性高于對相應(yīng)的酰基輔酶A底物的活性，優(yōu)選地其中所述?；荓A。
在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞與缺乏所述外源性多核苷酸的相應(yīng)細(xì)胞相比，其將GLA轉(zhuǎn)換為SDA和/或?qū)RA轉(zhuǎn)換為EPA的轉(zhuǎn)換是增加的。在一個實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)脂肪酸中的DHA的量占所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸的至少3%、至少5%、或至少10%。在另一個實施方式中，在本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)，LA轉(zhuǎn)換為ARA和/或ALA轉(zhuǎn)換為EPA的轉(zhuǎn)換效率是至少80%或至少90%。在一個實施方式中，所述Δ 9延長酶包含SEQ ID NO 22所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :22具有至少80%相同性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實施方式中，所述Δ 8去飽和酶包含SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO : 具有至少80%相同性的氨基酸序列。在另一個實施方式中，所述Δ 5去飽和酶包含SEQ ID NO 26或SEQ IDNO 13所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID N0J6和/或SEQ ID Ν0:13具有至少 80%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明人已經(jīng)獲得的結(jié)果表明，可以利用表達(dá)所述Δ6-去飽和酶、Δ6延長酶、 Δ 5去飽和酶、Δ 5延長酶、和Δ 4去飽和酶的一組基因、或類似的(特別是其中所述去飽和酶對?；o酶A底物具有活性的)一組基因，來合成顯著水平的EPA、DPA和DHA。因此，本發(fā)明還提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ6延長酶和/或Δ9延長酶，ii) Δ 6去飽和酶和/或Δ 8去飽和酶，iii)A5 去飽和酶，iv) Δ 5 延長酶，ν) Δ 4去飽和酶，和vi)任選存在的二?；视王；D(zhuǎn)移酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，特征在于具有一種或多種或全部以下特性a)將ALA轉(zhuǎn)換為EPA、DPA或DHA的轉(zhuǎn)換效率是至少17. 3%、或至少23%，b)將ALA轉(zhuǎn)換為DPA或DHA的轉(zhuǎn)換效率是至少15. 4%、或至少21 %，c)將ALA轉(zhuǎn)換為DHA的效率是至少9. 5%、或至少10. 8%，禾口d)將EPA轉(zhuǎn)換為DHA的效率是至少45%、或至少50%，且優(yōu)選地進(jìn)一步特征在于所述細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸中有至少4%是DHA。優(yōu)選地，摻入到細(xì)胞內(nèi)的三?；视椭械目傊舅嶂杏兄辽?%、至少11%或至少 15% 是 DHA。在一個實施方式中，DHA構(gòu)成所述細(xì)胞內(nèi)SDA、ETA、EPA、DPA和DHA的總和的 20-65 %，優(yōu)選地為 40-65 %。優(yōu)選地，細(xì)胞內(nèi)的ω3脂肪酸中的0. 1-25%是SDA、0. 1-10%是ΕΤΑ、0. 1-60%是 EPA, 0. 1-50%是DPA、且30-95%是DHA，更優(yōu)選地，所述細(xì)胞內(nèi)的ω3脂肪酸中的0. 1-25% 是 SDA、0. 1-10%是 ΕΤΑ、0. 1-50%是 ΕΡΑ、0. 1-50%是 DPA 和 40-95%是 DHA。所述Δ 4去飽和酶優(yōu)選地包含SEQ ID NO :73所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :73具有至少80%相同性的氨基酸序列。在另一個方面，本發(fā)明提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ6延長酶和/或Δ9延長酶，ii) Δ6去飽和酶和/或Δ8去飽和酶，iii)A5 去飽和酶，iv) Δ 5延長酶，和ν)任選存在的二?；视王；D(zhuǎn)移酶其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，特征在于具有一種或多種或全部以下特性a)將ALA轉(zhuǎn)換為EPA或DPA的轉(zhuǎn)換效率是至少17. 3%、或至少23%，和b)將ALA轉(zhuǎn)換為DPA的效率是至少15. 4%、或至少21 %，且優(yōu)選地進(jìn)一步特征在于所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸中有至少4%是DPA。優(yōu)選地，摻入到細(xì)胞內(nèi)的三?；视椭械目傊舅嶂杏兄辽?%、至少11%或至少 15% 是 DPA。優(yōu)選地，DPA構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)SDA、ETA、EPA和DPA的總量的20-65 %，更優(yōu)選地 40-65%。優(yōu)選地，細(xì)胞內(nèi)的ω3脂肪酸中的0. 1-35%是SDA、0. 1-15%是ΕΤΑ、0. 1-60%是 EPA、而30-75%是DPA，更優(yōu)選地，細(xì)胞內(nèi)的ω 3脂肪酸中的0. 1-35%是SDA、0. 1-15%是 ETA,0. 1-50%是 EPA 而 40-75%是 DPA。在一個實施方式中，所述Δ 6延長酶包含SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :4具有至少55%相同性的氨基酸序列。在另一個實施方式中，所述Δ 6去飽和酶包含SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :8具有至少67%相同性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述Δ 5去飽和酶包含SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO J6具有至少80%相同性的氨基酸序列。在另一個實施方式中，所述Δ 5延長酶包含SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :6具有至少47%相同性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述二?；视王；D(zhuǎn)移酶包含SEQ ID Ν0:75或SEQ ID NO 108所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ IDN0:75和/或SEQ ID NO :108具有至少80%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明顯然涵蓋任何兩種、三種、四種或全部上述酶的組合。在另一個實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞、優(yōu)選地植物細(xì)胞、且更優(yōu)選地植物種子細(xì)胞，還包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ 17去飽和酶，ii) Δ 15去飽和酶，和/或iii)A12 去飽和酶其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，
在另一個實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞中由外源性多核苷酸表達(dá)的一種或多種或全部所述去飽和酶對?；o酶A底物的活性高于對相應(yīng)的酰基-PC底物的活性。在具體的實施方式中，所述Δ6去飽和酶和Δ5去飽和酶、Δ5去飽和酶和Δ4去飽和酶、Δ 6去飽和酶和Δ 4去飽和酶、或全部三種所述Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和Δ4去飽和酶、或在每一上述這些組合的基礎(chǔ)上額外加上任何Δ 17去飽和酶、Δ 15去飽和酶和/或Δ 12去飽和酶，均對它們的酰基輔酶A底物的活性高于對相應(yīng)的?；?PC底物的活性。在這一實施方式中，細(xì)胞中由外源性多核苷酸表達(dá)的其他去飽和酶對?；o酶A底物的活性可高于或不高于對相應(yīng)的?；?PC底物的活性?？梢岳斫?，每種酶的優(yōu)選的?；o酶A底物是不同的。本發(fā)明還提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼具有△ 6延長酶和△ 9延長酶活性的脂肪酸延長酶的外源性多核苷酸，其中所述延長酶的Δ6延長酶活性高于Δ9延長酶活性。在一個實施方式中，所述延長酶轉(zhuǎn)換SDA以產(chǎn)生ETA的效率是至少50%或至少 60%，和/或轉(zhuǎn)換ALA以產(chǎn)生ETrA的效率是至少6%或至少9%。優(yōu)選地，所述延長酶具有的Δ 6延長酶活性是Δ 9延長酶活性的至少大約6. 5倍。在另一個實施方式中，所述延長酶不具有可檢測到的Δ5延長酶活性。延長酶優(yōu)選地包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO 4具有至少55%相同性的氨基酸序列。在另一個實施方式中，所述細(xì)胞還包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ 8去飽和酶和/或Δ 6去飽和酶，ii) Δ 5去飽和酶，iii)A5 延長酶，和iv)任選存在的Δ 4去飽和酶和/或ω 3去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子。本發(fā)明還提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼具有△ 5去飽和酶活性的脂肪酸去飽和酶的外源性多核苷酸，其中所述去飽和酶包含SEQ ID NO :13所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID Ν0:13具有至少 53%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供重組細(xì)胞，優(yōu)選地是植物細(xì)胞，更優(yōu)選地是植物種子細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼具有△ 9延長酶活性的脂肪酸延長酶的外源性多核苷酸，其中所述延長酶包含 SEQ ID NO :28、94和96中任一序列所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、與SEQ ID NO 觀具有至少81%相同性的氨基酸序列、或與SEQ ID NO: 94和/或SEQ ID NO: 96具有至少 50%相同性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述Δ 9延長酶包含SEQ ID NO 94或SEQ IDNO :96所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID Ν0:94和/或SEQ ID NO :96具有至少50% 相同性的氨基酸序列，且其中所述延長酶對ω6底物的活性高于對相應(yīng)的ω3底物的活性。 更優(yōu)選地，所述Δ 9延長酶對ω 6底物(例如LA)的活性是對相應(yīng)的ω 3底物(例如ALA) 的活性的至少2倍，更優(yōu)選地至少4倍。在另一個方面，本發(fā)明提供一種重組細(xì)胞，其包含編碼二?；视王；D(zhuǎn)移酶的外源性多核苷酸，其中所述二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶包含SEQ ID NO :108所示的氨基酸序列、 其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :108具有至少討％相同性的氨基酸序列。在本發(fā)明細(xì)胞的一個實施方式中，所述去飽和酶和/或延長酶、或多種去飽和酶和/或延長酶，可純化自微藻類。優(yōu)選的微藻類是巴夫藻(Pavlova spp)、塔胞藻 (Pyramimonas spp)禾口微胞藻(Micromonas spp)。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞是真核細(xì)胞。例如所述細(xì)胞可以是植物細(xì)胞、 哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞、體外的細(xì)胞和/或分離的細(xì)胞。在一個實施方式中，所述細(xì)胞在植物中和/或是成熟的植物種子細(xì)胞。所述植物可以是田間的植物或作為植物部分收獲的植物，或所述種子可以是收獲的種子。在一個具體的實施方式中，所述植物或植物種子分別是油料種子植物或油料種子。本領(lǐng)域人員可以理解，可以在同一細(xì)胞中共表達(dá)一或多種所定義的延長酶和/或去飽和酶。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞能夠合成長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)， 其中所述衍生自不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)沉默阻抑物(silencing suppressor)可升高植物細(xì)胞內(nèi)脂肪酸生物合成酶類的水平，特別是在從最初的轉(zhuǎn)化植物重復(fù)繁殖數(shù)代之后。因此，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞，優(yōu)選地植物細(xì)胞，更優(yōu)選地植物貯藏器官細(xì)胞或種子細(xì)胞， 包含編碼沉默阻抑物的外源性多核苷酸。優(yōu)選地，編碼沉默阻抑物的外源性多核苷酸可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子。在一個實施方式中，所述植物貯藏器官特異性啟動子是種子特異性啟動子，或是優(yōu)先在發(fā)育的種子中表達(dá)的子葉-特異性啟動子或胚乳-特異性啟動子。本發(fā)明還提供獲得細(xì)胞、優(yōu)選地植物細(xì)胞、更優(yōu)選地植物種子細(xì)胞的方法，所述的細(xì)胞能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)將編碼脂肪酸ω 3去飽和酶活性的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞，其中所述多核苷酸可操縱地連接于能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇能夠進(jìn)行以下至少一種去飽和作用的細(xì)胞將ARA去飽和化為EPAJf DGLA去飽和化為ETAjf GLA去飽和化為SDAjf ARA去飽和化為EPA并將DGLA去飽和化為 ETAjf ARA去飽和化為EPA并將GLA去飽和化為SDA、或所有這三種去飽和作用。在一個實施方式中，所選的細(xì)胞是本發(fā)明的細(xì)胞。具體地，所述細(xì)胞可進(jìn)一步包含本申請所描述的去飽和酶和延長酶的組合。本發(fā)明還提供獲得細(xì)胞、優(yōu)選地植物細(xì)胞、更優(yōu)選地植物種子細(xì)胞的方法，所述的細(xì)胞能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)將編碼脂肪酸Δ 5延長酶的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述 LC-PUFA的細(xì)胞，其中所述多核苷酸可操縱地連接于能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇其中所述Δ 5延長酶對EPA具有活性并以至少60%、至少65%、至少70% 或至少75%的效率產(chǎn)生DPA的細(xì)胞。在本發(fā)明方法的一個實施方式中，所選的細(xì)胞是本發(fā)明的細(xì)胞。具體地，所述細(xì)胞可進(jìn)一步包含本申請所描述的去飽和酶和延長酶的組合。本發(fā)明還提供獲得細(xì)胞、優(yōu)選地植物細(xì)胞、更優(yōu)選地植物種子細(xì)胞的方法，所述的細(xì)胞能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)將編碼脂肪酸Δ 6去飽和酶的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞，其中所述多核苷酸可操縱地連接于能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇具有至少兩種、優(yōu)選全部三種以下特性的細(xì)胞i)對作為脂肪酸底物的ALA的Δ 6去飽和酶活性高于對LA的Δ 6去飽和酶活性， 優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，ii)對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去飽和酶活性高于對作為脂肪酸底物的連接于PC的Sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，和iii)對ALA具有Δ 6去飽和酶活性并對KrA具有Δ 8去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。本發(fā)明還提供獲得細(xì)胞、優(yōu)選地植物細(xì)胞、更優(yōu)選地植物種子細(xì)胞的方法，所述的細(xì)胞能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)將編碼脂肪酸Δ 6去飽和酶的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞，其中所述多核苷酸可操縱地連接于能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇具有Δ 6去飽和酶活性的細(xì)胞，所述Δ 6去飽和酶對ω 3底物的活性高于對相應(yīng)的ω 6底物的活性，且所述Δ 6去飽和酶對ALA具有活性并以至少5%、至少7. 5%、 或至少10%的效率產(chǎn)生SDA，或當(dāng)其在酵母細(xì)胞中表達(dá)時以至少35%的效率產(chǎn)生SDA。在一個實施方式中，所選的細(xì)胞是本發(fā)明的細(xì)胞。具體地，所述細(xì)胞可進(jìn)一步包含本申請所描述的去飽和酶和延長酶的組合。本發(fā)明還提供獲得細(xì)胞、優(yōu)選地植物細(xì)胞、更優(yōu)選地植物種子細(xì)胞的方法，所述的細(xì)胞能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)將編碼以下各項的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA 的細(xì)胞i) Δ 9 延長酶，ii) Δ 8去飽和酶，
iii)A5 去飽和酶，iv)任選存在的Δ5延長酶，和ν)如果存在Δ 5延長酶，則任選存在的Δ 4去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇其中總脂肪酸有至少15%、至少20%或至少25%在它們的?；溨邪辽?0個碳和至少3個碳碳雙鍵的細(xì)胞。在一個實施方式中，所選的細(xì)胞是本發(fā)明的細(xì)胞。本發(fā)明還提供獲得細(xì)胞、優(yōu)選地植物細(xì)胞、更優(yōu)選地植物種子細(xì)胞的方法，所述的細(xì)胞能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)將編碼以下各項的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA 的細(xì)胞i) Δ6延長酶和/或Δ9延長酶，ii) Δ6去飽和酶和/或Δ8去飽和酶，iii)A5 去飽和酶，iv) Δ 5 延長酶，ν) Δ 4去飽和酶，禾口vi)任選存在的二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，C)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇具有一種或多種或全部以下特性的細(xì)胞1)將ALA轉(zhuǎn)換為EPA、DPA或DHA的轉(zhuǎn)換效率是至少17. 3%、或至少23% ；2)將ALA轉(zhuǎn)換為DPA或DHA的轉(zhuǎn)換效率是至少15. 4%、或至少21% ；3)將ALA轉(zhuǎn)換為DHA的效率是至少9. 5%、或至少10. 8% ；禾口4)將EPA轉(zhuǎn)換為DHA的效率是至少45%、或至少50% ；且優(yōu)選地進(jìn)一步特征在于所述細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸中有至少4%是DHA。在另一方面，本發(fā)明提供獲得細(xì)胞、優(yōu)選地植物細(xì)胞、更優(yōu)選地植物種子細(xì)胞的方法，所述的細(xì)胞能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)將編碼以下各項的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA 的細(xì)胞i) Δ6延長酶和/或Δ9延長酶，ii) Δ6去飽和酶和/或Δ8去飽和酶，iii)A5 去飽和酶，iv) Δ 5延長酶，和ν)任選存在的二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶
其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇具有一種或多種或全部以下特性的細(xì)胞a)將ALA轉(zhuǎn)換為EPA或DPA的轉(zhuǎn)換效率是至少17. 3%、或至少23%，和b)將ALA轉(zhuǎn)換為DPA的效率是至少15. 4%、或至少21 %，且優(yōu)選地進(jìn)一步特征在于所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸中有至少4%是DPA。在本發(fā)明的方法的一個實施方式中，所述外源性多核苷酸穩(wěn)定整合到所述細(xì)胞的基因組中。在另一個實施方式中，所述方法還包括從步驟a)的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物的步驟。在進(jìn)一步的實施方式中，所述外源性多核苷酸在所述細(xì)胞中瞬時表達(dá)。在一個實施方式中，所述細(xì)胞是植物的葉細(xì)胞。本發(fā)明還提供選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子的方法，包括i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼多肽，所述多肽可能是脂肪酸去飽和酶；ii)將所述核酸分子引入細(xì)胞，其中所述啟動子在所述細(xì)胞中具有活性；iii)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子；iv)分析所述細(xì)胞中的脂肪酸組成；和ν)基于以下事實選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子所述多肽具有ω 3去飽和酶活性并能夠進(jìn)行以下至少一種去飽和作用將ARA去飽和化為EPAjf DGLA去飽和化為ETAjf GLA去飽和化為SDAjf ARA去飽和化為EPA并將DGLA去飽和化為ETAjf ARA去飽和化為EPA并將GLA去飽和化為SDA、或所有這三種去飽和作用。在所述方法的一個實施方式中，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO :15具有至少 35%的相同性、與SEQ ID NO: 17具有至少60%的相同性、和/或與SEQ ID NO 20具有至少60%的相同性。本發(fā)明還提供選擇參與脂肪酸延長作用的核酸分子的方法，包括i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼多肽，所述多肽可能是脂肪酸延長酶，ii)將所述核酸分子引入細(xì)胞，其中所述啟動子在所述細(xì)胞中具有活性，iii)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子；iv)分析所述細(xì)胞中的脂肪酸組成；和ν)基于以下事實選擇參與脂肪酸延長作用的核酸分子所述多肽具有Δ 5延長酶活性且其轉(zhuǎn)換EPA產(chǎn)生DPA的效率是至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。在一個實施方式中，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO 6具有至少47%的相同性。本發(fā)明還提供選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子的方法，包括i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼多肽，所述多肽可能是脂肪酸去飽和酶，
ii)將所述核酸分子引入細(xì)胞，其中所述啟動子在所述細(xì)胞中具有活性，iii)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子；iv)分析所述細(xì)胞中的脂肪酸組成；和ν)基于以下事實選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子所述多肽具有Δ 6去飽和酶活性并具有至少兩種、優(yōu)選全部三種以下特性a)對作為脂肪酸底物的ALA的Δ 6去飽和酶活性高于對LA的Δ 6去飽和酶活性， 優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，b)對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去飽和酶活性高于對作為脂肪酸底物的連接于PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，和c)對ALA具有Δ 8去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。在所述方法的一個實施方式中，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID Ν0:10具有至少 77%的相同性和/或與SEQ ID NO :8具有至少67%的相同性。本發(fā)明還提供選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子的方法，包括i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼多肽，所述多肽可能是脂肪酸去飽和酶，ii)將所述核酸分子引入細(xì)胞，其中所述啟動子在所述細(xì)胞中具有活性，iii)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子；iv)分析所述細(xì)胞中的脂肪酸組成；和ν)基于以下事實選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子所述多肽具有Δ 6去飽和酶活性和Δ 8去飽和酶活性。在一個實施方式中，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO 8具有至少67%的相同性。在另一個實施方式中，本發(fā)明的方法的步驟(ν)包括選擇編碼對?；o酶A底物具有活性的去飽和酶的核酸分子或編碼前端去飽和酶的核酸分子。本發(fā)明還提供本文中所定義的外源性多核苷酸的組合，當(dāng)它們用于產(chǎn)生重組細(xì)胞時，它們在重組細(xì)胞中表達(dá)至少兩種脂肪酸去飽和酶和兩種脂肪酸延長酶的組合、和/或在重組細(xì)胞中產(chǎn)生LC-PUFA。本發(fā)明還提供基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ5延長酶，其中當(dāng)由外源性多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)時，所述延長酶對EPA具有活性，以至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的效率產(chǎn)生DPA。在一個實施方式中，所述△ 5延長酶的特征在于具有本文所定義的任何一或多種特性。本發(fā)明還提供基本上純化的和/或重組脂肪酸ω3去飽和酶，當(dāng)由外源性多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)時，其能夠進(jìn)行以下至少一種去飽和作用將ARA去飽和化為EPAjf DGLA 去飽和化為ETAjf GLA去飽和化為SDAjf ARA去飽和化為EPA并將DGLA去飽和化為ΕΤΑ、 將ARA去飽和化為EPA并將GLA去飽和化為SDA、或所有這三種去飽和作用。在一個實施方式中，本發(fā)明的ω 3去飽和酶的特征在于具有本文所定義的任何一或多種特性。本發(fā)明還提供基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ6去飽和酶，其中所述去飽和酶進(jìn)一步具有至少兩種、優(yōu)選全部三種以下特性i)對作為脂肪酸底物的ALA的Δ 6去飽和酶活性高于對LA的Δ 6去飽和酶活性， 優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，ii)對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去飽和酶活性高于對作為脂肪酸底物的連接于PC的Sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，和iii)對ETrA具有Δ 8去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。本發(fā)明還提供基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ6去飽和酶，其中所述去飽和酶對ω 3底物的活性高于對相應(yīng)的ω 6底物的活性，且其中所述去飽和酶對ALA具有活性，當(dāng)所述去飽和酶由外源性多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)時以至少5%、至少7. 5%、或至少10%的效率產(chǎn)生SDA，或當(dāng)其在酵母細(xì)胞中表達(dá)時以至少35%的效率產(chǎn)生SDA。在一個實施方式中，本發(fā)明的△ 6去飽和酶的特征在于具有本文所定義的任何一或多種特性。本發(fā)明還提供基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ6延長酶和Δ9延長酶，其中所述延長酶的△ 6延長酶活性高于△ 9延長酶活性。在一個實施方式中，本發(fā)明的Δ6延長酶和Δ 9延長酶的特征在于具有本文所定義的任何一或多種特性。本發(fā)明還提供基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ 5去飽和酶，其包含SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :13具有至少53%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ 9延長酶，其包含SEQID NO :28、 94和96任一所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、與SEQID NO 具有至少81 %相同性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 94和/或SEQ ID NO :96具有至少50%相同性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述Δ 9延長酶包含SEQ ID NO 94或SEQ ID NO 96所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID Ν0:94和/或SEQ ID NO :96具有至少50% 相同性的氨基酸序列，且其中所述延長酶對ω6底物的活性高于對相應(yīng)的ω3底物的活性。在另一個方面，本發(fā)明提供基本上純化的和/或重組二?；视王；D(zhuǎn)移酶，其包含SEQ ID NO :108所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :108具有至少
相同性的氨基酸序列。在一個實施方式中，本發(fā)明的去飽和酶或延長酶可純化自微藻類。優(yōu)選的微藻類是巴夫藻、塔胞藻和微胞藻。本發(fā)明還提供分離的和/或外源性多核苷酸，其包含i)選自 SEQ ID NO :3、5、7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107 或 125 至 129
中任一序列的核苷酸序列，ii)編碼本發(fā)明的去飽和酶或延長酶的核苷酸序列，iii)與 SEQ ID NO :3、5、7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107 或 125 至 129
所示的一或多種序列具有至少50%相同性的核苷酸序列，和/或iv)在嚴(yán)格性條件下與i)至iii)中任一序列雜交的序列。在一個實施方式中，所述分離的和/或外源性多核苷酸包含與SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO :1 具有至少57%相同性的核苷酸序列，并編碼Δ6延長酶。在另一個實施方式中，所述分離的和/或外源性多核苷酸包含與SEQ ID NO :14、 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 18禾口 /或SEQ ID NO 19具有至少50%相同性的核苷酸序列， 并編碼ω 3去飽和酶。在另一個實施方式中，所述分離的和/或外源性多核苷酸包含與SEQ ID NO 5和 /或SEQ ID NO :1 具有至少50%相同性的核苷酸序列，并編碼Δ5延長酶。在一個實施方式中，所述分離的和/或外源性多核苷酸包含與SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 9, SEQ ID N0:11和/或SEQ ID NO :125具有至少75%相同性的核苷酸序列，并編碼Δ 6去飽和酶。在另一個實施方式中，所述分離的和/或外源性多核苷酸包含與SEQID Ν0:12具有至少60%相同性的核苷酸序列，并編碼Δ 5去飽和酶。在另一個實施方式中，所述分離的和/或外源性多核苷酸包含與SEQ ID NO ,21, SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 93和/或SEQ ID NO 96具有至少50%相同性的核苷酸序列， 并編碼Δ 9延長酶。在另一個實施方式中，所述分離的和/或外源性多核苷酸包含與SEQID NO :107具有至少60%相同性的核苷酸序列，并編碼二?；视王；D(zhuǎn)移酶。在一個具體的實施方式中，所述分離的和/或外源性多核苷酸與SEQID NO :3、5、 7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107 或 125 至 129 所示序列之一具有至少 80%、或至少90 %、或至少95 %、或至少99 %的相同性。本發(fā)明還提供用于整合到和/或已整合到植物細(xì)胞基因組中的DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一簇至少三個編碼調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成的蛋白質(zhì)的可讀框，優(yōu)選地每一蛋白質(zhì)是脂肪酸去飽和酶或脂肪酸延長酶，其中具有相同轉(zhuǎn)錄方向的各可讀框間隔至少 750bp、至少1，OOObp或至少l，250bp，且至少有兩個可讀框具有不同的轉(zhuǎn)錄方向，其中每一可讀框可操縱地連接于在植物細(xì)胞中具有活性的啟動子，且每一啟動子可獨立地是相同的或不同的。優(yōu)選地，所述DNA構(gòu)建體中至少有兩個啟動子是不同的。一或多個或每一所述可讀框優(yōu)選地可操縱地連接于異源性5’前導(dǎo)序列，每一前導(dǎo)序列可獨立地是相同的或不同的，其中與特定可讀框的天然存在的5’前導(dǎo)序列相比，每一異源性5’前導(dǎo)序列使翻譯效率提高。在本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中，所述異源性5’前導(dǎo)序列優(yōu)選地是煙草花葉病毒 (TMV) 5’前導(dǎo)序列。在本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選地是延長酶和/或去飽和酶，更優(yōu)選地是本申請所述的組合。在另一個實施方式中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體僅具有三個或四個被翻譯成蛋白質(zhì)的可讀框。本發(fā)明還提供載體，其包含本發(fā)明的多核苷酸和/或本發(fā)明的DNA構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述多核苷酸可操縱地連接于啟動子。本發(fā)明還提供產(chǎn)生本發(fā)明的去飽和酶或延長酶的方法，所述方法包括在細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的DNA構(gòu)建體和/或本發(fā)明的載體。
本發(fā)明人還令人驚異地發(fā)現(xiàn)，可將至少三種獨立的包含不同外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸瞬時轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞內(nèi)并可組合檢測細(xì)胞內(nèi)每一外源性多核苷酸的活性。 因此，在另一方面，本發(fā)明還提供以至少三種不同的外源性多核苷酸瞬時轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法，所述方法包括i)獲得至少a)第一細(xì)菌，其包含包含第一外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸，b)第二細(xì)菌，其包含包含第二外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸，和c)第三細(xì)菌，其包含包含第三外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸，和ii)將所述細(xì)胞與步驟i)的細(xì)菌接觸，其中每一染色體外轉(zhuǎn)移核酸從細(xì)菌轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中以產(chǎn)生瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其中每一外源性多核苷酸包含在所述細(xì)胞中具有活性的啟動子，其中每一啟動子可以獨立地是相同的或不同的，且其中至少有一種外源性多核苷酸編碼沉默阻抑物。可以一或多種所述細(xì)菌依次或同時進(jìn)行步驟ii)。例如，細(xì)胞可以接觸第一細(xì)菌， 然后接觸第二細(xì)菌，等等。在另一實例中，細(xì)菌同時接觸各種細(xì)菌，優(yōu)選地為所述細(xì)菌的混合物。不同細(xì)菌的濃度可彼此不同或可以是相同的或相近的。所述細(xì)菌可以是混合的分離物(pooled isolates)，例如包含來自菌株文庫的多種分離物。在一個實施方式中，所述方法還包括獲得所述細(xì)胞然后使所述細(xì)胞接觸一或多種額外的細(xì)菌，每一細(xì)菌包含包含不同外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。例如，在一個實施方式中，所述方法包括獲得所述細(xì)胞然后使所述細(xì)胞接觸第四細(xì)菌，所述第四細(xì)菌包含包含第四外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。在另外一實施方式中，所述方法包括獲得所述細(xì)胞然后使所述細(xì)胞接觸第五細(xì)菌，所述第五細(xì)菌包含包含第五外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。在另外一實施方式中，所述方法包括獲得所述細(xì)胞然后使所述細(xì)胞接觸第六細(xì)菌，所述第六細(xì)菌包含包含第六外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。在另外一實施方式中，所述方法包括獲得所述細(xì)胞然后使所述細(xì)胞接觸第七細(xì)菌，所述第七細(xì)菌包含包含第七外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。在又一實施方式中，所述方法包括獲得所述細(xì)胞然后使所述細(xì)胞接觸第八細(xì)菌，所述第八細(xì)菌包含包含第八外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。優(yōu)選地，所述的不同外源性多核苷酸編碼不同RNA分子和/或多肽。在一個實施方式中，每一外源性多核苷酸編碼形成酶途徑的一部分的酶或是此種酶的候選物。上述方面特別可用于研究形成大的和/或復(fù)雜的生物學(xué)途徑的多核苷酸和/或多肽。因此，在優(yōu)選的實施方式中，每一外源性多核苷酸編碼酶或是此種酶的候選物，所述酶參與脂肪酸合成、脂肪酸修飾、二?；视徒M裝、三?；视徒M裝、或其中兩種或更多種的組合。在一個實施方式中，一或多種所述細(xì)菌的形式是原生質(zhì)體?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)菌的實例包括，但不限于，土壤桿菌、根瘤菌、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、 百脈根中慢生根瘤菌(Mezorhizobium Ioti)、弗氏志賀菌(Shigella flexneri)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、豬霍舌L沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)、 單核細(xì)胞增多性李司忒菌(Listeria monocytogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、假結(jié)核病耶爾森菌(Yersinia pseudotuberculosis)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Yersinia enterocolitica)?？捎糜诒景l(fā)明的染色體外轉(zhuǎn)移核酸的實例包括，但不限于，P-DNA、土壤桿菌、 T-DNA、或它們的組合。優(yōu)選地，上述方面的細(xì)胞是植物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方式中，所述細(xì)胞是組織或器官的一部分。在另一個實施方式中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，所述組織或器官是葉、莖、根、分生組織、愈傷組織、或胚珠。本發(fā)明人還確定了，如果啟動子是種子特異性啟動子，外源性多核苷酸在葉細(xì)胞中的表達(dá)可共表達(dá)種子特異性轉(zhuǎn)錄因子(例如多葉子葉2(leafy cotyledon 2)、視褐質(zhì) 3(fusca3)或脫落酸敏感3(abscisic acid_senstive3))而增強。多葉子葉2蛋白的實例包括，但不限于，WO 01/70777中所述的那些。因此，在優(yōu)選的實施方式中，所胡植物細(xì)胞是植物的葉細(xì)胞，至少一種所述啟動子是種子特異性啟動子，且至少一種所述外源性多核苷酸編碼種子特異性轉(zhuǎn)錄因子例如多葉子葉2。在一個實施方式中，所述外源性多核苷酸無一是病毒基因。在一個實施方式中，一或多種所述外源性多核苷酸在所述染色體外轉(zhuǎn)移核酸中僅以所述核酸序列的單拷貝形式存在，而不是所述核酸序列的多聚體或部分多聚體。在另一個實施方式中，至少一種所述染色體外轉(zhuǎn)移核酸不包括在所述細(xì)胞中具有功能的復(fù)制起始點，優(yōu)選地不是病毒復(fù)制起始點，更優(yōu)選地不是FBNYV復(fù)制起始點。在另一個實施方式中，所述外源性多核苷酸無一編碼病毒復(fù)制酶或病毒移動蛋白，例如WO 2007/137788和Marillonnet等Q005)所述的那些。本發(fā)明還提供篩選瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的所需活性的方法，所述方法包括以至少三種本發(fā)明的外源性多核苷酸瞬時轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，并測試所述細(xì)胞的所需活性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過以不同的染色體外轉(zhuǎn)移核酸來提供6種以上不同基因，可增強所述6種以上不同基因?qū)?xì)胞、特別是植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。因此，在另一方面，本發(fā)明提供以至少六種不同的外源性多核苷酸轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的方法，所述方法包括i)獲得至少a)第一細(xì)菌，其包含第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸，所述第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸，和b)第二細(xì)菌，其包含不同于所述第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸的第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸，所述第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸，ii)將所述細(xì)胞與步驟i)的細(xì)菌接觸，和iii)任選地選擇被所述第一和第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸的外源性多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中每一所述第一和第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸的外源性多核苷酸由所述細(xì)菌轉(zhuǎn)移至所述細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中每一所述外源性多核苷酸包含啟動子，所述啟動子在所述細(xì)胞中或可由其衍生的細(xì)胞中具有活性，且其中每一啟動子可以獨立地是相同的或不同的?？梢詢煞N細(xì)菌依次或同時進(jìn)行步驟i)a)和i)b)。例如，所述細(xì)胞可先接觸第一細(xì)菌，然后接觸第二細(xì)菌。與第二細(xì)菌接觸的細(xì)胞可以是與第一細(xì)菌接觸后的細(xì)胞的子代細(xì)胞或衍生自與第一細(xì)菌接觸后的細(xì)胞。在另一實例中，所述細(xì)胞同時與這兩種細(xì)菌接觸。
在一個實施方式中，所述i)第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸只有3-6種、3-5種、3_4種、 4-6種、4-5種或5-6種不同的外源性多核苷酸，和ii)第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸只有3-6種、 3-5種、3-4種、4-6種、4-5種或5_6種不同的外源性多核苷酸。優(yōu)選地，每一外源性多核苷酸編碼多肽，且其中各多肽是不同的。在另一個實施方式中， i)第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含兩種外源性多核苷酸，它們獨立地編碼選自如下一組的多肽Δ6去飽和酶、Δ 12去飽和酶和Δ 15去飽和酶，和ii)第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含編碼多肽的外源性多核苷酸，所述多肽是該組中的第三種酶。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，且所述方法還包括從所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物的步驟。本發(fā)明還提供細(xì)胞，所述細(xì)胞是通過所述以至少三種本發(fā)明的外源性多核苷酸瞬時轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法而產(chǎn)生的，或是通過所述以至少6種不同的本發(fā)明外源性多核苷酸轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的方法而產(chǎn)生的。在又一方面中，本發(fā)明提供產(chǎn)生以至少六種不同的外源性多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物的方法，所述方法包括i)獲得包含第一外源性基因組區(qū)的第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，所述第一外源性基因組區(qū)包含3、4、5、或6種不同的外源性多核苷酸，ii)獲得與所述第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物具有性親和性(sexually compatible)并包含第二外源性基因組區(qū)的第二種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，所述第二外源性基因組區(qū)不同于所述第一外源性基因組區(qū)并包含3、4、5、或6種不同的外源性多核苷酸，iii)使所述第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物與所述第二種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物雜交，和iv)選擇由步驟iii)產(chǎn)生的包含所述第一和第二基因組區(qū)的植物或其子代，由此產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，其中每一所述外源性多核苷酸包含啟動子，所述啟動子在植物中具有活性，且其中每一啟動子可以獨立地是相同的或不同的。在優(yōu)選的實施方式中，按照前述本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中所述來定向和間隔所述第一和/或第二外源性基因組區(qū)的外源性多核苷酸。在所述第一和第二外源性基因組區(qū)中，任一啟動子序列可出現(xiàn)多次或僅出現(xiàn)一次，或者，在所述第一和第二外源性基因組區(qū)中，一或多種啟動子可出現(xiàn)多次而一或多種其他啟動子僅出現(xiàn)一次。每一植物啟動子可獨立地優(yōu)先在所述植物的組織或器官中具有活性，例如，相對于其他組織或器官而言，在葉或種子中具有活性。這可使得所有引入的蛋白質(zhì)編碼區(qū)在所述植物器官或組織中同時表達(dá)或重疊表達(dá)。在并列的實施方式中，一或多種啟動子在所述植物中組成型表達(dá)，而一或多種其他啟動子優(yōu)先在植物器官或組織中表達(dá)。在一個實施方式中，步驟i)包括通過以下步驟產(chǎn)生所述第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物a)將植物細(xì)胞與包含第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸的第一細(xì)菌接觸，所述第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸，b)從步驟a)的植物細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，和任選地c)產(chǎn)生來自步驟b)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的子代植物；和/或步驟ii)包括通過以下步驟產(chǎn)生所述第二種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，d)將植物細(xì)胞與包含第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸的第二細(xì)菌接觸，所述第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸，e)從步驟d)的植物細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，和任選地f)產(chǎn)生來自步驟e)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的子代植物。在另一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生以至少六種不同的外源性多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物的方法，所述方法包括i)獲得包含第一外源性基因組區(qū)的第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物或植物部分，所述第一外源性基因組區(qū)包含3、4、5、或6種不同的外源性多核苷酸，ii)使所述第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物或植物部分的細(xì)胞接觸包含染色體外轉(zhuǎn)移核酸的細(xì)菌，所述染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸，iii)從所述細(xì)胞產(chǎn)生植物，和iv)任選地，選擇由步驟iii)產(chǎn)生的包含所述至少六種不同的外源性多核苷酸的植物。對于上述各方面的“將細(xì)胞與步驟i)的細(xì)菌接觸”這一步驟，正如本領(lǐng)域人員能夠理解的那樣，這一步驟要在合適的條件下進(jìn)行合適的時間，以便染色體外轉(zhuǎn)移核酸從細(xì)菌轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供真核細(xì)胞至少包含a)包含第一外源性多核苷酸的第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸，b)包含第二外源性多核苷酸的第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸，和c)包含第三外源性多核苷酸的第三染色體外轉(zhuǎn)移核酸。在一個實施方式中，所述細(xì)菌進(jìn)一步一或多種額外的細(xì)菌，每一細(xì)菌包含包含外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。本發(fā)明還提供植物或其子代或種子，其包含包含3、4、5、或6種不同的外源性多核苷酸的第一外源性基因組區(qū)，和包含3、4、5、或6種不同的外源性多核苷酸的第二外源性基因組區(qū)。所述外源性基因組區(qū)的外源性多核苷酸優(yōu)選地按照前述DNA構(gòu)建體中所述來定向和間隔。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人類生物體。在一個實施方式中，所述生物體的每一細(xì)胞均是本發(fā)明的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非人類生物體是轉(zhuǎn)基因植物，更優(yōu)選地是轉(zhuǎn)基因油料種子植物，其產(chǎn)生下文所列的的油。在進(jìn)一步的實施方式中，所述轉(zhuǎn)基因植物包含至少一種額外的編碼沉默阻抑物的外源性多核苷酸，其可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子，其中所述植物具有正常的表型。本發(fā)明還提供種子，其包含本發(fā)明的細(xì)胞或得自本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供油，其由本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或本發(fā)明的種子產(chǎn)生，或得自本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或本發(fā)明的種子。在一個實施方式中，所述油是通過對來自油料種子的油進(jìn)行提取而獲得的。在一個實施方式中，所述油介花油(歐洲油菜(Brassica napus)、蕪菁(Brassica rapa))、芥子油(芥菜(Brassica juncea))、其他蕓苔油、葵花子油(向日葵(Helianthusannus))、亞麻籽油(栽培亞麻(Linum usitatissimum))、大豆油(大豆(Glycine max))、 紅花油(紅花(Carthamus tinctorius))、玉米油(玉蜀黍(Zea mays))、煙草油(煙草(Nicotiana tabacum))、花生油(花生(Arachis hypogaea))、棕櫚油、棉籽油(陸地棉(Gossypium hirsutum))、椰子油(椰子(Cocos nucifera))、鍔梨油(鍔梨(Persea americana))(WI (Oleaeuropaea))(月要胃(Anacardium occidentale)) >
夏威夷果油(夏威夷果(Macadamia intergrifolia))、扁桃仁油(扁桃O^runus amygdalus))或擬南芥籽油(擬南芥(Arabidopsis thaliana))。本發(fā)明還提供脂肪酸，其由本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或本發(fā)明的種子產(chǎn)生，或得自本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或本發(fā)明的種子。本發(fā)明還提供產(chǎn)生含不飽和脂肪酸的油的方法，所述方法包括從本發(fā)明的細(xì)胞、 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或本發(fā)明的種子提取油。本發(fā)明還提供組合物，其包含本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的去飽和酶或延長酶、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的DNA構(gòu)建體、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的油或本發(fā)明的脂肪酸。本發(fā)明還提供飼料、化妝品或化學(xué)制品，其包含本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、本發(fā)明的種子、本發(fā)明的油和/或本發(fā)明的脂肪酸。本發(fā)明還提供進(jìn)行去飽和酶反應(yīng)的方法，所述方法包括使與CoA酯化的多不飽和脂肪酸接觸本發(fā)明的去飽和酶。本發(fā)明還提供基本上純化的抗體或其片段，其特異性結(jié)合本發(fā)明的去飽和酶或延長酶.本發(fā)明還提供治療或預(yù)防可能從PUFA獲益的病癥的方法，所述方法包括給對象施用本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的去飽和酶或延長酶、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的DNA構(gòu)建體、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、本發(fā)明的種子、本發(fā)明的油或本發(fā)明的脂肪酸和/或本發(fā)明的飼料。在一個實施方式中，所述病癥是心律失常、血管成形術(shù)、炎癥、哮喘、銀屑病、骨質(zhì)疏松癥、腎臟結(jié)石、AIDS、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克隆病、精神分裂癥、癌癥、胎兒酒精綜合征、注意力缺陷多動癥、囊性纖維化、苯丙酮尿癥、單相抑郁、攻擊敵意、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、冠心病、高血壓、糖尿病、肥胖、阿爾茨海默病、慢性阻塞性肺疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管成形術(shù)后再狹窄、濕疹、高血壓、血小板聚集、胃腸道出血、子宮內(nèi)膜異位癥、經(jīng)前期綜合征、肌痛腦脊髓炎、病毒感染后慢性疲勞或眼部疾病。本發(fā)明還提供本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的去飽和酶或延長酶、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的DNA構(gòu)建體、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、本發(fā)明的種子、本發(fā)明的油或本發(fā)明的脂肪酸和/或本發(fā)明的飼料在制備用于治療或預(yù)防可能從PUFA獲益的病癥的藥物中的用途。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚異地發(fā)現(xiàn)，沉默阻抑物可優(yōu)先地表達(dá)于植物貯藏器官以增強轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)水平，而不明顯影響植物的發(fā)育。因此，本發(fā)明提供植物細(xì)胞，其包含i)編碼沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子，和ii)編碼RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操縱地連接于在植物貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。優(yōu)選地，所述植物貯藏器官特異性啟動子是種子特異性啟動子，例如子葉特異性啟動子或胚乳特異性啟動子。在一個實施方式中，所述沉默阻抑物是病毒阻抑蛋白，例如，但不限于，PU P19、 V2、P38、P15、Pe-Po 和 RPV-PO0典型地，如果植物組成型地表達(dá)病毒阻抑蛋白，則植物具有異常的表型，但如果沉默阻抑物特異性表達(dá)于貯藏器官，則植物具有正常的表型。此類病毒阻抑蛋白的實例包括， 但不限于，P1、P19和P15。在進(jìn)一步的實施方式中，所述病毒阻抑蛋白降低microRNA的積累和/或降低 microRNA的導(dǎo)向型裂解。RNA分子本身可以是功能性的，例如，但不限于，反義多核苷酸、催化性多核苷酸、 dsRNA和/或microRNA。或者，所述RNA分子可編碼具有所需功能的多肽，例如，但不限于，參與脂肪酸合成或修飾的酶、種子貯藏蛋白(例如，谷類麥谷蛋白或麥醇溶蛋白)、參與碳水化合物的合成或修飾、次級代謝的酶或藥物。藥用蛋白質(zhì)的實例包括，但不限于，抗體以及抗體相關(guān)分子及其片段、抗原性多肽，它們能夠例如產(chǎn)生針對癌癥、感染因子的免疫保護(hù)，細(xì)胞因子例如，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、干擾素-α、人血清白蛋白和促紅細(xì)胞生成素。在進(jìn)一步的實施方式中，所述細(xì)胞包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種或更多額外的不同的外源性多核苷酸，每一外源性多核苷酸編碼RNA分子并可操縱地連接于在貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。每一外源性多核苷酸可以可操縱地連接于同一啟動子、不同的啟動子或它們的組合。在一個實施方式中，所述外源性多核苷酸是DNA。在進(jìn)一步的實施方式中，所述細(xì)胞存在于植物貯藏器官例如種子中。在優(yōu)選的實施方式中，與缺乏所述第一外源性多核苷酸的同基因細(xì)胞相比，所述 RNA分子以升高的水平存在。優(yōu)選地，所述水平增加至少10%、至少20%、更優(yōu)選地至少 30%。在另一實施方式中，與缺乏所述第一外源性多核苷酸的同基因細(xì)胞相比，由至少所述額外的外源性多核苷酸編碼的至少一種RNA分子以升高的水平存在。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物，其包含以上方面的細(xì)胞。在一個實施方式中，所述植物的每一細(xì)胞均是以上方面所定義的細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實施方式中，與缺乏所述細(xì)胞的植物相比，所述植物具有正常的表型。在另一方面，本發(fā)明提供植物貯藏器官，其包含以上方面的細(xì)胞和/或其得自前面定義的轉(zhuǎn)基因植物。在一個實施方式中，所述植物貯藏器官是種子。在另一方面，本發(fā)明提供獲得在貯藏器官中具有升高水平的RNA分子的表型正常植物的方法，包括a)向植物細(xì)胞中引入i)編碼沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子，和
ii)編碼RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操縱地連接于在植物貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，b)從步驟a)的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物，c)生長所述轉(zhuǎn)化植物直至其產(chǎn)生貯藏器官，d)確定所述貯藏器官中的RNA分子水平，和e)選擇表型正常的植物，但其中所述貯藏器官內(nèi)的RNA分子的水平與缺乏所述第一外源性多核苷酸的相應(yīng)的貯藏器官相比是升高的。在又一方面，本發(fā)明提供獲得在貯藏器官中RNA分子穩(wěn)定表達(dá)的表型正常植物的方法，包括a)向植物細(xì)胞中引入i)編碼沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子，和ii)編碼RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操縱地連接于在植物貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，b)從步驟a)的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物，c)從步驟b)的植物產(chǎn)生包含貯藏器官的第三代子代植物，和d)選擇第三代子代植物，其中所述貯藏器官中的所述RNA分子的水平是前代植物的貯藏器官中水平的至少90%。優(yōu)選地，以上方面的外源性多核苷酸穩(wěn)定整合到所述細(xì)胞的基因組中。在又一方面，本發(fā)明提供在轉(zhuǎn)基因植物的貯藏器官中穩(wěn)定表達(dá)RNA分子的方法， 包括i)表達(dá)編碼沉默阻抑物的、可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子的第一外源性多核苷酸，和ii)表達(dá)編碼RNA分子的、可操縱地連接于在植物貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子的第二外源性多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是從以所述外源性多核苷酸轉(zhuǎn)化的母本植物獲得的至少第三代子代植物，且其中所述植物的貯藏器官中的所述RNA分子的水平是前代植物的貯藏器官中水平的至少90%。在一個實施方式中，所述植物生長在田間。顯然，本發(fā)明一個方面的優(yōu)選的特征也適用于本發(fā)明的許多其他方面。在本說明書中，“包含”一詞或其變化形式例如“包括”應(yīng)理解為旨在納入所提及的元件、整數(shù)或步驟或是元件、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他的元件、整數(shù)或步驟或是元件、整數(shù)或步驟的組。下面通過以下非限制性實施例并結(jié)合附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明。


圖1.需氧DHA生物合成途徑。圖2.在PC、CoA庫和TAG庫之間轉(zhuǎn)移脂肪酸的各種酰基交換酶(acyl exchange enzymes)。改編自 Singh 等 Q005)。
圖3.微胞藻CS-0170 Δ 6_延長酶和相關(guān)基因之間的多重比對。AAV33630， C20-多不飽和脂肪酸延長酶[巴夫藻CCMP459] ；ΑΑΥ15135，延長酶1 [鹽生巴夫藻]； ABR67690, C20延長酶[綠色巴夫藻(Pavlova viridis)] ；AAV67797，多不飽和脂肪酸延長酶 1 [Ostreococcus tauri] ；CAL55414,多不飽和脂肪酸延長酶 2 (ISS) [Ostreococcus tauri] ；XP_001419791,推定的蛋白質(zhì)[Ostreococcus lucimarinus CCE9901]； MicCS0170-d6E，微胞藻CS-0170A6-延長酶(本發(fā)明)；AAV67800，多不飽和脂肪酸延長酶2[假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana) ] ；XP_001416454，推定的蛋白質(zhì) [Ostreococcus lucimarinus CCE9901] ；ABC18313，多不飽和脂肪酸延長酶 1 [破囊壺菌 (Thraustochytrium sp. )FJN_10] ；AAV67799，多不飽和脂肪酸延長酶1 [假微型海鏈藻]； AAW70157, Δ-6-延長酶[三角褐指藻]；ABC18314，多不飽和脂肪酸延長酶2 [破囊壺菌 FJN-10] ；CAD58M0，未命名蛋白質(zhì)產(chǎn)物[球等鞭金藻]。圖4.塔胞藻CS-0140A6_延長酶和相關(guān)基因之間的多重比對。AAL84174，多不飽和脂肪酸特異性延長酶1[小立碗蘚]；AAT85662，多不飽和脂肪酸延長酶[地錢 (Marchantia poIymorpha)] ；AAV67797，多不飽禾口月旨肪酸延長醇 1 [Ostreococcus tauri]； AB094747,推定的蛋白質(zhì)[Ostreococcus lucimarinus CCE9901] ；Pyrco-d6E,塔胞藻 CS-OHOA 6-延長酶(本發(fā)明)；ABC18313，多不飽和脂肪酸延長酶1 [破囊壺菌FJN-10]； BAF97073，多不飽和脂肪酸延長酶[高山被孢霉]；XP_001567488，長鏈多不飽和脂肪酸延長酶樣蛋白[巴西利什曼原蟲(Leishmania braziliensis)MH0M/BR/75/M2904]； BAE71129，△ 5-延長酶[地錢]；XP_001779105 ；推定的蛋白質(zhì)[小立碗蘚]。圖5.塔胞藻CS-0140A5_延長酶和相關(guān)基因之間的多重比對。ΑΑΙ52204，Ε1ον14 蛋白[鮐]；CAG01780，未命名蛋白質(zhì)產(chǎn)物[墨綠凹鼻飩(Tetraodon nigroviridis)]； AAV67800,多不飽和脂肪酸延長酶2 [假微型海鏈藻]；AAV33630，C20-多不飽和脂肪酸延長酶[巴夫藻CCMP459] ；ABR67690, C20延長酶[綠色巴夫藻]；AAY15135，延長酶1 [鹽生巴夫藻]；AAV67798，多不飽和脂肪酸延長酶2 [Ostreococcus tauri] ；AB098084，推定的蛋白質(zhì)[Ostreococcus lucimarinus CCE9901] ；Pyrco_d5E，塔胞藻 CS-0140 Δ 5-延長酶(本發(fā)明)。圖6.微胞藻(ΧΜΡ1545Δ6-去飽和酶和相關(guān)基因之間的多重比對。ΑΑΜ09687， Δ 5-脂肪酸去飽和酶[破囊壺菌ATCC21685] ；AAV33631, Δ 4-去飽和酶[球等鞭金藻]； AAW70159, Δ 6-去飽禾口酶[Ostreococcus tauri] ；AB099366，推定的蛋白質(zhì)[Ostreococcus lucimarinus CCE99Ol] ；Mic_d6D，微胞藻 CCMPlM5 Δ 6_ 去飽和酶(本發(fā)明)；ABF58685, Δ 5-去飽禾口酶[Perkinsus marinus] ；ABL96295, Δ 5-去飽禾口酶[鹽生巴夫藻]。圖7. Ostreococcus lucimarinus Δ 6-去飽和酶和相關(guān)基因之間的多重比對。ΑΑΜ09687, Δ 5-脂肪酸去飽和酶[破囊壺菌ATCC21685] ；AAR27297, Δ 6-去飽和酶[淀粉絲菌(Amylomyces rouxii) ] ；AAS93682, Δ 6-脂肪酸去飽和酶[稻根霉菌 (Rhizopus oryzae) ] ； AAV33631, Δ4-去飽和酶[球等鞭金藻]；AAW70159，Δ6-去飽禾口 Sl [Ostreococcus tauri] ；0stlu-d6D, Ostreococcus lucimarinus Δ6_ 去t包禾口 (本發(fā)明)；ABF58685，Δδ-去飽和酶[Perkinsus marinus] ；ABL96295, Δ δ-去飽和酶[鹽生巴夫藻]；EDQ92231，推定的蛋白質(zhì)[領(lǐng)鞭毛蟲(Monosiga brevicollis)MXl] ；CAM41728，脂肪酸去飽和酶，推定的[巴西利什曼原蟲]；CAM65683，脂肪酸去飽和酶，推定的[嬰兒利什曼原蟲(Leishmania infantum)]。圖8.塔胞藻CS-0140 Δ 5_去飽和酶和相關(guān)基因之間的多重比對。ΑΑΜ09687， Δ 5-脂肪酸去飽和酶[破囊壺菌ATCC21685] ；Pyrco_d5D，塔胞藻CS-0140 Δ 5-去飽和酶 (本發(fā)明)；ΑΑΤ85661，Δ 6-脂肪酸去飽和酶[地錢]；ΑΑΧ14505，Δ6-脂肪酸去飽和酶 [假微型海鏈藻]；ΑΒΡ49078，Δ 6-脂肪酸去飽和酶[三角褐指藻]；AAW70159，Δ 6-去飽禾口醇[Ostreococcus tauri] ；XP_001421073，推定的蛋白質(zhì)[Ostreococcus Iucimarinus CCE9901] ；ABF58685, Δ 5-去飽和酶[Perkinsus marinus] ；CAJ07076，脂肪酸去飽和酶，推定的[碩大利什曼原蟲(Leishmania major) ] ；ABL96295, Δ 5-去飽和酶[鹽生巴夫藻]； EDQ92231，推定的蛋白質(zhì)[領(lǐng)鞭毛蟲MXl]。圖 9. Ostreococcus tauri (Ot) (SEQ ID NO :30)、Ostreococcus lucimarinus (01) (SEQ ID NO 10)和微胞藻(M) CCMP1545 (SEQ ID NO :8)的Δ 6-去飽和酶蛋白序列的
多重比對。圖10.顯示各種去飽和酶之間的關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹。PaVSa-d5D =鹽生巴夫藻Δ 5-去飽和酶(ABL96295) ；Thr21685_d5D =破囊壺菌ATCC21685 Δ 5-去飽和酶(ΑΑΜ09687) ；Micl545-d6D =微胞藻 CCMPlM5 Δ 6_ 去飽和酶(本發(fā)明)；0stta_d6D =Ostreococcus tauri Δ 6_ 去飽禾口醇(AAW70159) ；0stlu_d6D = Ostreococcus lucimarinus Δ6-去飽和酶(本發(fā)明)；Galga_d6D =原雞(Gallus gallus) Δ 6-去飽和酶 (ΧΡ_421053) ； Homsa-d6D =智人 Δ6-去飽和酶(AAG23121) ；Musmu_d6D =小家鼠 Δ 6-去飽和酶(ΝΡ_062673) ；Danre-d5/6D =鮐 Δ 5-/Δ 6-去飽禾Π 酶(AAG25710) ；Spaau_d6D = 金黃色石斑魚(Sparus aurata)推定的Δ6-去飽和酶(AAL17639) ；Scoma-d6D =大菱鲆 (Scophthalmus maximus) Δ6-去飽和酶(AAS49163) ；0ncmy-d6D =虹鱒 Δ6-去飽和酶 (AAK26745) ；Salsa_d5D = Salmo salarA5_ 去飽和酶(AAL82631) ；Prifa-d6D = Primula farinosa Δ 6-去飽和酶(ΑΑΡ23034) ；Euggr_d6D =小眼蟲 Δ 6-去飽和酶；Borof_d6D = 琉璃苣(Borago officianalis) Δ6-去飽和酶(AAC49700) ；Caeel_d6D =秀麗隱桿線蟲 △ 6-去飽和酶(AAC15586) ；Rhior_d6D =稻根霉菌△ 6-去飽和酶(AAS93682) ；Moral-d6D =高山被孢霉Δ 6-去飽和酶(AAF08685) ；Moris_d6D =深黃被孢霉(Mortierella isabellina) Δ6-去飽和酶(AAL73M8) ；Marpo-d6D =地錢 Δ6-去飽和酶(AAT8566I)； Cerpu-d6D=角齒蘚(Ceratodon purpureus) Δ 6_ 去飽和酶(CAB94993) ；Phatr_d6D =三角褐指藻Δ 6-去飽和酶(AAL92563) ；Hiaps-d6D =假微型海鏈藻Δ 6-去飽和酶(ΑΑΧ14505)； Pavsa-d8D =鹽生巴夫藻Δ8-去飽和酶(ABL96296) ；Phatr_d5D =三角褐指藻Δ 5-去飽和酶(AAL92562) ；Marpo-d5D =地錢 Δ δ-去飽和酶(AAT85663) ；Moral-d5D =高山被孢霉厶5-去飽和酶仏六1 280；35) ；Dicdi-dOT=盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum) Δ 5-去飽和酶(ΒΑΑ37090)。圖11.來自以linP-micl545-d6D-linT構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的T2擬南芥種子的GC結(jié)果。 顯示了單個事件1-19的SDA和GLA水平，各柱狀圖上方顯示了 ω3到ω6的轉(zhuǎn)換效率的比。 細(xì)小微胞藻Δ 6-去飽和酶對ω 3底物顯示出明顯的偏向性。圖12.構(gòu)成滲入到本氏煙草(Nicotiana benthamiana)中的EPA途徑的酶的轉(zhuǎn)換效率。EPA途徑含有Δ 6-去飽和酶(車前葉藍(lán)薊(Echium plantagineum) Δ 6-去飽和酶、 Ostreococcus tauri Δ 6-去飽禾口醇或細(xì)小微胞藻(Micromonas pusilla) Δ 6-去飽禾口醇)、Pyramimonas cordata Δ 6_延長酶和鹽生巴夫藻Δ 5_去飽和酶。a顯示各途徑的ω3庫轉(zhuǎn)換效率；b.含有車前葉藍(lán)薊途徑、細(xì)小微胞藻途徑和含有這兩種去飽和酶的途徑之間的直接比較；c.含有O.tauri途徑、細(xì)小微胞藻途徑和含有這兩種?；?CoA去飽和酶的途徑之間的直接比較。圖13. GC和GC-MS確認(rèn)通過瞬時表達(dá)的微胞藻RCC299 ω 3去飽和酶在本氏煙草中產(chǎn)生ΕΡΑ。圖14. 二元載體pJPlOlacq的圖顯示了該二元載體的關(guān)鍵特征，包括啟動子方向、 TMV前導(dǎo)序列定位、間隔區(qū)域定位和基因插入的獨特克隆位點。NosT = NOS終止子，F(xiàn)Pl = 截短的napin終止子，LininT = Linin終止子。圖15. 二元載體pJP107的圖。圖16.確定在基于葉的分析法中實現(xiàn)近最大基因活性所需的土壤桿菌的濃度。以不同培養(yǎng)密度的含有二元表達(dá)構(gòu)建體Ig Δ 9elo的土壤桿菌AGLl進(jìn)行滲入后的本氏煙草中的球等鞭金藻Δ 9-延長酶(IgA9el0)活性。將共滲入的P19設(shè)定在OD6tltlnm為0. 4的濃度。 y-軸顯示的是產(chǎn)生EDA和ETrA的Ig Δ 9elo活性的總和。圖17.采用在葉子中瞬時表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)的方法比較LC-PUFA途徑的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。轉(zhuǎn)換效率基于總脂肪酸特征譜。3結(jié)果來自(Qi等，2004)廣結(jié)果來自(Robert等，2005)。圖18.本氏煙草中的代謝適應(yīng)。a.是對金槍魚油中產(chǎn)生的脂肪酸甲基酯(FAME) 的氣相色譜(GC)示蹤，其僅含有少量的EPA，但含有大量的DHA。b.和c.是對來自以單基因CaMV 35S 二元構(gòu)建體(含有細(xì)小微胞藻Δ 6-去飽和酶、P. cordata Δ6_延長酶、鹽生巴夫藻Δ 5-去飽和酶、P. cordata Δ 5-延長酶(b.)或鹽生巴夫藻Δ 5_延長酶(c.)和鹽生巴夫藻Δ 4-去飽和酶)瞬時轉(zhuǎn)化的本氏煙草葉組織中的TAG成分的FAME的GC示蹤。EPA 在使用鹽生巴夫藻Δ 5-延長酶的樣品中的累積證實了如何可以通過仔細(xì)選擇途徑中的單個基因而使得代謝途徑發(fā)生適應(yīng)。圖19.載體PJP3075中包含轉(zhuǎn)基因的區(qū)域的圖。圖20.載體PJP3059中包含轉(zhuǎn)基因的區(qū)域的圖。圖21.載體PJP3060中包含轉(zhuǎn)基因的區(qū)域的圖。圖22.載體PJP3115中包含轉(zhuǎn)基因的區(qū)域的圖。圖23.載體PJP3116中包含轉(zhuǎn)基因的區(qū)域的圖。序列表要點SEQIDNO1-編碼微胞藻CS-0170 Δ 6-延長酶的可讀框。
SEQIDNO2-微胞藻CS-0170 Δ 6-延長酶。
SEQIDNO3-編碼塔胞藻CS-0140 Δ 6-延長酶/ Δ 9-延長酶的可讀框。
SEQIDNO4-塔胞藻CS-0140 Δ 6-延長酶/ Δ 9-延長酶。
SEQIDNO5-編碼塔胞藻CS-0140 Δ 5-延長酶的可讀框。
SEQIDNO6-塔胞藻CS-0140 Δ 5-延長酶。
SEQIDNO7-編碼微胞藻CCMP1545 Δ 6-去飽和酶/ Δ 8-去飽和酶的可讀框。
SEQIDNO8-微胞藻CCMP1545 Δ 6-去飽和酶/ Δ 8-去飽和酶。
SEQIDNO9-編碼Ostreococcus Iucimarinus Δ 6-去飽禾口酶的可讀框。
SEQIDNO10-Ostreococcus Iucimarinus Δ 6-去飽禾口酶。
SEQIDNO11-用于在植物中表達(dá)Ostreococcus Iucimarinus Δ 6-去飽和酶的經(jīng)密碼子優(yōu)化的可讀框。
SEQIDNO12-編碼塔胞藻CS-0140 Δ 5-去飽和酶的可讀框。
SEQIDNO13-塔胞藻CS-0140 Δ 5-去飽和酶。
SEQIDNO14-編碼微胞藻CS-0170 ω 3-去飽和酶的部分可讀框。
SEQIDNO15-部分微胞藻CS-0170 ω 3-去飽和酶。
SEQIDNO16-編碼微胞藻RCC299 ω 3-去飽和酶的可讀框。
SEQIDNO17-微胞藻RCC299 ω 3-去飽和酶。
SEQIDNO18·-用于在植物中表達(dá)微胞藻RCC299 ω 3-去飽和酶的經(jīng)密碼子優(yōu)化的可讀框。
SEQIDNO19-編碼微胞藻CCMP1545 ω 3_去飽和酶的可讀框。
SEQIDNO20-微胞藻CCMP1545 ω 3_去飽和酶。
SEQIDNO21-編碼球等鞭金藻Δ 9-延長酶的可讀框。
SEQIDNO22-球等鞭金藻Δ 9-延長酶。
SEQIDNO23-編碼鹽生巴夫藻Δ 8-去飽和酶的可讀框。
SEQIDNO24-鹽生巴夫藻Δ 8-去飽和酶。
SEQIDNO25-編碼鹽生巴夫藻Δ 5-去飽和酶的可讀框。
SEQIDNO26-鹽生巴夫藻Δ 5-去飽和酶。
SEQIDNO27-編碼Emiliania huxleyi CCMP1516 Δ 9延長酶的可讀框。
SEQIDNO:28-Emiliania huxleyi CCMP1516 Δ 9 延長酶。
SEQIDNO:29-用于在植物中表達(dá)Emiliania huxleyi Δ 9延長酶的經(jīng)密碼子優(yōu)化的可讀框。
SEQIDNO:30-Ostreococcus tauri Δ 6_ 去飽禾口酶。
SEQIDNO:31-延長酶共有結(jié)構(gòu)域1。
SEQIDNO:32-延長酶共有結(jié)構(gòu)域2。
SEQIDNO:33-延長酶共有結(jié)構(gòu)域3。
SEQIDNO:34-延長酶共有結(jié)構(gòu)域4。
SEQIDNO:35-延長酶共有結(jié)構(gòu)域5。
SEQIDNO:36-延長酶共有結(jié)構(gòu)域6。
SEQIDNO:37-去飽和酶共有結(jié)構(gòu)域1。
SEQIDNO:38-去飽和酶共有結(jié)構(gòu)域2。
SEQIDNO:39-去飽和酶共有結(jié)構(gòu)域3。
SEQIDNO:40-去飽和酶共有結(jié)構(gòu)域4。
SEQIDNO:41-71和78-92-寡核苷酸引物。
SEQIDNO:72-編碼鹽生巴夫藻Δ 4-去飽和酶的可讀框。
SEQIDNO:73-鹽生巴夫藻Δ 4-去飽和酶。
SEQIDNO:74-編碼擬南芥二?；视王；D(zhuǎn)移酶1的可讀框。
SEQIDNO:75-擬南芥二?；视王；D(zhuǎn)移酶1。
SEQIDNO:76-延長酶共有結(jié)構(gòu)域7。
SEQ ID NO :77-延長酶共有結(jié)構(gòu)域8。SEQ ID NO :93_ 編碼 Pavlova pinguis A 9_ 延長酶的可讀框。SEQ ID NO :94-Pavlova pinguis A9_ 延長酶。SEQ ID NO :95-編碼鹽生巴夫藻A9_延長酶的可讀框。SEQ ID NO :96_鹽生巴夫藻A 9_延長酶。SEQ ID NO :97_P19 病毒阻抑物。SEQ ID NO :98_V2 病毒阻抑物。SEQ ID NO :99_P38 病毒阻抑物。SEQ ID NO lOO-Pe-PO 病毒阻抑物。SEQ ID NO 101-RPV-P0 病毒阻抑物。SEQ ID NO :102-編碼P19病毒阻抑物的可讀框。SEQ ID NO :103-編碼V2病毒阻抑物的可讀框。SEQ ID NO :104-編碼P38病毒阻抑物的可讀框。SEQ ID NO :105-編碼Pe-PO病毒阻抑物的可讀框。SEQ ID NO 106-編碼RPV-P0病毒阻抑物的可讀框。SEQ ID NO 107-密碼子優(yōu)化的編碼微胞藻CCMP1545 ニ?；视王；D(zhuǎn)移酶2的
可讀框。SEQ ID NO :108-微胞藻CCMP1545 ニ酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶2。SEQ ID NO 109-1 -轉(zhuǎn)移核酸邊界序列。SEQ ID NO 125-用于在植物中表達(dá)微胞藻CCMP1545 A 6去飽和酶/ A 8去飽和酶 的經(jīng)密碼子優(yōu)化的可讀框。SEQ ID NO 126-用于在植物中表達(dá)塔胞藻CS-0140 A 6延長酶/ A 9延長酶的經(jīng) 密碼子優(yōu)化的可讀框(在3’端被截短并編碼功能性延長酶)。SEQ ID NO 127-用于在植物中表達(dá)鹽生巴夫藻A 5去飽和酶的經(jīng)密碼子優(yōu)化的
可讀框。SEQ ID NO 1 -用于在植物中表達(dá)塔胞藻CS-0140 A 5延長酶的經(jīng)密碼子優(yōu)化的
可讀框。SEQ ID NO :1 -用于在植物中表達(dá)鹽生巴夫藻A 4去飽和酶的經(jīng)密碼子優(yōu)化的 可讀框。發(fā)明詳述通用技術(shù)和定義除非另有說明，否則本說明書中所使用的科技術(shù)語均具有與本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培 養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、脂肪酸合成、轉(zhuǎn)基因植物、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域)普通技術(shù)人員 通常所理解的含義相同的含義。除非另有說明，本發(fā)明所采用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域 人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技木。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的描述和解釋，例如參見J.Perbal， A Practical Guiae to Molecular Cloning，Jonn Wiley ana Sons (1984) ； J. Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) ；T. A. Brown(編輯)，Essential Molecular Biology :A Practical Approach，Volumes land 2，IRL Press (1991) ；D. Μ. Glover and B. D. Hames (編輯)，DNA Cloning A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press(1995and 1996)；禾口 F. Μ· Ausubel 等 (編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and WileyHnterscience (1988，包括迄今所有的更新版)；Ed Harlow and David Lane (編輯)Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)；禾口 J. Ε· Coligan 等(編輯)Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (包括迄今所有的更新版)，通過引用將上述文獻(xiàn)并入本申請。詵定的定義在本文中，術(shù)語"脂肪酸"指的是羧酸(有機酸)，通常具有長的脂肪族尾部，可以是飽和的或不飽和的。典型地，脂肪酸具有碳碳鍵連接的鏈，其長度為至少8個碳原子， 更優(yōu)選地長度為至少12個碳。絕大多數(shù)天然存在的脂肪酸具有偶數(shù)個碳原子，因為它們的生物合成涉及具有2個碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以是游離狀態(tài)的(非酯化的)或者是酯化的形式，例如作為甘油三酯、甘油二酯、單?；视王サ牟糠帧Ⅴ；o酶A(硫酯)結(jié)合型或其他結(jié)合形式。脂肪酸可酯化為磷脂，例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油的形式?！帮柡椭舅?在其鏈上不含有任何雙鍵或其他官能團(tuán)。術(shù)語"飽和"指的是氫，其中所有的碳(除羧基[-C00H]之外)均含有盡可能多的氫。換言之，ω端含有3個氫(CH3-)而鏈內(nèi)的各個碳含有2個氫(-CH2-)?！安伙柡椭舅?與飽和脂肪酸形式相似，不同之處為沿著鏈存在一或多個烯烴官能團(tuán)，每一烯烴將鏈中的單鍵的〃 -CH2-CH2-"部分置換為雙鍵的〃 -CH = CH-"部分 (即，與另一碳雙鍵連接的碳)。鏈中連接于該雙鍵任一側(cè)的2個相鄰碳原子可以順式或反式構(gòu)型存在。在本文中，術(shù)語“單不飽和脂肪酸”指的是這樣的脂肪酸，其碳鏈中包含至少12個碳原子且鏈中僅有一個烯烴基(碳碳雙鍵)。在本文中，術(shù)語“多不飽和脂肪酸”或"PUFA" 指的是這樣的脂肪酸，其碳鏈中包含至少12個碳原子和至少2個烯烴基(碳碳雙鍵)。在本文中，術(shù)語"長鏈多不飽和脂肪酸”或"LC-PUFA"指的是這樣的脂肪酸，其碳鏈中包含至少20個碳原子和至少2個碳碳雙鍵，因此也包括VLC-PUFA。在本文中，術(shù)語"極長鏈多不飽和脂肪酸"和"VLC-PUFA"指的是這樣的脂肪酸，其碳鏈中包含至少 22個碳原子和至少3個碳碳雙鍵。通常，脂肪酸碳鏈的碳原子數(shù)涉及的是非分支碳鏈。如果碳鏈?zhǔn)欠种У?，則碳原子數(shù)不包括側(cè)基碳原子。在一個實施方式中，所述長鏈多不飽和脂肪酸ω 3脂肪酸，S卩脂肪酸自甲基端開始的第三個碳碳鍵發(fā)生去飽和(碳碳雙鍵)。在另一個實施方式中，所述長鏈多不飽和脂肪酸ω6脂肪酸，S卩脂肪酸自甲基端開始的第六個碳碳鍵發(fā)生去飽和(碳碳雙鍵)。在進(jìn)一步的實施方式中，所述長鏈多不飽和脂肪酸選自 花生四烯酸(ARA，20:4 Δ 5，8，11，14 ； ω 6)、二十碳四烯酸(ΕΤΑ，20:4 Δ 8，11，14，17，ω 3)、 二十碳五烯酸(ΕΡΑ，20:5 Δ 5，8，11，14，17 ； ω 3)、二十二碳五烯酸(DPA，22 5 Δ 7，10，13， 16,19, ω3)、或二十二碳六烯酸(DHA，22:6A4，7，10，13，16，19，ω 3)。LC-PUFA 也可以是雙高-Y-亞油酸(DGLA)或二十碳三烯酸(ETrA，20:3All，14，17，ω 3)。顯然，本發(fā)明所產(chǎn)生的LC-PUFA可以是任何或全部上述各項的混合物，并可包括其他LC-PUFA或任何這些 LC-PUFA的衍生物。在優(yōu)選的實施方式中，ω 3脂肪酸是EPA、DPAjP /或DHA，優(yōu)選地，EPA和/或DPA，或優(yōu)選地，DPA和/或DHA。此外，在本文中，術(shù)語"長鏈多不飽和脂肪酸"和"極長鏈多不飽和脂肪酸"指的是游離狀態(tài)的(非酯化的)或者是酯化的形式的脂肪酸，例如作為甘油三酯、甘油二酯、 單?；视王サ牟糠?、?；o酶A(硫酯)結(jié)合型或其他結(jié)合形式。脂肪酸可酯化為磷脂， 例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油的形式。因此，LC-PUFA可以混合物的形式存在于細(xì)胞內(nèi)或提取自細(xì)胞、組織或生物體的純化的油或脂質(zhì)中。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供的油包含至少75%或85%的三?；视停溆嗖糠忠云渌问降闹|(zhì)(例如本文中所提到的那些)存在，至少所述的三酰基甘油包含LC-PUFA。所述油可被進(jìn)一步純化或處理，例如以強堿水解去除游離脂肪酸或被分級、 蒸餾等等?？捎糜诒景l(fā)明的去飽和酶、延長酶和?；D(zhuǎn)移酶蛋白及其編碼基因是本領(lǐng)域已知的或是其同源物或衍生物。表1列出了這些基因的實例及其編碼的蛋白質(zhì)的大小。已被發(fā)現(xiàn)參與LC-PUFA生物合成的去飽和酶均屬于所謂的“前端”去飽和酶。
權(quán)利要求
1.一種重組細(xì)胞，其包含編碼具有Δ 5延長酶活性的脂肪酸延長酶的外源性多核苷酸，其中當(dāng)所述延長酶由所述細(xì)胞、優(yōu)選植物細(xì)胞中的所述外源性多核苷酸表達(dá)時，所述延長酶對EPA具有活性，以至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的效率產(chǎn)生DPA。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述延長酶包含SEQID NO :6所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :6具有至少47%相同性的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞，其還包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i)Δ 8去飽和酶和/或Δ 6去飽和酶，ii)Δ 9延長酶和/或Δ 6延長酶，iii)Δ 5去飽和酶，以及iv)任選存在的Δ4去飽和酶和/或ω 3去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子。
4.一種重組細(xì)胞，其包含編碼具有ω 3去飽和酶活性的脂肪酸去飽和酶的外源性多核苷酸，其中當(dāng)所述去飽和酶由所述細(xì)胞中的所述外源性多核苷酸表達(dá)時，所述去飽和酶能夠進(jìn)行以下至少一種去飽和作用將ARA去飽和化為EPAjf DGLA去飽和化為ETAjf GLA 去飽和化為SDAjf ARA去飽和化為EPA并將DGLA去飽和化為ETAjf ARA去飽和化為EPA 并將GLA去飽和化為SDA、或所有這三種去飽和作用。
5.權(quán)利要求4的細(xì)胞，其中所述去飽和酶是前端去飽和酶。
6.權(quán)利要求4或5的細(xì)胞，其中所述去飽和酶對?；溨芯哂兄辽偃齻€碳碳雙鍵的 C20脂肪酸具有Δ 17去飽和酶活性，優(yōu)選地對ARA具有Δ 17去飽和酶活性。
7.權(quán)利要求4至6中任一項的細(xì)胞，其中所述去飽和酶對酰基鏈中具有三個碳碳雙鍵的C18脂肪酸具有Δ 15去飽和酶活性，優(yōu)選地對GLA具有Δ 15去飽和酶活性。
8.權(quán)利要求4至7中任一項的細(xì)胞，其中所述去飽和酶對?；o酶A底物的活性高于對相應(yīng)的?；?PC底物的活性。
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其中所述?；o酶A底物是ARA-CoA，而所述?；?PC底物包含位于PC的sn-2位置的ARA。
10.權(quán)利要求4至9中任一項的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，且當(dāng)所述去飽和酶由所述細(xì)胞中的所述外源性多核苷酸表達(dá)時，所述去飽和酶對ARA具有活性，以至少40%的效率產(chǎn)生EPA。
11.權(quán)利要求4至10中任一項的細(xì)胞，其中所述去飽和酶包含SEQIDN0:15、17或20 所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ IDNO 15具有至少35%相同性的氨基酸序列、與SEQ ID NO :17具有至少60%相同性的氨基酸序列和/或與SEQ ID N0:20具有至少60%相同性的氨基酸序列。
12.—種重組細(xì)胞，其包含編碼具有△ 6去飽和酶活性的脂肪酸去飽和酶的外源性多核苷酸，其中所述去飽和酶進(jìn)一步具有至少兩種、優(yōu)選全部三種以下特性i)對作為脂肪酸底物的ALA的Δ 6去飽和酶活性高于對LA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣， )對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去飽和酶活性高于對作為脂肪酸底物的連接于PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，和iii)對ETrA具有Δ 8去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。
13.—種重組細(xì)胞，其包含編碼具有△ 6去飽和酶活性的脂肪酸去飽和酶的外源性多核苷酸，其中所述去飽和酶對ω 3底物的活性高于對相應(yīng)的ω 6底物的活性，且其中當(dāng)所述去飽和酶由所述細(xì)胞中的所述外源性多核苷酸表達(dá)時，所述去飽和酶對ALA具有活性，以至少5%、至少7.5%、或至少10%的效率產(chǎn)生SDA，或當(dāng)所述去飽和酶在酵母細(xì)胞中表達(dá)時，其以至少35%的效率產(chǎn)生SDA。
14.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所述去飽和酶對脂肪酸底物ALA的Δ6去飽和酶活性高于對LA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。
15.權(quán)利要求12或14的細(xì)胞，其中所述去飽和酶對作為底物的ALA的Δ6去飽和酶活性是其對作為底物的LA的Δ 6去飽和酶活性的至少大約2倍、至少3倍、至少4倍、或至少 5倍，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。
16.權(quán)利要求13至15中任一項的細(xì)胞，其中所述去飽和酶對作為脂肪酸底物的 ALA-CoA的活性高于對作為脂肪酸底物的連接至PC的sn-2位置的ALA的活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。
17.權(quán)利要求12或16的細(xì)胞，其中所述去飽和酶對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ6 去飽和酶活性是其對作為脂肪酸底物的連接至PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性的至少大約5倍或至少10倍，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。
18.權(quán)利要求12至17中任一項的細(xì)胞，其中所述去飽和酶是前端去飽和酶。
19.權(quán)利要求12至18中任一項的細(xì)胞，其還包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ 6延長酶， ) Δ 5去飽和酶，iii)Δ5延長酶，和iv)任選存在的Δ4去飽和酶和/或ω 3去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子。
20.權(quán)利要求12至19中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ6去飽和酶對ETA不具有可檢測到的Δ 5去飽和酶活性。
21.權(quán)利要求12至20中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ6去飽和酶包含SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ IDNO 10具有至少77%相同性的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求12至21中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ6去飽和酶包含SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :8具有至少67%相同性的氨基酸序列并具有Δ 8去飽和酶活性。
23.—種重組細(xì)胞，其包含編碼二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶的外源性多核苷酸，其中所述二?；视王；D(zhuǎn)移酶包含SEQ ID NO :108所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO 108具有至少相同性的氨基酸序列。
24.一種重組細(xì)胞，其包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ 9延長酶， ) Δ 8去飽和酶，iii)Δ 5去飽和酶，iv)任選存在的△5延長酶，和ν)如果存在Δ 5延長酶，則任選存在的Δ 4去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，且其中所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸有至少15%、至少20%、或至少25%在它們的?；溨邪辽?0個碳和至少3個碳碳雙鍵。
25.權(quán)利要求對的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)脂肪酸中的ARA、EPA、DPA和DHA總計占所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸的至少15%、至少20%、或至少25%。
26.權(quán)利要求1至25中任一項的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞將油酸轉(zhuǎn)換為二十碳烯酸 (C20:l)的能力與野生型植物相比是降低的，和/或在所述細(xì)胞中有低于5%的油酸被轉(zhuǎn)換為二十碳烯酸。
27.權(quán)利要求沈的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸具有低于1%的C20 1。
28.權(quán)利要求1至27中任一項的細(xì)胞，其中與野生型細(xì)胞相比，所述細(xì)胞具有降低的內(nèi)源性Δ 15去飽和酶活性，和/或所述細(xì)胞中有低于10%的LA被轉(zhuǎn)換為ALA。
29.權(quán)利要求觀的細(xì)胞，其中所述內(nèi)源性Δ15去飽和酶對?；?PC底物的活性高于對相應(yīng)的?；o酶A底物的活性，優(yōu)選地其中所述?；荓A。
30.權(quán)利要求1至四中任一項的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包括與缺乏所述外源性多核苷酸的相應(yīng)細(xì)胞相比，其將GLA轉(zhuǎn)換為SDA和/或?qū)RA轉(zhuǎn)換為EPA的轉(zhuǎn)換是增加的。
31.權(quán)利要求1至30中任一項的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)脂肪酸中的DHA的量占所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸的至少3 %、至少5 %、或至少10 %。
32.權(quán)利要求1至31中任一項的細(xì)胞，其中LA轉(zhuǎn)換為ARA和/或ALA轉(zhuǎn)換為EPA的效率是至少80 %或至少90 %。
33.權(quán)利要求對至32中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ9延長酶包含SEQIDΝ0:22所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :22具有至少80%相同性的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求M至33中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ8去飽和酶包含SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ IDNO 24具有至少80%相同性的氨基酸序列。
35.權(quán)利要求M至34中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ5去飽和酶包含SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ IDNO 26具有至少80%相同性的氨基酸序列。
36.一種重組細(xì)胞，其包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i)Δ 6延長酶和/或Δ 9延長酶，ii)Δ 6去飽和酶和/或Δ 8去飽和酶，iii)Δ 5去飽和酶，iv)Δ 5延長酶，ν) Δ 4去飽和酶，和vi)任選存在的二?；视王；D(zhuǎn)移酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，特征在于具有一種或多種或全部以下特性a)將ALA轉(zhuǎn)換為EPA、DPA或DHA的效率是至少17.3%、或至少23%，b)將ALA轉(zhuǎn)換為DPA或DHA的效率是至少15.4%或至少21 %，c)將ALA轉(zhuǎn)換為DHA的效率是至少9.5%、或至少10.8%，和d)將EPA轉(zhuǎn)換為DHA的效率是至少45%、或至少50%，且優(yōu)選地進(jìn)一步特征在于所述細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸中有至少4%是DHA。
37.權(quán)利要求36的細(xì)胞，其中摻入到細(xì)胞內(nèi)的三?；视椭械目傊舅嶂杏兄辽?%、 至少11%或至少15%是DHA。
38.權(quán)利要求36或37的細(xì)胞，其中DHA占細(xì)胞內(nèi)全部SDA、ETA、EPA、DPA和DHA的 20-65 %，優(yōu)選地占 40-65 %。
39.權(quán)利要求36至38中任一項的細(xì)胞，其中細(xì)胞內(nèi)的ω3脂肪酸中的0.1-25%是SDA、 0. 1-10%是 ΕΤΑ、0. 1-60%是 ΕΡΑ、0. 1-50%是 DPA、且 30-95%是 DHA，或其中細(xì)胞內(nèi)的 ω 3 脂肪酸中的 0. 1-25%是 SDA、0. 1-10%是 ΕΤΑ、0. 1-50%是 ΕΡΑ、0. 1-50%是 DPA、且 40-95% 是 DHA。
40.權(quán)利要求36至39中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ4去飽和酶包含SEQ ID NO 73所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ IDNO 73具有至少80%相同性的氨基酸序列。
41.一種重組細(xì)胞，其包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i)Δ 6延長酶和/或Δ 9延長酶，ii)Δ 6去飽和酶和/或Δ 8去飽和酶，iii)Δ 5去飽和酶，iv)Δ 5延長酶，和vi)任選存在的二?；视王；D(zhuǎn)移酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，特征在于具有一種或多種或全部以下特性a)將ALA轉(zhuǎn)換為EPA或DPA的效率是至少17.3%、或至少23%，且b)將ALA轉(zhuǎn)換為DPA的效率是至少15.4%、或至少21%，且優(yōu)選地進(jìn)一步特征在于所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸中有至少4%是DPA。
42.權(quán)利要求41的細(xì)胞，其中摻入到細(xì)胞內(nèi)的三?；视椭械目傊舅嶂杏兄辽?%、 至少11%或至少15%是DPA。
43.權(quán)利要求41或42的細(xì)胞，其中DPA占細(xì)胞內(nèi)全部SDA、ETA、EPA和DPA的20_65%， 優(yōu)選地占40-65%。
44.權(quán)利要求41至43中任一項的細(xì)胞，其中細(xì)胞內(nèi)的ω3脂肪酸中的0.1_35%是 SDA,0. 1-15%是ΕΤΑ、0. 1-60%是EPA、且30-75%是DPA，或其中細(xì)胞內(nèi)的ω3脂肪酸中的 0. 1-；35%是 SDA、0. 1-15%是 ΕΤΑ、0. 1-50%是 EPA、且 40-75%是 DPA。
45.權(quán)利要求36至44中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ6延長酶包含SEQID NO 4所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :4具有至少55%相同性的氨基酸序列。
46.權(quán)利要求36至45中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ6去飽和酶包含SEQ ID Ν0:8所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :8具有至少67%相同性的氨基酸序列。
47.權(quán)利要求36至46中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ5去飽和酶包含SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ IDNO 26具有至少80%相同性的氨基酸序列。
48.權(quán)利要求36至47中任一項的細(xì)胞，其中所述Δ5延長酶包含SEQID NO 6所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :6具有至少47%相同性的氨基酸序列。
49.權(quán)利要求36至48中任一項的細(xì)胞，其中所述二?；视王；D(zhuǎn)移酶包含SEQID Ν0:75或SEQ ID NO :108所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :75和/ 或SEQ ID NO :108具有至少80%相同性的氨基酸序列。
50.權(quán)利要求1至49中任一項的細(xì)胞，其還包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ 17去飽和酶， ) Δ 15去飽和酶，和/或iii) Δ 12去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子。
51.權(quán)利要求1至50中任一項的細(xì)胞，其中所述去飽和酶中的一種或多種或全部去飽和酶對?；o酶A底物的活性高于對相應(yīng)的酰基-PC底物的活性。
52.一種重組細(xì)胞，其包含編碼具有Δ 6延長酶和Δ 9延長酶活性的脂肪酸延長酶的外源性多核苷酸，其中所述延長酶的Δ6延長酶活性高于Δ9延長酶活性。
53.權(quán)利要求52的細(xì)胞，其中所述延長酶轉(zhuǎn)換SDA以產(chǎn)生ETA的效率是至少50%或至少60%，和/或轉(zhuǎn)換ALA以產(chǎn)生ETrA的效率是至少6%或至少9%。
54.權(quán)利要求52或53的細(xì)胞，其中所述延長酶的Δ6延長酶活性是Δ 9延長酶活性的至少大約6. 5倍。
55.權(quán)利要求52至M中任一項的細(xì)胞，其中所述延長酶不具有可檢測到的Δ5延長酶活性。
56.權(quán)利要求52至55中任一項的細(xì)胞，其中所述延長酶包含SEQID NO :4所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :4具有至少55%相同性的氨基酸序列。
57.權(quán)利要求52至56中任一項的細(xì)胞，其還包含編碼以下各項的外源性多核苷酸i) Δ 8去飽和酶和/或Δ 6去飽和酶， ) Δ 5去飽和酶，iii)Δ5延長酶，和iv)任選存在的Δ4去飽和酶和/或ω 3去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子。
58.一種重組細(xì)胞，其包含編碼具有Δ 5去飽和酶活性的脂肪酸去飽和酶的外源性多核苷酸，其中所述去飽和酶包含SEQ ID NO :13所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與 SEQ ID NO 13具有至少53%相同性的氨基酸序列。
59.一種重組細(xì)胞，其包含編碼具有Δ 9延長酶活性的脂肪酸延長酶的外源性多核苷酸，其中所述延長酶包含SEQ ID NO :28、94和96中任一序列所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、與SEQ ID NO 具有至少81%相同性的氨基酸序列、或與SEQ ID NO :94和/ 或SEQ ID NO :96具有至少50%相同性的氨基酸序列。
60.權(quán)利要求59的細(xì)胞，其中所述Δ9延長酶包含SEQ ID NO 94或SEQ ID NO 96所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID Ν0:94和/或SEQ ID NO :96具有至少 50%相同性的氨基酸序列，且其中所述延長酶對ω6底物的活性高于對相應(yīng)的ω3底物的活性。
61.權(quán)利要求1至60中任一項的細(xì)胞，其中所述去飽和酶和/或延長酶可純化自微藻類。
62.權(quán)利要求1至61中任一項的細(xì)胞，其是真核細(xì)胞。
63.權(quán)利要求62的細(xì)胞，其是植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
64.權(quán)利要求63的細(xì)胞，其位于植物中和/或是成熟的植物種子細(xì)胞。
65.權(quán)利要求64的細(xì)胞，其中所述植物或植物種子分別是油料種子植物或油料種子。
66.權(quán)利要求1至65中任一項的細(xì)胞，其能夠合成長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，其中所述細(xì)胞衍生自不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞。
67.權(quán)利要求1至66中任一項的細(xì)胞，其進(jìn)一步包含編碼沉默阻抑物的外源性多核苷酸。
68.權(quán)利要求67的細(xì)胞，其中所述編碼沉默阻抑物的外源性多核苷酸可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子。
69.權(quán)利要求68的細(xì)胞，其中所述植物貯藏器官特異性啟動子是種子特異性啟動子。
70.獲得能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的細(xì)胞的方法，所述方法包括a)將編碼脂肪酸ω3去飽和酶活性的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞，其中所述多核苷酸可操縱地連接于能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇能夠進(jìn)行以下至少一種去飽和作用的細(xì)胞將ARA去飽和化為EPAjfDGLA去飽和化為ETAjf GLA去飽和化為SDAjf ARA去飽和化為EPA并將DGLA去飽和化為ETAjf ARA去飽和化為EPA并將GLA去飽和化為SDA、或所有這三種去飽和作用。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所選擇的細(xì)胞是權(quán)利要求4至11中任一項所定義的細(xì)胞。
72.獲得能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的細(xì)胞的方法，所述方法包括a)將編碼脂肪酸Δ5延長酶的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述 LC-PUFA的細(xì)胞，其中所述多核苷酸可操縱地連接于能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇其中所述Δ5延長酶對EPA具有活性并以至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的效率產(chǎn)生DPA的細(xì)胞。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所選擇的細(xì)胞是權(quán)利要求1至3中任一項所定義的細(xì)胞。
74.獲得能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的細(xì)胞的方法，所述方法包括a)將編碼脂肪酸△6去飽和酶的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述 LC-PUFA的細(xì)胞，其中所述多核苷酸可操縱地連接于能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇具有至少兩種、優(yōu)選全部三種以下特性的細(xì)胞i)對作為脂肪酸底物的ALA的Δ 6去飽和酶活性高于對LA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣， )對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去飽和酶活性高于對作為脂肪酸底物的連接于PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，和iii)對ALA具有Δ 6去飽和酶活性并對ETrA具有Δ 8去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。
75.獲得能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的細(xì)胞的方法，所述方法包括a)將編碼脂肪酸△6去飽和酶的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述 LC-PUFA的細(xì)胞，其中所述多核苷酸可操縱地連接于能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇具有Δ6去飽和酶活性的細(xì)胞，所述Δ 6去飽和酶對ω 3底物的活性高于對相應(yīng)的ω 6底物的活性，且所述Δ 6去飽和酶對ALA具有活性并以至少5%、至少7.5%、或至少10%的效率產(chǎn)生SDA，或當(dāng)其在酵母細(xì)胞中表達(dá)時以至少35%的效率產(chǎn)生SDA。
76.權(quán)利要求74或權(quán)利要求75的方法，其中所選擇的細(xì)胞是權(quán)利要求12至22中任一項所定義的細(xì)胞。
77.獲得能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的細(xì)胞的方法，所述方法包括a)將編碼以下各項的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞i) Δ 9延長酶， ) Δ 8去飽和酶，iii)Δ 5去飽和酶，iv)任選存在的△5延長酶，和ν)如果存在Δ 5延長酶，則任選存在的Δ 4去飽和酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，C)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇其中總脂肪酸有至少15%、至少20%或至少25%在它們的?；溨邪辽?20個碳和至少3個碳碳雙鍵的細(xì)胞。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所選擇的細(xì)胞是權(quán)利要求M至35中任一項所定義的細(xì)胞。
79.獲得能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的細(xì)胞的方法，所述方法包括a)將編碼以下各項的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞i)Δ 6延長酶和/或Δ 9延長酶，ii)Δ 6去飽和酶和/或Δ 8去飽和酶，iii)Δ 5去飽和酶，iv)Δ 5延長酶，ν) Δ 4去飽和酶，和vi)任選存在的二?；视王；D(zhuǎn)移酶，其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇具有一種或多種或全部以下特性的細(xì)胞1)將ALA轉(zhuǎn)換為EPA、DPA或DHA的效率是至少17.3%、或至少23% ；2)將ALA轉(zhuǎn)換為DPA或DHA的效率是至少15.4%、或至少21 % ；3)將ALA轉(zhuǎn)換為DHA的效率是至少9.5%、或至少10. 8% ；和4)將EPA轉(zhuǎn)換為DHA的效率是至少45%、或至少50%；且優(yōu)選地進(jìn)一步特征在于所述細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸中有至少4%是DHA。
80.獲得能夠合成一或多種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的細(xì)胞的方法，所述方法包括a)將編碼以下各項的外源性多核苷酸引入細(xì)胞，優(yōu)選地是不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞i)Δ 6延長酶和/或Δ 9延長酶，ii)Δ 6去飽和酶和/或Δ 8去飽和酶，iii)Δ 5去飽和酶，iv)Δ 5延長酶，和vi)任選存在的二?；视王；D(zhuǎn)移酶其中每一多核苷酸可操縱地連接于一或多種能夠在所述細(xì)胞中指導(dǎo)所述多核苷酸表達(dá)的啟動子，b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述外源性多核苷酸，c)分析所述細(xì)胞的脂肪酸組成，和d)選擇具有一種或多種或全部以下特性的細(xì)胞a)將ALA轉(zhuǎn)換為EPA或DPA的效率是至少17.3%、或至少23%，且b)將ALA轉(zhuǎn)換為DPA的效率是至少15.4%、或至少21%，且優(yōu)選地進(jìn)一步特征在于所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸中有至少4%是DPA。
81.權(quán)利要求70至80中任一項的方法，其中所述外源性多核苷酸穩(wěn)定整合到所述細(xì)胞的基因組中。
82.權(quán)利要求81的方法，還包括從步驟a)的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物的步驟。
83.權(quán)利要求70至80中任一項的方法，其中所述外源性多核苷酸在所述細(xì)胞中瞬時表達(dá)。
84.權(quán)利要求70至83中任一項的方法，其中所述細(xì)胞是植物的葉細(xì)胞。
85.選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子的方法，包括i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼多肽，所述多肽可能是脂肪酸去飽和酶； )將所述核酸分子引入細(xì)胞，其中所述啟動子在所述細(xì)胞中具有活性；iii)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子；iv)分析所述細(xì)胞中的脂肪酸組成；和ν)基于以下事實選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子所述多肽具有ω3去飽和酶活性并能夠進(jìn)行以下至少一種去飽和作用將ARA去飽和化為EPAjf DGLA去飽和化為 ETAjf GLA去飽和化為SDAjf ARA去飽和化為EPA并將DGLA去飽和化為ETAjf ARA去飽和化為EPA并將GLA去飽和化為SDA、或所有這三種去飽和作用。
86.權(quán)利要求85的方法，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQID NO 15具有至少35%的相同性、與SEQ ID NO 17具有至少60%的相同性、和/或與SEQ ID NO 20具有至少60% 的相同性。
87.選擇參與脂肪酸延長作用的核酸分子的方法，包括i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼多肽，所述多肽可能是脂肪酸延長酶， )將所述核酸分子引入細(xì)胞，其中所述啟動子在所述細(xì)胞中具有活性，iii)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子；iv)分析所述細(xì)胞中的脂肪酸組成；和ν)基于以下事實選擇參與脂肪酸延長作用的核酸分子所述多肽具有△ 5延長酶活性且其轉(zhuǎn)換EPA產(chǎn)生DPA的效率是至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。
88.權(quán)利要求87的方法，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQID NO :6具有至少47%的相同性。
89.選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子的方法，包括i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼多肽，所述多肽可能是脂肪酸去飽和酶， )將所述核酸分子引入細(xì)胞，其中所述啟動子在所述細(xì)胞中具有活性，iii)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子；iv)分析所述細(xì)胞中的脂肪酸組成；和ν)基于以下事實選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子所述多肽具有△ 6去飽和酶活性并具有至少兩種、優(yōu)選全部三種以下特性a)對作為脂肪酸底物的ALA的Δ6去飽和酶活性高于對LA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，b)對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ6去飽和酶活性高于對作為脂肪酸底物的連接于 PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，和c)對ALA具有Δ8去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。
90.權(quán)利要求89的方法，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQID NO :10具有至少77% 的相同性和/或與SEQ ID NO 8具有至少67%的相同性。
91.選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子的方法，包括i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼多肽，所述多肽可能是脂肪酸去飽和酶， )將所述核酸分子引入細(xì)胞，其中所述啟動子在所述細(xì)胞中具有活性，iii)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子；iv)分析所述細(xì)胞中的脂肪酸組成；和ν)基于以下事實選擇參與脂肪酸去飽和作用的核酸分子所述多肽具有△ 6去飽和酶活性和Δ 8去飽和酶活性。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQID NO :8具有至少67%的相同性。
93.權(quán)利要求85、86、或89-92中任一項的方法，其中步驟(ν)包括選擇編碼對酰基輔酶A底物具有活性的去飽和酶的核酸分子或編碼前端去飽和酶的核酸分子。
94.前述任一項權(quán)利要求中所定義的外源性多核苷酸的組合，當(dāng)它們用于產(chǎn)生重組細(xì)胞時，它們在重組細(xì)胞中表達(dá)至少兩種脂肪酸去飽和酶和兩種脂肪酸延長酶的組合、和/ 或在重組細(xì)胞中產(chǎn)生LC-PUFA。
95.基本上純化的和/或重組脂肪酸ω3去飽和酶，當(dāng)由外源性多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)時，其能夠進(jìn)行以下至少一種去飽和作用將ARA去飽和化為EPAjf DGLA去飽和化為ΕΤΑ、 將GLA去飽和化為SDAjf ARA去飽和化為EPA并將DGLA去飽和化為ETAjf ARA去飽和化為EPA并將GLA去飽和化為SDA、或所有這三種去飽和作用。
96.權(quán)利要求95的ω3去飽和酶，其特征在于具有如權(quán)利要求4至11中任一項所定義的任何一或多種特性。
97.基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ5延長酶，其中當(dāng)由外源性多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)時，所述延長酶對EPA具有活性，以至少60 %、至少65 %、至少70 %或至少75 %的效率產(chǎn)生 DPA。
98.權(quán)利要求97的Δ5延長酶，其特征在于具有如權(quán)利要求1至3中任一項所定義的任何一或多種特性。
99.基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ6去飽和酶，其中所述去飽和酶進(jìn)一步具有至少兩種、優(yōu)選全部三種以下特性i)對作為脂肪酸底物的ALA的Δ 6去飽和酶活性高于對LA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣， )對作為脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去飽和酶活性高于對作為脂肪酸底物的連接于PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣，和iii)對ETrA具有Δ 8去飽和酶活性，優(yōu)選地在植物細(xì)胞中是這樣。
100.基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ6去飽和酶，其中所述去飽和酶對ω 3底物的活性高于對相應(yīng)的ω 6底物的活性，且其中所述去飽和酶對ALA具有活性，當(dāng)所述去飽和酶由外源性多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)時以至少5%、至少7.5%、或至少10%的效率產(chǎn)生SDA，或當(dāng)其在酵母細(xì)胞中表達(dá)時以至少35%的效率產(chǎn)生SDA。
101.權(quán)利要求99或100的Δ6去飽和酶，其特征在于具有如權(quán)利要求12至22中任一項所定義的任何一或多種特性。
102.基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ6延長酶和Δ 9延長酶，其中所述延長酶的Δ 6 延長酶活性高于△ 9延長酶活性。
103.權(quán)利要求102的Δ6延長酶和Δ 9延長酶，其特征在于具有如權(quán)利要求53至56 中任一項所定義的任何一或多種特性。
104.基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ5去飽和酶，其包含SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :13具有至少53%相同性的氨基酸序列。
105.基本上純化的和/或重組脂肪酸Δ9延長酶，其包含SEQ ID NO :28、94和96任一序列所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、與SEQ ID NO 具有至少81%相同性的氨基酸序列、或與SEQ ID NO 94和/或SEQ ID NO 96具有至少50%相同性的氨基酸序列。
106.基本上純化的和/或重組二?；视王；D(zhuǎn)移酶，其包含SEQID NO :108所示的氨基酸序列、其生物學(xué)活性片段、或與SEQ ID NO :108具有至少相同性的氨基酸序列。
107.權(quán)利要求95至106中任一項的去飽和酶或延長酶，其中所述去飽和酶和/或延長酶可純化自微藻類。
108.分離的和/或外源性多核苷酸，其包含i)選自SEQ ID NO :3、5、7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107、或 125 至 129 中任一序列的核苷酸序列，ii)編碼權(quán)利要求95至107中任一項的去飽和酶或延長酶的核苷酸序列，iii)與SEQ ID NO :3、5、7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107 或 125 至 129 中的一或多個序列具有至少50%相同性的核苷酸序列，和/或iv)在嚴(yán)格性條件下與i)至iii)中的任一序列雜交的序列。
109.用于整合到和/或已整合到植物細(xì)胞基因組中的DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一簇至少三個編碼調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成的蛋白質(zhì)的可讀框，優(yōu)選地每一蛋白質(zhì)是脂肪酸去飽和酶或脂肪酸延長酶，其中具有相同轉(zhuǎn)錄方向的各可讀框間隔至少750bp、至少 1, OOObp或至少l，250bp，且至少有兩個可讀框具有不同的轉(zhuǎn)錄方向，其中每一可讀框可操縱地連接于在植物細(xì)胞中具有活性的啟動子，且每一啟動子可獨立地是相同的或不同的。
110.權(quán)利要求109的DNA構(gòu)建體，其中至少有兩個啟動子是不同的。
111.權(quán)利要求109或權(quán)利要求110的DNA構(gòu)建體，其中每一可讀框可操縱地連接于異源性5’前導(dǎo)序列，每一前導(dǎo)序列可獨立地是相同的或不同的，其中與特定可讀框的天然存在的5’前導(dǎo)序列相比，每一異源性5’前導(dǎo)序列使翻譯效率提高。
112.權(quán)利要求111的DNA構(gòu)建體，其中所述異源性5’前導(dǎo)序列是煙草花葉病毒 (TMV) 5’前導(dǎo)序列。
113.權(quán)利要求109至112中任一項的DNA構(gòu)建體，其中所述蛋白質(zhì)是延長酶和/或去飽和酶。
114.權(quán)利要求109至113中任一項的DNA構(gòu)建體，其僅具有三個或四個被翻譯成蛋白質(zhì)的可讀框。
115.載體，其包含權(quán)利要求108的多核苷酸和/或權(quán)利要求109至114中任一項的DNA構(gòu)建體。
116.權(quán)利要求115的載體，其中所述多核苷酸可操縱地連接于啟動子。
117.產(chǎn)生權(quán)利要求95至107中任一項的去飽和酶或延長酶的方法，所述方法包括在細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)權(quán)利要求108的多核苷酸、權(quán)利要求109至114中任一項的 DNA構(gòu)建體和/或權(quán)利要求115或權(quán)利要求116的載體。
118.以至少三種不同的外源性多核苷酸瞬時轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法，所述方法包括i)獲得至少a)第一細(xì)菌，其包含包含第一外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸，b)第二細(xì)菌，其包含包含第二外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸，和c)第三細(xì)菌，其包含包含第三外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸，和 )將所述細(xì)胞與步驟i)的細(xì)菌接觸，其中每一染色體外轉(zhuǎn)移核酸從細(xì)菌轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中以產(chǎn)生瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其中每一外源性多核苷酸包含在所述細(xì)胞中具有活性的啟動子，其中每一啟動子可以獨立地是相同的或不同的，且其中至少有一種外源性多核苷酸編碼沉默阻抑物。
119.權(quán)利要求118的方法，其包括獲得所述細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞與第四細(xì)菌接觸，所述第四細(xì)菌包含包含第四外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。
120.權(quán)利要求119的方法，其包括獲得所述細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞與第五細(xì)菌接觸，所述第五細(xì)菌包含包含第五外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。
121.權(quán)利要求120的方法，其包括獲得所述細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞與第六細(xì)菌接觸，所述第六細(xì)菌包含包含第六外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。
122.權(quán)利要求121的方法，其包括獲得所述細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞與第七細(xì)菌接觸，所述第七細(xì)菌包含包含第七外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。
123.權(quán)利要求122的方法，其包括獲得所述細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞與第八細(xì)菌接觸，所述第八細(xì)菌包含包含第八外源性多核苷酸的染色體外轉(zhuǎn)移核酸。
124.篩選瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的所需活性的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求118至123 中任一項的方法并測試所述細(xì)胞的所需活性。
125.以至少六種不同的外源性多核苷酸轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的方法，所述方法包括i)獲得至少a)第一細(xì)菌，其包含第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸，所述第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸，和b)第二細(xì)菌，其包含不同于所述第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸的第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸，所述第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸， )將所述細(xì)胞與步驟i)的細(xì)菌接觸，和iii)任選地選擇被所述第一和第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸的外源性多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中每一所述第一和第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸的外源性多核苷酸由所述細(xì)菌轉(zhuǎn)移至所述細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中每一所述外源性多核苷酸包含啟動子，所述啟動子在所述細(xì)胞中或可由其衍生的細(xì)胞中具有活性，且其中每一啟動子可以獨立地是相同的或不同的。
126.權(quán)利要求125的方法，其中所述i)第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸只有3到6種、只有3 到5種、只有3到4種、只有4到6種、只有4到5種、或只有5到6種不同的外源性多核苷酸，且ii)第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸只有3到6種、只有3到5種、只有3到4種、只有4到6 種、只有4到5、或只有5到6種不同的外源性多核苷酸。
127.權(quán)利要求125或權(quán)利要求1 的方法，其中每一外源性多核苷酸編碼多肽，且其中各多肽是不同的。
128.權(quán)利要求125至127中任一項的方法，其中i)第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含兩種外源性多核苷酸，它們獨立地編碼選自如下一組的多肽Δ 6去飽和酶、Δ 12去飽和酶和Δ 15去飽和酶，和 )第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含編碼多肽的外源性多核苷酸，所述多肽是該組中的第三種酶。
129.權(quán)利要求125至1 中任一項的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，且所述方法還包括從所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物的步驟。
130.權(quán)利要求118至129中任一項的方法，其中每一外源性多核苷酸編碼形成酶途徑的一部分的酶或是此種酶的候選物。
131.權(quán)利要求118至130中任一項的方法，其中每一外源性多核苷酸編碼酶或是此種酶的候選物，所述酶參與脂肪酸合成、脂肪酸修飾、二?；视徒M裝、三?；视徒M裝、或其中兩種或更多種的組合。
132.權(quán)利要求118至131中任一項的方法，其中所述細(xì)菌選自土壤桿菌、根瘤菌、 苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、百脈根中慢生根瘤菌(Mezorhizobium Ioti)、弗氏志賀菌(Shigella flexneri)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、 豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)、單核細(xì)胞增多性李司忒菌(Listeria monocytogenes)> 大腸桿菌(Escherichia coli)、假結(jié)核病耳口爾森菌(Yersinia pseudotuberculosis)禾口小腸結(jié)腸炎耳口爾森菌(Yersinia enterocolitica)。
133.權(quán)利要求118至132中任一項的方法，其中所述染色體外轉(zhuǎn)移核酸是P-DNA、土壤桿菌T-DNA、或它們的組合。
134.權(quán)利要求118至133中任一項的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
135.權(quán)利要求118至134中任一項的方法，其中所述細(xì)胞是組織或器官的一部分。
136.權(quán)利要求135的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，所述組織或器官是葉、莖、根、分生組織、愈傷組織、或胚珠。
137.通過權(quán)利要求118至136中任一項的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。
138.產(chǎn)生以至少六種不同的外源性多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物的方法，所述方法包括i)獲得包含第一外源性基因組區(qū)的第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，所述第一外源性基因組區(qū)包含3、4、5、或6種不同的外源性多核苷酸， )獲得與所述第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物具有性親和性并包含第二外源性基因組區(qū)的第二種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，所述第二外源性基因組區(qū)不同于所述第一外源性基因組區(qū)并包含3、4、5、 或6種不同的外源性多核苷酸，iii)使所述第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物與所述第二種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物雜交，和iv)選擇由步驟iii)產(chǎn)生的包含所述第一和第二基因組區(qū)的植物或其子代，由此產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，其中每一所述外源性多核苷酸包含啟動子，所述啟動子在植物中具有活性，且其中每一啟動子可以獨立地是相同的或不同的。
139.權(quán)利要求138的方法，其中步驟i)包括通過以下步驟產(chǎn)生所述第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物a)將植物細(xì)胞與包含第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸的第一細(xì)菌接觸，所述第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸，b)從步驟a)的植物細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，和任選地c)產(chǎn)生來自步驟b)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的子代植物；和/或步驟ii)包括通過以下步驟產(chǎn)生所述第二種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物d)將植物細(xì)胞與包含第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸的第二細(xì)菌接觸，所述第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸，e)從步驟d)的植物細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，和任選地f)產(chǎn)生來自步驟e)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的子代植物。
140.產(chǎn)生以至少六種不同的外源性多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物的方法，所述方法包括 i)獲得包含第一外源性基因組區(qū)的第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物或植物部分，所述第一外源性基因組區(qū)包含3、4、5、或6種不同的外源性多核苷酸， )使所述第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物或植物部分的細(xì)胞接觸包含染色體外轉(zhuǎn)移核酸的細(xì)菌，所述染色體外轉(zhuǎn)移核酸包含三種、四種、五種或六種不同的外源性多核苷酸，iii)從所述細(xì)胞產(chǎn)生植物，且iv)任選地，選擇由步驟iii)產(chǎn)生的包含所述至少六種不同的外源性多核苷酸的植物。
141.細(xì)胞，其至少包含a)包含第一外源性多核苷酸的第一染色體外轉(zhuǎn)移核酸，b)包含第二外源性多核苷酸的第二染色體外轉(zhuǎn)移核酸，和c)包含第三外源性多核苷酸的第三染色體外轉(zhuǎn)移核酸。
142.轉(zhuǎn)基因植物或其子代或種子，其包含包含3、4、5、或6種不同的外源性多核苷酸的第一外源性基因組區(qū)，和包含3、4、5、或6種不同的外源性多核苷酸的第二外源性基因組區(qū)。
143.轉(zhuǎn)基因非人類生物體，其包含權(quán)利要求1至69、137或141中任一項的細(xì)胞。
144.權(quán)利要求143的生物體，其是轉(zhuǎn)基因植物。
145.種子，其包含權(quán)利要求1至69、137或141中任一項的細(xì)胞或得自權(quán)利要求142或權(quán)利要求144的轉(zhuǎn)基因植物。
146.從權(quán)利要求1至69、137或141中任一項的細(xì)胞、權(quán)利要求142的植物、權(quán)利要求143或144的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或權(quán)利要求145的種子產(chǎn)生或獲得的油。
147.權(quán)利要求146的油，其中所述油通過從油料種子提取油而獲得。
148.權(quán)利要求146或權(quán)利要求147的油，其是介花油(歐洲油菜(Brassicanapus)、 蕪菁(Brassica rapa))、芥子油(芥菜(Brassica juncea))、其他蕓苔油、葵花子油(向日賽(Helianthus annus) )>^ ( ^ (Linum usitatissimum)) >^ ( XsL (Glycine max))、紅花油(紅花(Carthamus tinctorius))、玉米油(玉蜀黍(Zea mays))、 煙草油(煙草(Nicotiana tabacum))、花生油(花生(Arachis hypogaea))、棕櫚油、棉籽油(陸地棉(Gossypium hirsutum))、椰子油(椰子(Cocos nucifera))、鱷梨油(鱷梨(Persea americana))、橄欖油(橄欖(Olea europaea))、腰果油(腰果(Anacardium occidentale))、夏威夷果油(夏威夷果(Macadamia intergrifolia))、扁桃仁油(扁桃 (Prunus amygdalus))或擬南芥籽油(擬南芥(Arabidopsis thaliana))。
149.從權(quán)利要求1至69、137或141中任一項的細(xì)胞、權(quán)利要求142的植物、權(quán)利要求 143或144的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或權(quán)利要求145的種子產(chǎn)生或獲得的脂肪酸。
150.產(chǎn)生含不飽和脂肪酸的油的方法，所述方法包括從權(quán)利要求1至69、137或141中任一項的細(xì)胞、權(quán)利要求142的植物、權(quán)利要求143或144的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或權(quán)利要求145的種子提取油。
151.組合物，其包含權(quán)利要求1至68、137或141中任一項的細(xì)胞、權(quán)利要求95至107 中任一項的去飽和酶或延長酶、權(quán)利要求108的多核苷酸、權(quán)利要求109至114中任一項的 DNA構(gòu)建體、權(quán)利要求115或權(quán)利要求116的載體、權(quán)利要求146至148中任一項的油或權(quán)利要求149的脂肪酸。
152.飼料、化妝品或化學(xué)制品，其包含權(quán)利要求1至69、137或141中任一項的細(xì)胞、權(quán)利要求142的植物、權(quán)利要求143或144的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、權(quán)利要求145的種子、權(quán)利要求146至148中任一項的油、和/或權(quán)利要求149的脂肪酸。
153.進(jìn)行去飽和酶反應(yīng)的方法，所述方法包括使與CoA酯化的多不飽和脂肪酸接觸權(quán)利要求4至22中任一項的去飽和酶。
154.基本上純化的抗體或其片段，其特異性結(jié)合權(quán)利要求95至107中任一項的去飽和酶或延長酶。
155.治療或預(yù)防可能從PUFA獲益的病癥的方法，所述方法包括給對象施用權(quán)利要求1 至68、137或141中任一項的細(xì)胞、權(quán)利要求95至107中任一項的去飽和酶或延長酶、權(quán)利要求108的多核苷酸、權(quán)利要求109至114中任一項的DNA構(gòu)建體、權(quán)利要求115或權(quán)利要求116的載體、權(quán)利要求142的植物、權(quán)利要求143或144的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、權(quán)利要求145的種子、權(quán)利要求146至148中任一項的油、權(quán)利要求149的脂肪酸和/或權(quán)利要求 152的飼料。
156.權(quán)利要求155的方法，其中所述病癥是心律失常、血管成形術(shù)、炎癥、哮喘、銀屑病、骨質(zhì)疏松癥、腎臟結(jié)石、AIDS、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克隆病、精神分裂癥、癌癥、胎兒酒精綜合征、注意力缺陷多動癥、囊性纖維化、苯丙酮尿癥、單相抑郁、攻擊敵意、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、冠心病、高血壓、糖尿病、肥胖、阿爾茨海默病、慢性阻塞性肺疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管成形術(shù)后再狹窄、濕疹、高血壓、血小板聚集、胃腸道出血、子宮內(nèi)膜異位癥、經(jīng)前期綜合征、肌痛腦脊髓炎、病毒感染后慢性疲勞或眼部疾病。
157.權(quán)利要求1至68、137或141中任一項的細(xì)胞、權(quán)利要求95至107中任一項的去飽和酶或延長酶、權(quán)利要求108的多核苷酸、權(quán)利要求109至114中任一項的DNA構(gòu)建體、 權(quán)利要求115或權(quán)利要求116的載體、權(quán)利要求142的植物、權(quán)利要求143或144的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、權(quán)利要求145的種子、權(quán)利要求146至148中任一項的油、權(quán)利要求149的脂肪酸和/或權(quán)利要求152的飼料在制備用于治療或預(yù)防可能從PUFA獲益的病癥的藥物中的用途。
158.植物細(xì)胞，其包含i)編碼沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子，和 )編碼RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操縱地連接于在植物貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。
159.權(quán)利要求158的細(xì)胞，其中所述植物貯藏器官特異性啟動子是種子特異性啟動子，例如子葉特異性啟動子或胚乳特異性啟動子。
160.權(quán)利要求158或159的細(xì)胞，其中所述沉默阻抑物是病毒阻抑蛋白。
161.權(quán)利要求158至160中任一項的細(xì)胞，其中所述RNA分子編碼多肽。
162.權(quán)利要求161的細(xì)胞，其中所述多肽參與脂肪酸或脂質(zhì)的合成或修飾、是種子貯藏蛋白、參與碳水化合物的合成或修飾、或是藥物。
163.權(quán)利要求158至162中任一項的細(xì)胞，其包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種額外的不同的外源性多核苷酸，每一外源性多核苷酸編碼RNA分子并可操縱地連接于在貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。
164.權(quán)利要求158至163中任一項的細(xì)胞，其中所述外源性多核苷酸是DNA。
165.權(quán)利要求158至164中任一項的細(xì)胞，其存在于植物貯藏器官例如種子內(nèi)。
166.權(quán)利要求158至165中任一項的細(xì)胞，其中與缺乏所述第一外源性多核苷酸的同基因細(xì)胞相比，所述RNA分子以升高的水平存在。
167.權(quán)利要求166的細(xì)胞，其中與缺乏所述第一外源性多核苷酸的同基因細(xì)胞相比， 由至少所述額外的外源性多核苷酸編碼的至少一種RNA分子以升高的水平存在。
168.轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求158至167中任一項的細(xì)胞。
169.植物貯藏器官，其包含權(quán)利要求158至167中任一項的細(xì)胞和/或從權(quán)利要求168 的轉(zhuǎn)基因植物獲得。
170.權(quán)利要求169的植物貯藏器官，其是種子。
171.獲得在貯藏器官中具有升高水平的RNA分子的表型正常植物的方法，包括a)向植物細(xì)胞中引入i)編碼沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子，和 )編碼RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操縱地連接于在植物貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，b)從步驟a)的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物，c)生長所述轉(zhuǎn)化植物直至其產(chǎn)生貯藏器官，d)確定所述貯藏器官中的RNA分子水平，和e)選擇表型正常的植物，但其中所述貯藏器官內(nèi)的RNA分子的水平與缺乏所述第一外源性多核苷酸的相應(yīng)的貯藏器官相比是升高的。
172.獲得在貯藏器官中RNA分子穩(wěn)定表達(dá)的表型正常植物的方法，包括a)向植物細(xì)胞中引入i)編碼沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子，和 )編碼RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操縱地連接于在植物貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，b)從步驟a)的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物，c)從步驟b)的植物產(chǎn)生包含貯藏器官的第三代子代植物，和d)選擇第三代子代植物，其中所述貯藏器官中的所述RNA分子的水平是前代植物的貯藏器官中水平的至少90%。
173.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的方法，其中所述外源性多核苷酸穩(wěn)定整合到所述細(xì)胞的基因組中。
174.在轉(zhuǎn)基因植物的貯藏器官中穩(wěn)定表達(dá)RNA分子的方法，包括i)表達(dá)編碼沉默阻抑物的、可操縱地連接于植物貯藏器官特異性啟動子的第一外源性多核苷酸，和 )表達(dá)編碼RNA分子的、可操縱地連接于在植物貯藏器官中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子的第二外源性多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是從以所述外源性多核苷酸轉(zhuǎn)化的母本植物獲得的至少第三代子代植物，且其中所述植物的貯藏器官中的所述RNA分子的水平是前代植物的貯藏器官中水平的至少90%。
175.權(quán)利要求171至174中任一項的方法，其中所述植物生長在田間。
全文摘要
本發(fā)明涉及在重組細(xì)胞(例如酵母或植物細(xì)胞)中合成長鏈多不飽和脂肪酸(特別是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸)的方法。本發(fā)明還提供產(chǎn)生長鏈多不飽和脂肪酸的重組細(xì)胞或植物。此外，本發(fā)明涉及一組新的酶，它們具有去飽和酶或延長酶活性，可用于合成長鏈多不飽和脂肪酸的方法。具體地，本發(fā)明提供具有新活性的ω3去飽和酶、Δ5延長酶和Δ6去飽和酶。本發(fā)明還提供用于以多種基因瞬時和/或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞(特別是植物細(xì)胞)的方法和DNA構(gòu)建體。
文檔編號A01H5/00GK102317459SQ200980154876
公開日2012年1月11日 申請日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者A·M·麥肯齊, C·C·伍德, D·M·F·弗蘭普頓, J·R·皮特里, M·P·曼蘇爾, P·D·尼科爾斯, P·什雷斯塔, S·I·E·布萊克本, S·P·辛格, S·S·羅伯特, 周雪榮, 柳青 申請人:糧食研究發(fā)展公司, 聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織