專利名稱：抗晚疫病和抗甲蟲馬鈴薯新品種培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用生物細胞培養(yǎng)技術(shù)進行馬鈴薯新品種的培育方法。
背景技術(shù)：
馬鈴薯晚疫病是世界馬鈴薯生產(chǎn)中的頭號病害，每年用于防治晚疫病的費用高達 30億美元。用傳統(tǒng)育種方法培育的品種均易感染晚疫病，如不加以防治，其產(chǎn)量損失可在達 到100%。目前已在馬鈴薯野生種，特別是一些來源于墨西哥的野生種中發(fā)現(xiàn)具有高抗晚疫 病基因，可以用來改良栽培馬鈴薯的抗性。特別是一個叫做Solanum pirmatisectum的墨西 哥野生種不僅具有高抗晚疫病和抗甲蟲的基因，而且還具有很高的抗氧化活性。是一種極 為珍貴和罕見的抗病抗蟲和抗氧化基因資源。然而由于它所具有的極為獨特的遺傳特性， 不與任何其他栽培品種雜交，從而限制了這個墨西哥野生種在馬鈴薯栽培品種的遺傳改良 中的利用。至今尚未見到成功利用的報道。原生質(zhì)體融合技術(shù)是一個有效克服種間薯間雜交不育的生物細胞培養(yǎng)技術(shù)，這個 技術(shù)在許多作物中都有成功應(yīng)用的報道。例如，文獻報道Helgeson等人(1988)成功的將抗 晚疫病基因從另一個墨西哥野生種Solanum bulbocascanum通過體細胞雜交的方式引入到 栽培馬鈴薯中。然而所有的從Solanum pirmatisectum墨西哥野生種中引入優(yōu)良性狀基因 的嘗試均以失敗告終，唯一例外的例子是Thieme等人(1997) (Euphytica, 1997，189-200) 成功地獲得了 S. pirmatisectum和栽培品種之間的體細胞雜種，但該體細胞雜種并不抗晚 疫病和甲蟲。在現(xiàn)有技術(shù)中，由于沒有從根本上找到從墨西哥野生種S. pirmatisectum中分離 大量有效的原生質(zhì)體的方法，以及有關(guān)融合、誘導(dǎo)愈傷組織、植株再生等適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)條 件，因而在以S. pirmatisectum做原生質(zhì)體來源的融合，成功的效率極為低下。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗晚疫病和抗甲蟲馬鈴薯新品種培育方法，以解決現(xiàn)有 技術(shù)墨西哥野生種難以和栽培品種雜交獲得體細胞雜種，獲得體細胞雜種又不抗晚疫病和 甲蟲等問題。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是建立一個新的高效分離馬鈴薯葉片 葉肉細胞原生質(zhì)體的技術(shù)體系，根據(jù)不同品種葉片細胞壁對酶處理反應(yīng)的差異，進行處理 條件的調(diào)整，解決不同品種材料在原生質(zhì)體分離數(shù)量及質(zhì)量上存在的差異，進而獲得抗病 蟲細胞雜種種薯。本發(fā)明中使用的各種溶液及培養(yǎng)基如下1.酶解前處理液() 01% (ff/V) CaCl2+0. 06% (ff/V)MES+0. 5M Mannitol，無菌水定容。2.酶解液改良的 MS 培養(yǎng)基，添加 0. 1 % Bovine Serum Alubumin (BSA), 1 % po lyvinylpyrrolidone (PVP-40, 000) ,11% Sucrose制備基本酶解液，無菌水定容后調(diào)pH至5. 7。針對不同基因型配以不同濃度(0. -3% )比的浸解酶Macerozyme R-IO和纖維素酶Cellulase Onozuka R-IO0其中改良的MS培養(yǎng)基配方如下大量元素=NH4NO3150mg/L, KNO3 1900mg/L, MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 170mg/ L, CaCl2 · 2H20 440mg/L ；鐵鹽=FeSO4· 7H20 27. 8mg/L, Na2EDTA · 2H20 37. 3mg/L ；微量元% H3BO3 6. 2mg/L，MnSO4 · H2O 16. 9mg/L，ZnSO4 · 7Η20 8. 6mg/L, KI 0. 83mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L, CoCl2 · 6H200. 025mg/L ；W l/l ^ :Myo-Inositol lOOmg/L, Thiamine ‘ HCl 0. lmg/L, Glycine 2mg/L, Nicotinic acid 0. 5mg/L, Pyridoxine · HCl 0. 5mg/L。3.誘導(dǎo)培養(yǎng)基在改良V-KM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上不添加和添加lg/L BSA制備誘導(dǎo)培養(yǎng) 基。同時兩種培養(yǎng)基中均添加0. 2mg/L 2,4-D, lmg/L NAA和0. 5mg/LZeatin。其中改良的V-KM培養(yǎng)基配方如下大量元素KNO31480mg/L，MgSO4 · 7H20 984mg/L, KH2PO4 68mg/L，CaCl2 · 2H20 367. 5mg/L ；鐵鹽=FeSO4· 7H20 27. 8mg/L, Na2EDTA · 2H20 37. 3mg/L ；微量元素H3BO33mg/L，MnSO4 · H2O 10mg/L，ZnSO4 · 7H20 2mg/L, ΚΙ0. 75mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L, CoCl2 · 6H200. 025mg/L ；糖及糖醇Sorbitol(山梨糖醇)250mg/L，F(xiàn)ructose(果糖)250mg/L，Ribose (核 糖)250mg/L，Xylose (木糖)250mg/L，Rhamnose (鼠李糖)250mg/L，Mannose (甘露 糖)250mg/L, Cellobiose (纖維二糖)250mg/L, myo-Inositol (肌醇)100mg/L ；M^M I :D"Calcium pantothenate () lmg/L, Choline chloride ( UitB 堿)lmg/L, Ascorbic acid (抗壞血酸)2mg/L, Nicotinamide (煙酉先氨)lmg/L, Pyridoxine HCl (鹽酸吡哆素 VB6) lmg/L, Thiamine HCl (鹽酸硫胺素 VB1) 10mg/L, Folic acid(葉 酸)0· 4mg/L ；% II =Vitamin A (Retinol Acetate) 0. O lmg/L, Vitamin D3 (Cholecalciferol)0. Olmg/L, Vitamin B12 (Cyanocobalamin)0. 02mg/L, Biotin (生物
Vitamin H)0. Olmg/L, p-Aminobenzoic acid ( MSS ) 0. 02mg/L ；有機酸Sodium pyruvate (丙酮酸鈉)20mg/L，F(xiàn)umaric acid (延胡索酸)40mg/L， Citric acid(檸檬酸)40mg/L，Malic acid(蘋果酸)40mg/L ;另外添加9% Sucrose (蔗糖),2% Coconut Water (椰乳)，250mg/L Glucose (葡 萄糖)，250mg/L Mannitol (甘露醇)，250mg/L Casein Hydrolyzate (水解酪蛋白)。無菌 水定容后調(diào)PH值至5. 7，過濾滅菌后4°C保存。4.植株再生培養(yǎng)基本發(fā)明采用的植株再生培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加0. 5mg/ L IAA, lmg/L Zeatin，0. 5mg/L ΒΑΡ,Ο. 2mg/L GA3 ; lOg/L 蔗糖，15g/L Mannitol，5. 5g/L 瓊 月旨，無菌水定容后調(diào)pH值至5. 7。其培育方法如下1.酶浸解以24-40天苗齡的馬鈴薯野生種S. pinnatisectum和栽培品種的組織 培養(yǎng)無病毒試管苗的葉片為材料，酶解前用刀片將葉片切成細片，置于前處理液中處理1-2 小時，然后將葉片放入酶解液中，在20°C -30°C全黑暗條件下處理16-30小時。原生質(zhì)體的純化采用漂浮和沉降相結(jié)合的方法。2.電融和將上述馬鈴薯葉肉細胞經(jīng)酶處理后所形成的不帶細胞壁的裸露細胞即浸解后分離出的馬鈴薯野生種S.pirmatisectum和栽培品種的原生質(zhì)體進行電融合， 融合儀和電極采用BTX公司的ECM2001型多功能細胞融合儀(BTX. SanDiego, CA, USA)和 該儀器配備的 3. 2 毫米電泳槽(Microslide453，BTX，Division of Genetronics Inc., SanDiego, CA, USA)。融合方法為將濃度為1_3X IO5個/mL的兩親本馬鈴薯的原生質(zhì)體A 和B按1 1的比例混合，懸浮于電融合液中，進行兩次連續(xù)60 μ s的直流方波脈沖電流進 行處理，使來自野生種S. pirmatisectum原生質(zhì)體與來自栽培品種的原生質(zhì)體相互融合， 形成融合細胞。3.誘導(dǎo)培養(yǎng)將融合細胞放到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成的愈傷組織團 塊，進而產(chǎn)生再生植株。培養(yǎng)條件為25°C，黑暗處理，6-8周即可形成愈傷組織團塊。4.植株再生與移栽將大約2_5mm大小的愈傷組織團塊轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，誘 導(dǎo)植株再生。培養(yǎng)條件為20-24°C，弱光強20μ E · m_2 · s—1，光周期為16小時光照、8小時 黑暗，處理30-60天。嫩芽再生后，移到光強120μΕ ·πΓ2 · s—1，20_22°C條件下培養(yǎng)4_6周 后，切下嫩芽轉(zhuǎn)移到不含激素的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1-2個月，完整的再生植株移栽 到溫室的花盆中，產(chǎn)生體細胞雜種種薯。5、抗病蟲鑒定采用葉片離體分離的方法對體細胞雜種薯塊進行抗病抗蟲鑒定， 證實他們具有與抗性親本相同的抗晚疫病和抗甲蟲的能力。采用本發(fā)明的積極效果是找到一種從不同野生種中高效分離原生質(zhì)體的方法。這 種原生質(zhì)體能夠成功的用于與栽培品種的原生質(zhì)體相融合，產(chǎn)生體細胞再生植株。這些再 生植株100%為細胞融合的雜種植株。通過此發(fā)明產(chǎn)生的體細胞新雜種不僅遺傳了栽培品 種的優(yōu)良農(nóng)藝性狀，而且還繼承了墨西哥野生種的高抗晚疫病和抗甲蟲的特性。
具體實施例方式以墨西哥野生種S. PirmatiseCtum(A)與馬鈴薯栽培品種(B)的原生質(zhì)體分離及 融合為例，本發(fā)明技術(shù)方案具體步驟如下1.酶浸解制備前處理液及酶解液，針對馬鈴薯栽培品種B，酶解液中添加濃度比 為1 4的浸解酶Macerozyme R-10和纖維素酶Cellulase Onozuka R-10，其濃度分別為 0. 25%及1%，0. 2μπι的過濾滅菌器滅菌。以24-40天苗齡的馬鈴薯野生種和栽培品種的 組織培養(yǎng)無病毒試管苗的葉片為材料，酶解前用刀片將葉片切成細片，置于前處理液中處 理1-2小時，然后將葉片放入浸解酶中，在20°C _30°C全黑暗條件下處理16-30小時。原生 質(zhì)體的純化采用漂浮和沉降相結(jié)合的方法。2.電融和將上述馬鈴薯葉肉細胞經(jīng)酶處理后所形成的不帶細胞壁的裸露細胞 即浸解后分離出的馬鈴薯野生種S. pirmatisectum和栽培品種的原生質(zhì)體進行電融合， 融合方法為將濃度為1-3X IO5個/mL的兩親本馬鈴薯的原生質(zhì)體按1 1的比例混合， 懸浮于電融合液中，進行兩次連續(xù)60 μ s的直流方波脈沖電流進行處理，使來自野生種 S. pinnatisectum原生質(zhì)體與來自栽培品種的原生質(zhì)體相互融合，形成融合細胞。3.誘導(dǎo)培養(yǎng)制備誘導(dǎo)培養(yǎng)基，過濾滅菌。將融合細胞放到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25°C，黑暗處理，6-8周形成的愈傷組織團塊，進而產(chǎn)生再生植株。
4.植株再生與移栽制備再生培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌。將大約2_5mm大小的愈傷組織團塊轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)植株再生。培養(yǎng)條件為20-24°C，弱光強20 μ E -m-2·^1, 光周期為16小時光照、8小時黑暗，處理30-60天。嫩芽再生后，移到光強120 μ E ·πΓ2 -s"1, 20-22°C條件下培養(yǎng)4-6周后，切下嫩芽轉(zhuǎn)移到不含激素的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1_2 個月，完整的再生植株移栽到溫室的花盆中，產(chǎn)生體細胞雜種種薯。5、抗病蟲鑒定采用葉片離體分離的方法對體細胞雜種薯塊進行抗病抗蟲鑒定， 證實他們具有與抗性親本相同的抗晚疫病和抗甲蟲的能力。
權(quán)利要求
一種抗晚疫病和甲蟲馬鈴薯新品系的培育方法，其特征在于建立一個新的高效分離馬鈴薯葉片葉肉細胞原生質(zhì)體的技術(shù)體系，根據(jù)不同品種葉片細胞壁對酶處理反應(yīng)的差異，進行處理條件的調(diào)整，分別提出酶浸解、電融合的適宜處理方法，以及愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，解決不同品種材料在原生質(zhì)體分離數(shù)量及質(zhì)量上存在的差異，進而獲得抗病蟲細胞雜種種薯；其培育方法如下(1)酶浸解以24-40天苗齡的馬鈴薯野生種S.pinnatisectum和栽培品種的組織培養(yǎng)無病毒試管苗的葉片為材料，酶解前用刀片將葉片切成細片，置于前處理液中處理1-2小時，然后將葉片放入酶解液中，在20℃-30℃全黑暗條件下處理16-30小時，原生質(zhì)體的純化采用漂浮和沉降相結(jié)合的方法；(2)電融和將上述馬鈴薯葉肉細胞經(jīng)酶處理后所形成的不帶細胞壁的裸露細胞即浸解后分離出的馬鈴薯野生種S.pinnatisectum和栽培品種的原生質(zhì)體進行電融合，融合儀和電極采用BTX公司的ECM2001型多功能細胞融合儀(BTX，SanDiego，CA，USA)和該儀器配備的3.2毫米電泳槽(Microslide453，BTX，Division of Genetronics Inc.，SanDiego，CA，USA)，融合方法為將濃度為1-3×105個/mL的兩親本馬鈴薯的原生質(zhì)體A和B按1∶1的比例混合，懸浮于電融合液中，進行兩次連續(xù)60μs的直流方波脈沖電流進行處理，使來自野生種S.pinnatisectum原生質(zhì)體與來自栽培品種的原生質(zhì)體相互融合，形成融合細胞；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)將融合細胞放到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成的愈傷組織團塊，進而產(chǎn)生再生植株。培養(yǎng)條件為25℃，黑暗處理，6-8周即可形成愈傷組織團塊；(4)植株再生與移栽將大約2-5mm大小的愈傷組織團塊轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)植株再生，培養(yǎng)條件為20-24℃，弱光強20μE·m-2·s-1，光周期為16小時光照、8小時黑暗，處理30-60天；嫩芽再生后，移到光強120μE·m-2·s-1，20-22℃條件下培養(yǎng)4-6周后，切下嫩芽轉(zhuǎn)移到不含激素的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1-2個月，完整的再生植株移栽到溫室的花盆中，產(chǎn)生體細胞雜種種薯；(5)抗病蟲鑒定采用葉片離體分離的方法對體細胞雜種薯塊進行抗病抗蟲鑒定，證實他們具有與抗性親本相同的抗晚疫病和抗甲蟲的能力。
全文摘要
一種抗晚疫病和甲蟲馬鈴薯新品系的培育方法，涉及一種利用生物細胞培養(yǎng)技術(shù)進行馬鈴薯新品種的培育方法。利用從馬鈴薯野生種分離出來的帶有抗晚疫病、抗甲蟲、抗氧化基因的原生質(zhì)體(A)，與適應(yīng)性廣泛的馬鈴薯栽培品種的原生質(zhì)體(B)，經(jīng)過電融合，形成帶有A和B兩種原生質(zhì)體的融合細胞。經(jīng)過細胞培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織，再經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生出再生體細胞雜種試管苗。這種組培試管苗經(jīng)過進一步育苗，移栽到溫室及大田后，生產(chǎn)出試管1代體細胞雜交薯，進而獲得抗病蟲細胞雜種種薯；該體細胞雜交薯同時具有馬鈴薯栽培品種的優(yōu)良農(nóng)藝性狀和抗晚疫病、抗甲蟲性狀。為提高馬鈴薯本身的品質(zhì)和利用野生種來改良馬鈴薯栽培品種的抗氧化活性提供了新的可利用的基因資源。
文檔編號A01H4/00GK101824408SQ200910229610
公開日2010年9月8日 申請日期2009年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月28日
發(fā)明者史永忠, 孫慧生, 李海燕, 梁希森, 陳勤 申請人:樂陵希森馬鈴薯產(chǎn)業(yè)集團有限公司