專利名稱：丫蕊花組培及種植方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)和移栽種植技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及百 合科植物丫蕊花新藥材的組織培養(yǎng)技術(shù)和無公害種植方法。
背景技術(shù)：
丫蕊花植物在民間稱石鳳丹、隨身丹，具有清熱、解毒、散結(jié)、 利小便，主治癆癘、水腫，該屬植物有四種，分別為丫蕊花(f. tAiZ et/ca ); 云南丫 '蘊花 (F- y〃/w2a/ e"57's邁ici-a/ t力a 泡W-ifez力；高山丫蔬花(F. a加'/7aet 7"朋g);小丫蘊花(F. cara7e2^'ei乙eW et ra/ zO，均屬于在國內(nèi)市場未上市的中藥，已被 云南省食品藥品監(jiān)督管理局列入云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn),2005年版彝族藥 (ni)于2009年發(fā)布。現(xiàn)為天然植物。中國專利CN1081036C公幵了 以丫蕊花全草為原料，提取獲得呋甾類甾體皂苷具有抗癌活性，該發(fā) 明專利亦被收載于美國化學(xué)文摘(Kawabc. et. al. CS 1996， 124: 325368y)。中國專利為03117694. 1公開了 丫蕊花屬植物中甾體皂苷 具有治療婦科出血性疾病的作用。
制藥企業(yè)用丫蕊花為原料生產(chǎn)治療婦科血癥的新藥后，市場上供 應(yīng)丫蕊花中藥材預(yù)計每年不低于4000-5000噸。僅依靠野生丫蕊花資 源，無法解決和滿足消耗的需要。急需種植，實現(xiàn)丫蕊花資源的再生 和持續(xù)利用。由于丫蕊花花粉管由珠孔進入胚囊釋放出兩個精子屬雙受精過 程，受精后的合子休眠期較長，胚胎發(fā)育較慢，種子成熟時胚尚未分 化，胚仍需進一步緩慢發(fā)育，所以用種子繁殖沒能成功，野外在丫蕊 花周囲也未發(fā)現(xiàn)幼小丫蕊花。為此中國專利申請"一種丫蕊花的人工
繁育方法"專利申請?zhí)枮?00610048655,1，公開了以丫蕊花葉為材料 進行人工繁殖技術(shù)研究獲得成功，出苗率最高達67%。然而該技術(shù)由于 出苗率最高僅達67%，出苗率還是較低，而且該方法人工種植需要土地， 遮蔭費時且投入大，不能滿足大面積種植和對藥材的大量需求。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)在技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一種丫蕊花組織培育和無 公害種植技術(shù)，采用本發(fā)明的方法，.可獲得大批組培苗滿足種植需要； 并采用天然林區(qū)種植克服農(nóng)藥及重金屬污染，成活率達95.5% ，三 年內(nèi)可提供新藥材，単株重量高于同年野生和無繁種植藥材2倍，并 且縮宮止血有效成分含量高于同年野生藥材；并滿足制藥企業(yè)對原藥 材的需求，既可成批培育又可大面積種植組培苗，并且提早二年獲得 無公害藥材，具有實用價值。
為了實現(xiàn)本發(fā),明的目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案 丫蕊花的組培及種植方法，包括取丫蕊花外植體，消毒清洗，愈 傷組織誘導(dǎo)與分化，不定芽增殖，不定根誘導(dǎo)，煉苗，無公害種植步 驟。
所述組織培養(yǎng)育苗是用葉組織離體培養(yǎng)育苗，剪下葉片，消毒后 接種在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，形成愈傷組織并分化為叢芽，培養(yǎng) 的不定芽單個切開轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，形成增殖體的幼苗轉(zhuǎn)接 到1/2MS + IBA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基中，15-21天生根，練苗后移栽。丫蕊花外植體優(yōu)選葉片，經(jīng)水洗，70%的乙醇和升汞消毒，無菌 水洗凈后，剪成小塊，進行愈傷組織誘導(dǎo)與分化。
愈傷組織誘導(dǎo)與分化是在無菌條件下，從丫蕊花消毒后葉片上
剪下1平方厘米小葉塊，接種在MS培養(yǎng)基加含6-BA 0. 25-0. 5mg/L， NAA 0. 2-0. 3 mg/L培養(yǎng)基上，在20-25°C ，光照1000Lx，光照10-12 小時，濕度大于70%條件下直接誘導(dǎo)產(chǎn)生叢芽，30-40天開始萌動； 再經(jīng)8-14天有叢芽出現(xiàn)；7-15天叢芽長葉。
不定芽增殖是將愈傷組織誘導(dǎo)與分化出的叢芽單個切開，在MS培 養(yǎng)基加含6-BA 0. 5mg/L ， NAA 0. 3-0. 4 rag/L培養(yǎng)基上進行增殖培 養(yǎng)；40-60天便可形成幼苗；增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的新叢芽，葉變綠，2-3cm 時，進一步轉(zhuǎn)接進行增殖培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)。
不定根誘導(dǎo)是取出增殖培養(yǎng)長出的高4-5cm的幼苗，單個切開， 轉(zhuǎn)接到1/2MS + IBA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接后15-21天，開始生 根；待40-60天根達3條以上，葉達6-IO片，高達6-8c邁的試菅苗 取出練苗。
煉苗是將試菅苗從組培室取出后置于溫棚中，放置5-7天，取 出幼苗洗凈培養(yǎng)基后移植在裝有腐質(zhì)土和紅土 1:1并加少許腐質(zhì)葉 為基質(zhì)的營養(yǎng)袋內(nèi)，澆水，在1000-2000Lx中光照8-12小時，濕度 大于70%條件下練苗1個月，當(dāng)葉達6-10片，高達6-8cm時移栽種 植。
無公害種植是在天然條件下進行種植，選擇海拔800 2，500m， 林下，溝邊，瀑布兩旁或有遮陰條件的荒土；滿足日照年平均6小時 /日、年平均最高溫度不高于18°C、月平均最高溫度在11 23'C、最
6低可達0t:的條件；滿足地下5cm 土溫年平均最高溫度不高于16°C、 月平均最高溫度在9~2^)"、最低可達9。C以下的條件；建立隔離區(qū)，
防牛馬進入而踏壞。
具體地，本發(fā)明技術(shù)方案可描述為
1、 材料
采集野生或家種丫蕊花全株移種在花盒中，以野生或家種丫蕊花 母體葉為外植體的材料。
2、 方法
1) .外植體消毒剪種于盒中的野生丫蕊花葉片，水沖洗丫蕊花
的母體組織葉片，經(jīng)70%的乙醇和升汞消毒，無菌水洗凈后，剪成lcm2 小方塊，每瓶放4-6塊外植體，蓋緊瓶蓋Z用保鮮袋封好瓶口。
2) 組培
① 培養(yǎng)基配制以MS為基本培養(yǎng)基，另加不同濃度的植物激素。由葉
片外殖體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，并誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽，J吏不定芽增殖，
不定芽形成幼苗，進行生根培養(yǎng)，采用加含6-BA 0.25-0.5mg/L (6-芐 基腺嘌呤)，NAA 0.2-0.4 mg/L ( N即hthalene acetc acid,萘乙酸) 和加含IBA 0.2 mg/L培養(yǎng)基，配制過程按照常規(guī)方法，培養(yǎng)瓶為玻 璃瓶或透明塑料瓶。滅菌采用121° C滅菌20分鐘高壓濕熱滅菌。
② 組培條件
在20-25°C ，光照1000Lx，光照10-12小時，濕度大于70%條
件下
外殖體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織形成產(chǎn)生不定芽30-40天。開始萌動后 8-14天出現(xiàn)叢芽；再過7-15天叢芽長葉。
7不定芽增殖取出已長葉叢芽單個切開進行增殖培養(yǎng)40-60天便
可形成幼苗。取其高4-5cm的幼苗進行生根培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的新 叢芽，葉變綠，2-3cm，可一進轉(zhuǎn)接進行增殖培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)。
生根培養(yǎng)取出增殖培養(yǎng)長出高4-5cm的幼苗，單個切開，轉(zhuǎn)接 到含IBA 0.2 mg/L培養(yǎng)劑中，轉(zhuǎn)接后15-21天，開始生根。40-60 天根達3條以上，葉6-10片，高6-8cm的試菅苗可取出練苗。
③煉苗將試菅苗置于溫棚中，控制光照和濕度下，放置5-7天， 取出試菅幼苗用清水洗凈培養(yǎng)基移植在混有基質(zhì)營養(yǎng)袋中，澆清水， 保濕l月成活后移栽在大田中，二年可收割。 3、種植
天然條件下的無公害種植。天然條件下的種植選擇海拔
800 2，500m，林下，溝邊，瀑布兩旁或有遮陰條件的荒土，滿足日照 要求年平均6小時/日；年平均最高溫度不高于18'C，月平均最高 溫度在11 23。C，最低可達0'C。地下5cm土溫年平均最高溫度不 高于16°C，月平均最高溫度在^2(TC，最低可達9。C以下。
天然條件下種植，建立隔離區(qū)，防牛馬進入而踏壞。本發(fā)明天然 條件下種植，4年收獲，鮮重5-10克/株/年，有效成分含量1.3% (大于野生1.07%);仿生態(tài)種植，3年即可收獲，鮮重15-30克/株/ 年，有效成分含量1.6%。 本發(fā)明的有益效果在于
采用本發(fā)明的方法，可獲得大批組培苗滿足種植需要；并采用天 然林區(qū)種植克服農(nóng)藥及重金屬污染，成活率達95.5% ，三年內(nèi)可提 供新藥材，單株重量高于同年野生和無繁種植藥材2倍，并且縮宮止血有效成分含量高于同年野生藥材，具有推廣的實用價值?？蓾M足制 藥企業(yè)對原藥材的需求，既可成批培育又可大面積種植組培苗，并且 提早二年獲得無公害藥材，具有實用價值。


圖1表示本發(fā)明丫蕊花母株葉作外植體；
圖2表示本發(fā)明誘導(dǎo)愈傷組織圖3表示本發(fā)明愈傷組織分化圖4表示本發(fā)明生根；
圖5表示本發(fā)明煉苗；
圖6表示本發(fā)明盒栽種植；
圖7表示本發(fā)明天然無公害種植。；
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖，通過本發(fā)明的實施例，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再做 進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于 以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明 的范圍。
實施例1:
1、外植體材料的采取和處理
選擇丫蕊花3-8月生長茂盛無病的母株新發(fā)幼嫩葉片葉為外殖 體材料。采集野生或家種丫蕊花全株移種在花盒中，用清水洗葉，待 新葉長出。從母株上剪下活葉片用自來水沖洗15分鐘，除去葉表面 的塵土和絨毛，將葉片放入70%的乙醇中翻轉(zhuǎn)20秒鐘，除去葉表面 的蠟質(zhì)物后用清水沖洗葉面除去乙醇，放入0. 1%升汞液中浸泡15分鐘消毒，無菌水洗凈后剪成lcm2小方塊。葉背面平放于培養(yǎng)基中，每 瓶放4-6塊外植體。蓋緊瓶蓋，用保鮮袋封好瓶口。在無菌操作臺上完成接種。
2、 愈傷組織誘導(dǎo)與分化，不定芽增殖和不定根誘導(dǎo)
2. 1愈傷組織誘導(dǎo)與分化在無菌條件下，從消毒后葉片上剪下
l平方厘米小葉塊，接種在MS培養(yǎng)基加含6-BA 0. 25-0. 5mg/L (6-芐基腺嘌呤)，NAA 0. 2-0. 3 mg/L ( Naphthalene acetc acid,萘乙酸) 培養(yǎng)基上，在20-25°C ，光照1000Lx，光照10-12小時，濕度大于 70%條件下直接誘導(dǎo)產(chǎn)生叢芽，30-40天開始萌動；再經(jīng)8-14天有 叢芽出現(xiàn)；7-15天叢芽長葉。
2.2不定芽增殖:取出已長葉叢芽單個切開，在MS培養(yǎng)基加含6-BA 0.5mg/L ， NAA 0. 3-0. 4 mg/L培養(yǎng)基上，進行增殖培養(yǎng)。40-60天 便可形成幼苗。取其高4-5cm的幼苗進行生根培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的 新叢芽，葉變綠，2-3cm，可一進轉(zhuǎn)接進行增殖培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)。
2.3不定根誘導(dǎo)取出增殖培養(yǎng)長出高4-5cm的幼苗，單個切開， 轉(zhuǎn)接到1/2MS + IBA 0. 2 mg/L培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)接后15-21天，開始生根。 40-60天根達3條以上，葉6-IO片，高6-8cm的試菅苗可取出練苗。
3、 煉苗
將試菅苗從組培室取出后置于溫棚中，放置5-7天，取出幼苗用 清水洗凈培養(yǎng)基移植在營養(yǎng)袋中，營養(yǎng)袋內(nèi)裝有腐質(zhì)土和紅土 1:1混 均，加少許腐質(zhì)葉為基質(zhì)，繞清水，保濕控制光照1000-2000 Lx，光 照8-12小時，濕度大于70%條件下，練苗1月成活達92. 5%，葉6-10片，高6-8cm移栽在大田中。二年可收割。練苗后按照實施例2的 條件移栽，6個月時鮮重12克/株， 一年后，測定縮宮止血成分的含 量達1.6%， 二年可收割地上部分藥用。
4、種植 天然條件下種植
選擇海拔80(T2，500m，林下，溝邊，瀑布兩旁或有遮陰條件的成 遍土地。滿足日照要求0~8小時/日，年平均6小時/日，株行距依 環(huán)境而定，可稀，可密。
氣候條件氣溫年平均最高溫度不高于1S。C，月平均最高溫 度在1廣23"，最低達0"。地下5cm土溫最高溫度年平均不高于 16°C，月平均最高溫度在9 20 °C，最低達9'C以下。濕度最高達 90%，最低不低于70%，月平均濕度在70 90%之間，天然樹遮陰。天 然條件下種植，建立隔離區(qū)，防牛馬進入而踏壞。
綜上，本發(fā)明提供的栽培方法出苗率高，成活率高90%，實現(xiàn)了 野生丫蕊花家栽。為丫蕊花成為新中藥材，大量使用提供了較實用的 方法。
權(quán)利要求
1、丫蕊花組培及種植方法，包括取丫蕊花外植體，消毒清洗，愈傷組織誘導(dǎo)與分化，不定芽增殖，不定根誘導(dǎo)，煉苗，無公害種植步驟。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述組培是用葉組織離體培養(yǎng)育苗，剪下葉片，消毒后接種在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 天，形成愈傷組織并分化為叢芽，培養(yǎng)的不定芽單個切開轉(zhuǎn)接在培養(yǎng) 基上增殖培養(yǎng)，形成增殖體的幼苗，轉(zhuǎn)接到1/2MS + IBA 0. 2 mg/L的 培養(yǎng)基中，15-21天生根，練苗后移栽。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征是丫蕊花外植體優(yōu)選葉片， 經(jīng)水洗，70%的乙醇和升汞消毒，無菌水洗凈后，剪成小塊，進行愈 傷組織誘導(dǎo)與分化。
4、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于愈傷組織誘導(dǎo)與分化 是在無菌條件下，從丫蕊花消毒后葉片上剪下1平方厘米小葉塊，接 種在MS培養(yǎng)基加含6-BA 0. 25-0. 5mg/L， NAA 0. 2-0. 3 mg/L培養(yǎng) 基上，在20-25°C ，光照1000Lx，光照10-12小時，濕度大于70% 條件下直接誘導(dǎo)產(chǎn)生叢芽，30-40天開始萌動；再經(jīng)8-14天有叢芽 出現(xiàn)；7-15天叢芽長葉。
5、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于不定芽增殖是將愈傷組 織誘導(dǎo)與分化出的叢芽單個切開，在MS培養(yǎng)基加含6-BA 0.5mg/L ， NAA 0.3-0.4mg/L培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)；40-60天便可形成幼苗； 增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的新叢芽，葉變綠，2-3cm時，進一步轉(zhuǎn)接進行增殖 培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)。
6、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于不定根誘導(dǎo)是取出增殖培養(yǎng)長出的高4-5cm的幼苗，單個切開，轉(zhuǎn)接到1/2MS + IBA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接后15-21天，開始生根；待40-60天根達3條 以上，葉達6-IO片，高達6-8cm的試菅苗取出練苗。
7、 如權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于煉苗是將試菅苗 從組培室取出后置于溫棚中，放置5-7天，取出幼苗洗凈培養(yǎng)基后移 植在裝有腐質(zhì)土和紅土 1:1并加少許腐質(zhì)葉為基質(zhì)的營養(yǎng)袋內(nèi)，澆 水，在1000-2000 Lx中光照8-12小時，濕度大于70%條件下練苗1 個月，當(dāng)葉達6-IO片，高達6-8cm時移栽種植。
8、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于無公害種植是在天然 條件下進行種植，選擇海拔800 2，500m，林下，溝邊，瀑布兩旁或 有遮陰條件的荒土；滿足日照年平均6小時/日、年平均最高溫度不 高于1『C、月平均最高溫度在1廣23。C、最低可達0。C的條件；滿足 地下5cm 土溫年平均最高溫度不高于16°C、月平均最高溫度在9~20 °C、最低可達9。C以下的條件；建立隔離區(qū)，防牛馬進入而踏壞。
全文摘要
本發(fā)明提供用丫蕊花的母體組織葉為外植體材料，進行組織離體培養(yǎng)和無公害種植物的方法，采用本方法可獲得大批組培苗，滿足種植需要。采用天然林區(qū)種植克服了農(nóng)藥及重金屬污染，成活率達95.5％，三年內(nèi)可提供新藥材，單株重量高于同年野生和無繁種植藥材2倍，并且縮宮止血有效成分含量高于同年野生藥材，滿足制藥企業(yè)對原藥材的需求。既可成批培育又可大面積種植組培苗，并且提早二年獲得無公害藥材，具有推廣的實用價值。
文檔編號A01H4/00GK101473792SQ20091009405
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者偉 倪, 劉海洋, 賀樹珍, 陳昌祥 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所