專利名稱：：轉(zhuǎn)基因動物模型的制作方法轉(zhuǎn)基因動物模型本發(fā)明涉及允許轉(zhuǎn)基因表達的同時、組織特異性和時間控制性(temporally-controlled)調(diào)控的轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物。這樣的模型可用作研究參與某些疾病例如癌癥，特別是肺癌的起始和進展的連續(xù)步驟的工具。例如轉(zhuǎn)基因小鼠模型的轉(zhuǎn)基因非人動物模型已成為研究涉及某些人疾病狀態(tài)的分子和生理過程，特別地涉及致癌性的分子和生理過程的不可替代的工具。雖然用于開發(fā)常規(guī)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的基因破壞和基因替代策略適合于產(chǎn)生無效突變體或功能獲得性突變體，但都對建立由多基因病因?qū)W(polygenicetiology)和環(huán)境影響引起的疾病例如癌癥作為"獲得性"疾病的模型不理想。此類已知的策略產(chǎn)生種系突變(germlinemutation)。因此，在發(fā)育的早期階段起始二次應答(secondaryresponse)的級聯(lián)反應的潛能是很重要的。這些應答，即使在未暴露于壓力的生物中是表型沉默的，但在成年小鼠中可相當大地改變行為以應對額外的攻擊。雖然該信息本身是吸引人的，但在發(fā)育中使轉(zhuǎn)基因沉默并且在成體中誘導其表達提供了不受潛在的發(fā)育擾亂復雜化的、潛在地更合適的環(huán)境。此外，大多數(shù)癌癥是散發(fā)性的，并且致癌作用通常是組織或空間特異性的。常規(guī)轉(zhuǎn)基因小鼠在完整的動物中攜帶組成型轉(zhuǎn)基因，其產(chǎn)生與在散發(fā)性癌癥的起始過程中發(fā)現(xiàn)的極不相同的微環(huán)境，其中少數(shù)腫瘤細胞被許多正常細胞包圍，所述正常細胞可通過細胞-細胞接觸或旁分泌信號傳導維持(keep)初始癌細胞。流行病學數(shù)據(jù)已清楚地表明香煙煙霧與肺癌的發(fā)生在原因上是相關(guān)。過去的分子生物學研究已揭示肺癌中的復雜分子變化。已知，擾亂整合的信號傳導網(wǎng)絡(正調(diào)控或負調(diào)控不同細胞過程以保持肺的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定)的完整性導致肺癌的發(fā)生。與所有類型的癌癥一樣，從正常肺細胞轉(zhuǎn)化成惡性肺癌細胞是許多事件組合的結(jié)果。雖然香煙煙霧的致癌作用據(jù)認為是多階段過程，但關(guān)于癌癥發(fā)生真正所需的步驟存在不同的意見。某些遺傳或后生畸變(epigeneticaberration)與致癌作用之間的因果關(guān)系通常是不清楚的。這由于關(guān)于香煙煙霧誘導的致癌作用的早期事件知之甚少的事實而復雜化。此外，肺癌起源的細胞類型和微環(huán)境在腫瘤發(fā)生中所起的復雜的甚至"矛盾的"作用都是未知的。用于開發(fā)肺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型的最近的策略已從以組成型模式靶向轉(zhuǎn)基因發(fā)展至以誘導型模式在肺中調(diào)控基因的表達和消除。這允許以空間特異性和組織特異性的方式控制基因表達，從而提供用于進一步研究腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)的更好的平臺(由Kwak等人，2004綜述)。在產(chǎn)生條件性轉(zhuǎn)基因小鼠中使用最廣的系統(tǒng)是W噬菌體的Cre重纟且酵和酉良酒酵母(SaccAaro/ffycescereF/s/ae)的Flp重纟且酵，其行為彼此非常相似。重組酶Cre(或Flp)通過被稱為/oz戶(或/V^的34-bp的不對稱多核苷酸的識別促進重組。取決于loxP位點的相對方向，Cre可催化位于這些位點之間的DNA片段的切除(相同方向)或插入(相反方向)。獲得誘導型基因靶向的已知方法涉及兩種類型的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。第一轉(zhuǎn)基因小鼠品系具有鄰側(cè)是方向相同的兩個loxP位點并且以不阻斷正?；蚧钚?兩側(cè)裝接loxP(floxed)的基因)的方式放置的靶基因(或基因區(qū)段)。第二轉(zhuǎn)基因小鼠品系包含表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因。當這兩個小鼠品系雜交時，取決于存在于轉(zhuǎn)基因中的啟動子和調(diào)控序列，在特定的細胞或組織中缺失兩側(cè)裝接loxP的基因并且產(chǎn)生突變。重要地要指出，對于使用Cre/loxP(或Flp/frt)系統(tǒng)的條件性基因靶向必須滿足兩個要求。首先，必須以使其仍然具有功能的方式產(chǎn)生兩側(cè)裝接loxP的等位基因，其次，Cre表達的靶向必須受到嚴格控制。取決于兩側(cè)裝接loxP的DNA序列，Cre/loxP系統(tǒng)還可用于產(chǎn)生插入。為此目的，可以不僅在給定類型的細胞中而且在發(fā)育的給定時間導入條件性轉(zhuǎn)基因。這些條件性模型可被靶向至獲得性疾病的癌癥，因為其是散發(fā)性。因此，可在小鼠模型的發(fā)育的任何階段進行遺傳改變。然而，除了癌癥通常是獲得性疾病且經(jīng)歷微環(huán)境的微妙復雜化(complication)的事實外，煙草煙霧的致癌作用顯示額外的特征。顯示吸煙者在停止吸煙后15至25年幾乎與非吸煙者面臨相同低的發(fā)生肺癌的風險的流行病學數(shù)據(jù)強有力地表明香煙煙霧的"可逆性，，或劑量效應。此外，香煙煙霧施加的損傷對于其作用模式通常是間斷性的。已通過鼻內(nèi)或氣管內(nèi)施用adeno-cre病毒(表達Cre重組酶的重組腺病毒)開發(fā)了用于肺癌的數(shù)個條件性轉(zhuǎn)基因小鼠模型(Jackson等人，2001;Meuwissen等人，2001)。然而，以該方式抑制或激活被耙向的基因是不可逆的并且在施用后成為組成型，其不能反映香煙煙霧暴露的間斷性性質(zhì)或停止吸煙后吸煙者中觀察到的肺癌的可逆性。這幾點產(chǎn)生了已知的常規(guī)和條件性轉(zhuǎn)基因小鼠作為香煙煙霧誘導的肺致瘤性的適當?shù)募膊∧Ｐ偷南嚓P(guān)性的問題。換句話說，目前不存在用于研究香煙煙霧誘導的肺癌或其他煙霧誘導的疾病的適當?shù)霓D(zhuǎn)基因小鼠模型?？傊?，用于研究香煙煙霧誘導的疾病的理想的或恰當?shù)姆侨藙游锬Ｐ蛻斈軌颢@得l)疾病的獲得性性質(zhì)、2)微環(huán)境的復雜化、3)香煙煙霧暴露的間斷性特征，和4)停止后吸煙者中的致癌過程的"可逆性"性質(zhì)。本發(fā)明現(xiàn)提供這樣的非人動物模型，其具有上述有利的能力。特別地，本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定地整合入其基因組的第一和第二表達盒的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼效應子多肽的多核苷酸。所述(第二)效應子多肽的表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活，該表達產(chǎn)物由在誘導型啟動子控制下的多核苷酸編碼。根據(jù)本發(fā)明的所有方面和實施方案，優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因非人動物是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物。特別優(yōu)選是轉(zhuǎn)基因小鼠。特別地，本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定地整合入其基因組的第一表達盒和第二表達盒的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的第二多核苷酸和任選地另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列阻斷第二效應子多肽表達以使在非誘導狀態(tài)下沒有不從所述組織特異性啟動子的第二效應子多核苷酸的表達，并且其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的第一多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導并且表達第一效應子多肽時，通過例如去除對第二表達盒的阻斷來激活第二效應子多肽的表達。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，尤其是包含穩(wěn)定地整合入小鼠基因組的第一和第二表達盒的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子，制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活，該表達產(chǎn)物由在誘導型啟動子，特別是由香煙煙霧或其一種或多種組分誘導的啟動子控制下的多核苷酸編碼；和目的基因(goi)，例如腫瘤抑制基因或可適合用于本發(fā)明的范圍內(nèi)的任何其他基因，其被整合在動物基因組中并且鄰側(cè)是短多核苷酸，所述短多核苷酸包含重組酶蛋白的識別位點并不干擾目的基因的正常表達，這樣goi在非誘導狀態(tài)下從動物基因組活躍地表達，但當?shù)诙佣嚯牡谋磉_時發(fā)生失活。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，尤其是包含穩(wěn)定地整合入小鼠基因組的第一和第二表達盒的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子，制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸和另外的核苷酸序列，所迷另外的核苷酸序列阻斷第二效應子多肽的表達使得在非誘導狀態(tài)下沒有從該啟動子的效應核苷酸的表達，并且其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子，特別是由香煙煙霧或其一種或多種組分誘導的啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，其當被誘導時表達第一效應子多肽并且去除對第二表達盒的阻斷，從而激活第二效應子多肽的表達；和目的基因(goi)，例如腫瘤抑制基因或可適合用于本發(fā)明的范圍內(nèi)的任何其他基因，其被整合在動物基因組中并且鄰側(cè)是短多核苷酸連接，所述短多核苷酸包含重組酶蛋白的識別位點并不干擾目的基因的正常表達，這樣GOI在非誘導狀態(tài)下從動物基因組活躍地表達，但在第二效應子多肽的表達時發(fā)生失活。在本發(fā)明的特定實施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，其中第一表達盒和第二表達盒穩(wěn)定地整合在所述轉(zhuǎn)基因非人動物的至少一個體細胞的基因組中。在本發(fā)明的另一個特定的實施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，其中第一表達盒和第二表達盒穩(wěn)定地整合在所述轉(zhuǎn)基因非人動物的至少一個種系細胞的基因組中。任選地，第二表達盒包含阻斷第二效應子多核苷酸表達的另外的核苷酸序列。阻斷性核普酸序列包含一個或多個終止密碼子或多腺苦酸化序列或報告基因或能夠阻斷第二效應子多肽表達的任何其他核苷酸序列。有利地，其位于表達盒中以使效應子多肽的表達被阻斷。優(yōu)選，其位于編碼第二效應子多肽的核苷酸序列的上游，更優(yōu)選位于啟動子和編碼性多核苷酸之間。在本發(fā)明的特定實施方案中，編碼包含在第一表達盒中的、在誘導型啟動子控制下的第一效應子多肽的第一多核苷酸是編碼重組酶的多核苷酸，并且阻斷性序列鄰側(cè)是包含重組酶蛋白的識別位點的短核苷酸序列。特別地，第一效應子多肽是Cre重組酶或Flp重組酶，并且阻斷性核苷酸序列(特別是polyA序列或終止密碼子或報告基因)鄰側(cè)是重組酶識別序列，分別是/07和識別序列。在本發(fā)明的特定實施方案中，第一表達盒中控制第一效應子多肽表達的誘導型啟動子是被強烈誘導的并且基本上不提供背景活性的開/關(guān)型啟動子。特別地，所述啟動子的誘導是劑量依賴性的和化合物或組合物依賴性的，從而允許通過調(diào)節(jié)誘導試劑的劑量和性質(zhì)來微調(diào)基因表達水平和持續(xù)時間。在本發(fā)明的特定實施方案中，提供了誘導型啟動子，其在環(huán)境毒物例如尼古丁(nicotine)和多環(huán)芳烴(PAH)(例如苯并芘(BaP))以及氯化二噁英和呋喃類(例如四氯二苯并二噁英(TCDD))以及P-萘黃酮(BNF)(其中一些存在于煙草煙霧中)等單獨地或以一種或多種所述組分的不同組合存在的情況下被強烈誘導。在本發(fā)明的特定實施方案中，第一表達盒中控制效應子多肽表達的誘導型啟動子是控制細胞色素P450單氧化酶表達，特別是cyplAl基因表達的啟動子。其他誘導型啟動子還可用于本發(fā)明的范圍內(nèi)以控制第一效應子多肽的表達，例如，然而不限于，脅迫應答基因hsp70.1的啟動子、金屬硫蛋白基因的啟動子和其他cyp-型啟動子。在本發(fā)明的另一個方面，包含在第二表達盒內(nèi)的、控制第二效應子多肽表達的組織特異性啟動子是組織特異性啟動子，特別是肺組織特異性啟動子，更優(yōu)選控制肺組織特異性蛋白質(zhì)表達的啟動子，最優(yōu)選控制在呼吸和終末細支氣管的非纖毛支氣管上皮細胞(克拉拉細胞)中特異性表達的蛋白質(zhì)(例如克拉拉細胞10蛋白)的啟動子。特別優(yōu)選的是CCIO蛋白啟動子。在本發(fā)明的另一個實施方案中，肺組織特異性啟動子是控制肺組織特異性蛋白質(zhì)，更特別是在肺泡上皮細胞中特異性表達的蛋白質(zhì)(例如表面活性劑蛋白質(zhì)A/C)的表達的啟動子。這樣的蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)許多免疫細胞功能(包括細胞增殖、細胞因子產(chǎn)生、細胞表面標志物的表達和氧化活性的產(chǎn)生)的肺組織特異性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，肺組織特異性啟子是控制在I型和II型肺上皮細胞中表達的肺組織特異性蛋白質(zhì)(例如RAIG1)的啟動子。還可用于本發(fā)明范圍內(nèi)的其他肺組織特異性啟動子包括例如選自甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-2(TTFl)的啟動子、水通道蛋白5的啟動子、Tlct的啟動子和視黃酸(retinoicacid)_秀導的基因1(RAIGl)的啟動子。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-l(TTF-l，Nkx2.1基因的產(chǎn)物)是肺的分支形態(tài)發(fā)生所必需的，其增強肺泡II型細胞表面的活性劑蛋白的表達。Tloc是肺泡上皮細胞I型細胞的分化基因。水通道蛋白-5(AQP5)是在肺泡上皮I型細胞的頂端表面上表達的水通道蛋白。RAIG1是在I型和II型的肺上皮細胞中特異性表達的基因。在本發(fā)明的另外的方面，根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的轉(zhuǎn)基因非人動物包含穩(wěn)定地整合入其基因組的目的基因(GOI)，其表達受第二效應子多肽調(diào)控。特別地，提供了包含穩(wěn)定地整合入其基因組的第一表達盒和第二表達盒的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活，所述表達產(chǎn)物由在誘導型啟動子控制下的多核苷酸編碼，其中所述轉(zhuǎn)基因非人動物在其基因組中包含目的基因(GOI)，該目的基因以活性狀態(tài)整合在動物基因組中或從基因組活躍地表達，但當?shù)诙佣嚯谋磉_時發(fā)生失活。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，其包含穩(wěn)定地整合入其基因組的第一和第二表達盒，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸和任選地另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列阻斷第二效應子多肽的表達以使在非誘導狀態(tài)下沒有從該啟動子的效應核苷酸的表達，并且其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導并且表達第一效應子多肽時，通過例如去除對第二表達盒的阻斷來激活第二效應子多肽的表達，并且其中所述轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是所述轉(zhuǎn)基因小鼠，在其基因組中包含目的基因(GOI)，該目的基因整合入動物的基因組中以使其在非誘導狀態(tài)下活躍地從所述基因組表達，但當?shù)诙佣嚯谋磉_時發(fā)生失活。目的基因可以是存在于轉(zhuǎn)基因非人動物中的天然基因，或備選地是已通過重組DNA技術(shù)人工地導入動物基因組的轉(zhuǎn)基因。目的基因可以例如是腫瘤抑制基因，例如腫瘤抑制基因k-Ras12(Jackson等人，2001)、Rbl或Trp53(Meuwissen等人，2001)，或者是可適當?shù)赜糜诒景l(fā)明范圍內(nèi)的任何其他基因，該基因有效地整合入轉(zhuǎn)基因非人動物的基因組中且在非誘導狀態(tài)下活躍地從基因組表達，但當?shù)诙佣嚯谋磉_時被阻斷或發(fā)生失活。在本發(fā)明的特定的實施方案中，第二效應子多肽是重組酶且轉(zhuǎn)基因非人動物的基因組中的目的基因鄰側(cè)是不干擾目的基因正常表達的、包含重組酶蛋白的識別位點的短核苷酸序列。特別地，效應子多肽是Cre重組酶或Flp重組酶，并且與目的基因(GOI)鄰側(cè)的重組酶識別序列分別是/0,戶和/>纟識別序列。在本發(fā)明的另一個方面，目的基因(GOI)以無活性狀態(tài)整合在轉(zhuǎn)基因非人動物的基因組中或不從基因組活躍表達。特別地，提供了包含穩(wěn)定地整合入其基因組的第一表達盒和第二表達盒的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活，該表達產(chǎn)物由在誘導型啟動子控制下的多核苷酸編碼，并且其中所述轉(zhuǎn)基因非人動物在其基因組中包含目的基因(GOI)，該目的基因以無活性狀態(tài)整合在動物的基因組中或不從基因組活躍地表達，但當?shù)诙佣嚯谋磉_時被激活。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定地整合入其基因組的第一和第二表達盒的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸和任選地另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列阻斷第二效應子多肽表達以使在非誘導狀態(tài)下沒有從該啟動子的效應核苷酸的表達，并且其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導并且表達第一效應子多肽時，通過例如去除對第二表達盒的阻斷來激活第二效應子多肽的表達，其中所述轉(zhuǎn)基因非人動物包含穩(wěn)定地整合在其基因組中的目的基因(GOI)，該目的基因整合在動物的基因組中以使其在非活性狀態(tài)下不從所述基因組活躍地表達，但當?shù)诙佣嚯谋磉_時被激活。阻斷性多核苷酸可包含終止密碼子或多腺苷酸化序列或報告基因，并且特別地位于表達盒中，更特別地位于啟動子和編碼性多核苷酸之間以使效應子多肽的表達被阻斷。目的基因可以是存在于非人動物的基因組中的天然基因，或備選地是已通過重組DNA技術(shù)人工導入基因組的轉(zhuǎn)基因。當?shù)诙佣嚯谋磉_時，無活性的目的基因(GOI)去阻斷或被激活，使得引起目的基因的表達。目的基因可以例如是腫瘤易感基因，例如選自肺腺瘤易感基因1(Las-1)和Kirstin大鼠肉瘤癌基因2(Kras2)，或者是可適合用于本發(fā)明的范圍內(nèi)的任何其他基因。本發(fā)明還包括栽體分子，其包含第一表達盒和第二表達盒作為該載體分子的部分，其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核普酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導時，表達笫一效應子多肽，并且所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活。特別地，本發(fā)明涉及載體分子，其中第二表達盒包含阻斷第二效應子多肽表達的另外的多核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了載體分子，其包含第一表達盒和第二表達盒作為該載體分子的部分，其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導時，表達第一效應子多肽，并且所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸和任選地另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列阻斷笫二效應達。第二效應子多肽的表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活。二任選的另外的核苷酸序列(其阻斷第二效應子多肽的表達以使在非誘導狀態(tài)下沒有從組織特異性啟動子的效應子核苷酸的表達)可以是包含一個或多個終止密碼子、多腺苷酸化(polyA)序列、報告基因或能夠阻斷第二效應子多肽表達的任何其他序列的核苷酸序列，并且其特別地位于表達盒中以使第一效應子多肽的表達被阻斷。優(yōu)選地所述核苷酸序列位于編碼第二效應子多肽的多核苷酸的上游，更優(yōu)選位于啟動子和編碼性核苷酸序列之間。還包括載體分子，其中控制第一表達盒中效應子多肽的表達的誘導型啟動子是被強烈誘導并且基本上不提供背景活性的開/關(guān)型啟動子，并且其依賴于誘導化合物或誘導組合物，特別是香煙煙霧或至少一種其組分的劑量和性質(zhì)，特別是控制細胞色素P450單氧化酶基因的表達的啟動子，尤其是控制cyplAl基因的表達的啟動子。在另外的實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的載體分子，其中組織特異性啟動子是肺組織特異性啟動子，特別是控制肺組織特異性蛋白質(zhì)表達的啟動子，特別是在呼吸和終末細支氣管的非纖毛支氣管上皮細胞(克拉拉細胞)中特異性表達的蛋白質(zhì)(例如克拉拉細胞10蛋白)的表達的啟動子，特別是CC10蛋白啟動子。備選地，根據(jù)本發(fā)明的載體分子可包含肺組織特異性啟動子，其控制在肺泡上皮細胞中特異性表達的肺組織特異性蛋白質(zhì)，例如表面活性劑蛋白A/C的表達。在本發(fā)明的另外的方面，根據(jù)本發(fā)明的載體分子包含是重組酶，特別是Cre重組酶或Flp重組酶的第一效應子多肽和/或是重組酶，特別是Cre重組酶或Flp重組酶的第二效應子多肽。還提供了根據(jù)本發(fā)明的載體分子，其包含具有重組酶識別序列的被靶向的目的基因，特別是兩側(cè)裝接loxP的被耙向的目的轉(zhuǎn)基因的表達盒。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了載體分子，其中目的基因是腫瘤抑制基因，例如p53、Arf、Dmpl和Rb，或胂瘤易感基因，例如k-Ras12、WT1、TSG101等，其中基因鄰側(cè)是Cre識別序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了載體分子，其包含第一表達盒、第二表達盒和第三表達盒作為該載體分子的部分，其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導時，表達第一效應子多肽，并且所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸和任選地另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列阻斷第二效應子多肽的表達以使在非誘導狀態(tài)下沒有從該啟動子的效應核苷酸的表達，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活，并且所述第三表達盒包含具有重組酶識別序列的被靶向的目的基因，特別是兩側(cè)裝接1oxP的被靶向的目的轉(zhuǎn)基因，特別是腫瘤抑制基因例如p53、Arf、Dmpl和Rb或肺瘤易感基因例如k-Ras12、WT1、TSG101等，其特別地鄰側(cè)是Cre識別序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了組合物，其在不同載體分子上包含根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的第一表達盒和第二表達盒，這樣所述各載體分子中的每一種只包含單個表達盒。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了組合物，其在至少兩個不同載體分子上，特別地在三個不同的載體分子上包含根據(jù)本發(fā)明的和之前在本文中描述的第一表達盒、第二表達盒和第三表達盒，這樣至少一個載體分子只包含單個表達盒。于是可同時或相繼地將所述載體分子轉(zhuǎn)染入非人動物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，尤其是根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，其包括用根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的載體分子轉(zhuǎn)染靶動物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了評估當間斷性應用時，試劑或組合物在動物的特定組織中的致癌潛能的方法，其包括(i)將根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的轉(zhuǎn)基因非人動物與待評估的試劑或組合物接觸；(ii)阻斷或失活目的基因的表達，從而在動物的特定組織的細胞內(nèi)引起遺傳畸變，(iii)鑒定和測定所述遺傳畸變；(iv)將來自經(jīng)處理的動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目與來自未處理的轉(zhuǎn)基因動物或用對照試劑處理的轉(zhuǎn)基因動物中的遺傳改變的細胞的數(shù)目相比較，其中經(jīng)處理的動物中的轉(zhuǎn)化細胞的數(shù)目與未處理或使用對照試劑的處理的情況下的轉(zhuǎn)化細胞的數(shù)目相比的差異指示了測試化合物的致癌潛能。本發(fā)明還包括用于評估由試劑或組合物誘導的致癌過程的可逆性的方法，其包括(i)按照確定的時間方案間斷性地將根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的轉(zhuǎn)基因非人動物與待評估的試劑或組合物接觸；(ii)阻斷或失活目的基因的表達，從而在動物的特定組織的細胞內(nèi)引起遺傳畸變，(iii)鑒定和測定所述遺傳畸變；(iv)中止轉(zhuǎn)基因動物與待評估的試劑或組合物接觸，將來自間斷性處理的動物的樣品中的遺傳改變的細胞數(shù)目與在中止處理后給定的時間，來自動物的樣品中的改變的細胞的數(shù)目相比較，和(v)測定致癌過程的可逆性。發(fā)源于對生物的特定組織或細胞的一些類型的損傷的許多疾病，例如香煙煙霧誘導的疾病，特別是香煙煙霧誘導的癌癥具有"獲得性"的性質(zhì)。該類型的疾病稱為散發(fā)病，其與家族性病相反。因此，疾病的發(fā)生受到微環(huán)境的復雜化(complication)的影響，所述微環(huán)境的復雜化可終止、減慢或加速疾病。此外，在某些與吸煙相關(guān)的疾病的情況下，流行病學證據(jù)清楚地說明此類疾病可被認為是"可逆的"。因此，本發(fā)明提供了反映遞送的劑量和間斷性暴露模式的動物模型。特別地，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動物允許通過模型動物對誘導疾病的化合物或組合物的間斷性暴露，特別地對香煙煙霧的暴露，然后通過轉(zhuǎn)基因的激活或目的基因的失活引起的目的基因的組織特異性，特別地肺組織特異性和時間控制性表達。在本發(fā)明的特定實施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，其中將包含組織特異性啟動子，特別是肺組織特異性啟動子(例如SP-A/C或CC10啟動子)的表達盒與包含誘導型啟動子，特別是由環(huán)境毒物(例如香煙煙霧或一種或多種其組分)誘導的啟動子，特別是cyplAl啟動子的另一種表達盒組合，其中兩個啟動子驅(qū)動效應子基因，特別是重組酶^^因(例如cre或/7/重組酶基因)的表達，其提供了用于研究參與某些疾病(例如癌癥，尤其是肺癌)的起始和進展的連續(xù)步驟的可行的和強大的工具?？蛇m合用于根據(jù)本發(fā)明的非人動物模型系統(tǒng)內(nèi)的肺組織特異性啟動子分別是SP-A/C啟動子或CC10啟動子。表面活性劑蛋白A/C是肺組織特異性蛋白質(zhì)，其調(diào)節(jié)許多免疫細胞功能，包括細胞增殖、細胞因子的產(chǎn)生、細胞表面標志物的表達和氧化活性的產(chǎn)生。其還可參與適應性免疫應答。由于其肺特異性，表面活性劑蛋白A/C啟動子已在幾個研究中用于將遺傳改變導入肺細胞(Harrod等人，1998;Wilmott等人，1998)?？死毎?0蛋白是來自肺中的呼吸和終末細支氣管的非纖毛上皮細胞(克拉拉細胞)的主要產(chǎn)物。因為大約50-70%的小鼠氣管、小支氣管和細支氣管(肺導氣道)中的上皮細胞是克拉拉細胞，因而克拉拉細胞CC10蛋白啟動子已在幾個研究中用于以肺組織特異性方式表達轉(zhuǎn)基因(Temann等人，1998;Fisher等人，2001;)?？蛇m當?shù)赜糜诟鶕?jù)本發(fā)明的模型系統(tǒng)內(nèi)的誘導型啟動子是cyplAl啟動子。cyplAl基因是來自細胞色素P450單氧化酶系統(tǒng)的基因。細胞色素P450單氧化酶系統(tǒng)代表抵抗來自環(huán)境的化學攻擊的主要防御，構(gòu)成由生物在暴露于有害試劑(例如香煙煙霧)后引發(fā)的適應性應答的部分。它們還參與多種必需的"管家，，功能，例如類固醇激素的生物合成和脂肪氧化。然而，細胞色素P450也能夠催化某些化合物對毒性產(chǎn)物的激活。這些酶受化學誘導試劑的高度調(diào)控。在這一點上特別吸引人的是細胞色素P-450cyplAl基因。該基因不組成型地表達，但在暴露于香煙煙霧和/或其組分以及環(huán)境毒物，例如尼古丁、多環(huán)芳烴(PAH)、四氯二苯并二噁英(TCDD)以及p-萘黃酮(BNF)等時是高度可誘導的。cyplAl系統(tǒng)的顯著優(yōu)點是在肺中基本不存在背景活性，并且其提供了通過調(diào)節(jié)誘導試劑的劑量和性質(zhì)來微調(diào)基因表達水平和持續(xù)時間的能力。事實上幾個研究已顯示轉(zhuǎn)基因小鼠中的cyplAl啟動子對于細胞特異性基因調(diào)控是極度敏感的開-關(guān)系統(tǒng)(Campbell等人，1996;Smith等人，1995;Ryding等人，2001)。cyplAl的表達不僅通過暴露于香煙煙霧誘導，而且還可通過不同的環(huán)境毒物誘導。這也打開了開發(fā)用于毒物學測試和環(huán)境監(jiān)控的該類型條件性轉(zhuǎn)基因小鼠的可能性。特別地，本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定地整合入小鼠基因組的第一和第二表達盒的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子，特別是肺組織特異性啟動子(例如克拉拉CC10蛋白啟動子或表面活性劑蛋白A/C啟動子)或控制在I型和II型肺上皮細胞中表達的肺組織特異性蛋白質(zhì)(例如RAIG1)的啟動子控制下的、編碼效應子多肽的多核苷酸，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活，該表達產(chǎn)物由在談導型啟動子，特別是可由香煙煙霧或由一種或多種其組分誘導的啟動子，例如cyplAl啟動子控制下的多核苷酸編碼。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是包含穩(wěn)定地整合入小鼠基因組的第一和第二表達盒的小鼠，其中所述第二表達盒包含編碼效應子多肽，特別是重組酶(例如Cre重組酶或Flp重組酶)的多核苷酸和另外的多核苷酸，所述多核苷酸在組織特異性啟動子，特別是肺組織特異性啟動子(例如克拉拉細胞CC10蛋白啟動子或表面活性劑蛋白A/C啟動子)的控制之下，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活，該表達產(chǎn)物是由在誘導型啟動子，特別是由香煙煙霧或由一種或多種其組分誘導的啟動子(例如cyplAl啟動子)控制下的多核苷酸編碼的效應子多肽，特別是重組酶(例如Cre重組酶或Flp重組酶)，所述另外的多核苷酸在非誘導狀態(tài)下阻斷第二效應子多肽的表達，其特別是包含位于表達盒中，特別地位于啟動子和編碼性多核苷酸之間以使效應子多肽的表達被阻斷的終止密碼子或多腺普酸化序列或報告基因，并且鄰側(cè)是重組酶識別序列，例如Ai尸和/VH只別序列連接的多核香酸。在另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的轉(zhuǎn)基因非人動物在其基因組中包含目的基因(GOI)，例如腫瘤抑制基因例如腫瘤抑制基因k-Ras12、Rbl、Trp53、WT1或75X67，或者位于染色體3的短臂上的稱為3p21.3的區(qū)域中的腫瘤抑制基因例如Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族(associationdomainfamily)1(RASSFI)(包括RASSFIA和RASSFIC)，或者可適合用于本發(fā)明的范圍內(nèi)的任何其他基因，將其整達，但當?shù)赹效應子多肽表達時發(fā)生失活。'工在本發(fā)明的特定實施方案中，第二效應子多肽是重組酶，特別是Cre重組酶或Flp重組酶，尤其是FLP重組酶，動物基因組中的目的基因鄰側(cè)是不干擾目的基因正常表達的、包含重組酶蛋白的識別位點的短多核苷酸，特別是/OA77或/VM只別序列，尤其是/VH只別序列。根據(jù)本發(fā)明的雙重啟動子系統(tǒng)(其包含誘導型啟動子，特別是由香煙煙霧或一種或多種其組分誘導的啟動子，和組織特異性啟動子，特別是肺組織特異性啟動子)允許以組織特異性和受控的方式，特別地以肺組織特異性和受香煙煙霧控制的方式控制致癌作用的起始。在一個實施方案中，提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物模型，特別是小鼠模型的方法，其包括(a)提供第一表達盒和第二表達盒，其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導時，表達第一效應子多肽，并且所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活；(b)通過下列步驟將所述第一和第二表達盒導入動物特別地小鼠的基因組(i)將所述第一和第二表達盒導入受精的小鼠卵或胚胎的胚泡；-將包含所述表達盒的受精卵轉(zhuǎn)移至假孕雌性小鼠的輸卵管，其中所述小鼠發(fā)生懷孕;或，備選地-將包含所述表達盒的胚胎移植入假孕小鼠并且讓所述胚泡發(fā)育至足孕；(c)讓懷孕雌性小鼠分娩產(chǎn)生后代小鼠；和(d)從后代小鼠中選擇已穩(wěn)定地將第一和第二表達盒整合入基因組的小鼠。在一個實施方案中，提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物模型，特別是小鼠模型的方法，該方法包括(a)提供第一表達盒和第二表達盒，其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的的多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導時，表達第一效應子多肽，所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活；(b)用第一表達盒和第二表達盒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細胞的群體；(c)鑒定已通過同源重組將所述第一和第二表達盒整合入其基因組的小鼠胚胎干細胞；(d)將所述細胞插入小鼠胚胎；和(d)讓所得的胚胎生長，從而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中所描述的第一表達盒和第二表達盒都包含在單個載體分子內(nèi)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的第一表達盒和第二表達盒可各自存在于分開的載體分子中并且被一起或相繼地轉(zhuǎn)移至待轉(zhuǎn)染的動物。在一個實施方案中，提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物模型，特別是小鼠模型的方法，該方法包括(a)提供表達盒，其包含具有重組酶識別序列的、被靶向的目的基因，特別是兩側(cè)裝接loxP的被靶向的目的轉(zhuǎn)基因，例如兩側(cè)裝接loxP的k-Ras12或兩側(cè)裝接loxP的p53和Rb，其中基因鄰側(cè)是Cre識別序列；(b)通過下列步驟將所述表達盒導入動物，特別是小鼠的基因組(i)將所述第一和第二表達盒導入受精的小鼠卵或胚胎的胚泡；-將包含所述表達盒的受精卵轉(zhuǎn)移至假孕雌性小鼠的輸卵管，其中所述小鼠開始懷孕；或，備選地-將包含所述表達盒的胚胎移植入假孕小鼠并且讓所述胚泡發(fā)育至足孕；(c)讓懷孕雌性小鼠分娩產(chǎn)生后代小鼠；和(d)從后代小鼠中選擇已穩(wěn)定地將具有重組酶識別序列的、被靼向的目的基因整合入基因組的小鼠。在一個實施方案中，提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物模型，特別是小鼠模型的方法，其包括(a)提供表達盒，其包含具有重組酶識別序列的、被靶向的目的基因，特別是兩側(cè)裝接loxP的被靶向的目的基因，例如兩側(cè)裝接loxP的k-Rasl2或兩側(cè)裝接loxP的p53和Rb，其中該基因鄰側(cè)是Cre識別序列；(b)用所述表達盒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細胞的群體；(c)鑒定已通過同源重組將所述表達盒整合入其基因組的小鼠胚胎干細胞；(d)將所述細胞插入小鼠胚胎；和(d)讓所得的胚胎生長，從而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的、已將具有重組酶識別序列的、被靶向的目的基因穩(wěn)定地整合入基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠。在本發(fā)明的特定實施方案中，提供了第一小鼠A(反式作用子小鼠)，其中重組酶，特別是重組酶Cre的散發(fā)性表達是肺特異性的并且受香煙煙霧誘導型啟動子，特別是cyplAl啟動子的調(diào)控。然后將該小鼠A與第二小鼠B雜交，所述第二小鼠B在其基因組中包含具有重組酶識別序列的、被靶向的目的基因，特別是兩側(cè)裝接1oxP的被耙向的轉(zhuǎn)基因，例如兩側(cè)裝接loxP的k-Rasl2(Jackson等人，2001)或兩側(cè)裝接loxP的p53和Rb(Meuwissen等人，2001)，其中該基因鄰側(cè)是Cre識別序列。用于產(chǎn)生用于該雜交的小鼠A和B的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的并且描述于例如Nagy等人,2002:Manipulatingthemouseembryos:Alaboratorymanual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,第3版。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了如之前本文中描述的用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物模型，特別是小鼠模型的方法，該方法的改變在于分的所有3個根據(jù)本發(fā)明的i達盒同時或相繼地轉(zhuǎn)染入非人動物。、P在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，尤其是包含穩(wěn)定地整合入小鼠基因組的第一和第二表200780050208.2說明書第18/23頁達盒的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子(例如克拉拉細胞CC10蛋白啟動子或表面活性劑蛋白A/C啟動子)或者控制在I型和II型肺上皮細胞中表達的肺組織特異性蛋白質(zhì)(例如RAIG1)的啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸和另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列阻斷第二效應子多肽的表達以使在非誘導狀態(tài)下沒有從該啟動子的效應核苷酸的表達，其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子，特別是可由香煙煙霧或由一種或多種其組分誘導的啟動子(例如cyplAl啟動子)控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，當誘導時，其表達第一效應子多肽并且去除對第二表達盒的阻斷，從而激活第二效應子多肽的表達；所述目的基因(GOI)，例如肺瘤抑制基因例如腫瘤抑制基因k-Ras12、Rbl、Trp53、WT1或73Z"，或者位于染色體3的短臂上稱為3p21.3的區(qū)域中的胂瘤抑制基因，例如Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族1(RASSFI)(包括RASSFIA和RASSFIC)，或者可適合用于本發(fā)明的范風內(nèi)的任何其他基因，其整合在動物基因組中并且鄰側(cè)是不干擾目的基因的正常表達的、包含重組酶蛋白的識別位點的短多核苷酸，特別地7oW或/VM只別序列，尤其是/V纟識別序列，這樣GOI在非誘導狀態(tài)下活躍地從動物基因組表達，但當?shù)诙佣嚯谋磉_時發(fā)生失活。攜帶雙重啟動子系統(tǒng)和兩側(cè)裝接loxP的被靶向的基因的所述雜交的后代可用于研究香煙煙霧誘導的疾病的分子機制。這些小鼠中致癌作用的起始在時間方面可通過香煙煙霧暴露所控制。因為重組酶Flp(和從而還有Cre)將只被香煙煙霧散發(fā)性或時間時性誘導，因而在暴露的各時間上遺傳突變或畸變將只在幾個鄰近的細胞中發(fā)生，在暴露停止后，可恢復基因表達，這反映了吸煙者中香煙煙霧的間斷性暴露。因為表面活性劑蛋白A/C或克拉拉細胞10蛋白只在肺組織中表達，因而重組酶Cre的表達和從而遺傳畸變在肺組織中是受組織特異性控制的。反式作用子小鼠還可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，在該轉(zhuǎn)基因小鼠中，以時間和肺組織特異性敲減(knockeddown)或下調(diào)基因表達。在本發(fā)明的一個實施方案中，從而提供了用于評估當間斷性暴露于試劑或23組合物時，所述試劑或組合物在特定組織中的致癌潛能的方法，其包括(i)間斷性地將根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠暴露于待評估的試劑或組合物，從而以組織特異性方式散發(fā)性或時間性(temporally)地誘導效應子多肽；(U)阻斷或失活目的基因的表達，從而在動物的特定組織的細胞內(nèi)引起遺傳畸變，(iii)鑒定和測定所述遺傳畸變；(iv)將來自經(jīng)處理的動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目與來自未處理的轉(zhuǎn)基因動物或用對照試劑處理的轉(zhuǎn)基因動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目相比較，其中經(jīng)處理的動物中的轉(zhuǎn)化細胞的數(shù)目與在未處理或使用對照試劑處理的情況下的轉(zhuǎn)化細胞的數(shù)目相比的差異指示了測試化合物的致癌潛能。在本發(fā)明的特定方面，提供了用于評估當間斷性暴露于香煙煙霧或其至少一種組分時，香煙煙霧或至少一種其組分在肺組織中的致癌潛能的方法，其包括(i)間斷性地將根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠暴露于待評估的香煙煙霧或至少一種其組分，從而以肺組織特異性方式散發(fā)性或時間性地誘導效應子多肽；(ii)阻斷或失活目的基因的表達，從而在動物的特定組織的細胞內(nèi)引起遺傳畸變，(iii)鑒定和測定所述遺傳畸變；(iv)將來自經(jīng)處理的動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目與來自未處理的轉(zhuǎn)基因動物或用對照試劑處理的轉(zhuǎn)基因動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目相比較，其中經(jīng)處理的動物中的轉(zhuǎn)化細胞的數(shù)目與在未處理或用對照試劑處理的情況下的轉(zhuǎn)化細胞的數(shù)目相比的差異指示了香煙煙霧或至少一種其組分的致癌潛能。在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于評估由試劑或組合物誘導的致癌過程的可逆性的方法，其包括(i)按照確定的時間方案間斷性地將根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的轉(zhuǎn)基非人因動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠暴露于待評估的試劑或組合物；(ii)阻斷或失活目的基因的表達，從而在動物的特定組織的細胞中引起遺傳畸變，(iii)鑒定和測定所述遺傳畸變；(iv)中止轉(zhuǎn)基因動物對待評估的試劑或組合物的暴露，(iv)將來自間斷性處理的測試動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目與在已處理中止后給定的時間，來自動物的樣品中的改變的細胞的數(shù)目相比較，和(iv)測定致癌過程的可逆性。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于評估肺組織中由香煙煙霧或至少一種其組分誘導的致癌過程的可逆性的方法，其包括(i)按照確定的時間方案間斷性地將根據(jù)本發(fā)明的和之前本文中描述的轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠暴露于待評估的香煙煙霧或至少一種其組分；(U)阻斷或失活目的基因的表達，從而在動物的特定組織的細胞中引起遺傳畸變，(iii)鑒定和測定所述遺傳畸變；(iv)中止轉(zhuǎn)基因動物對待評估的香煙煙霧或至少一種其組分的暴露，(iv)將來自間斷性處理的受試動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目與在已處理中止后給定的時間，來自動物的樣品中的改變的細胞的數(shù)目相比較，和(iv)測定致癌過程的可逆性。因此可將根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動物模型用于以空間和時間特異性方式研究某些遺傳或后生畸變在香煙煙霧誘導的致癌作用或其他疾病中的意義。實施例實施例1:用于Flp的誘導型表達的表達盒1的構(gòu)建對于Flp的誘導性表達，使用例如Campbel1等人，1996或Ryding等人，2001中描述的標準rDNA技術(shù)構(gòu)建載體。將flp轉(zhuǎn)基因與誘導型cyplal啟動子和金屬硫蛋白(MT-1)多腺苷酸化序列有效連接以使Flp重組酶的編碼序列在誘導型啟動子的控制下表達。通過PCR從質(zhì)粒706-FLP(GeneBridges)擴增FlpcDNA并且將其克隆入pBS185(Invitrogen)從而替代Cre重酶序列來產(chǎn)生pBS185-FLP。將攜帶CMV啟動子、FLP編碼序列和小鼠MT-1多腺苷酸化位點的PBS185-FLP進一步用Spel和XhoI消化以除去CMV啟動子序列。從pAHIrl-LacZ分離包含外顯子1的區(qū)域和外顯子2的部分的大鼠CypUl啟動子的11.5-kb片段，并且將其克隆入pBS185-FLP。通過HincII和Kpnl消化pBS185-CyplAl-Flp載體來產(chǎn)生14.4-kbCyplAl-Flp轉(zhuǎn)基因片段。通過用CyplAl-Flp轉(zhuǎn)基因的前核顯微注射受精卵母細胞(C57BL6Fl動物)來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的CyplAl-Flp動物。通過對從尾部活檢組織制備的基因組DNA進行PCR來對所得后代進行基因分型。圖1中給出載體構(gòu)建體的示意圖。實施例2:用于Cre的條件性表達的表達盒2的構(gòu)建對于肺組織中Cre的條件性表達，4吏用例如Harrod等人，1998或Wilmott等人，1998或Berlin等人，2005中描述的標準rDM技術(shù)，將肺組織特異性啟動子SP-C融合至3個MT-1多腺苷酸化序列，所述多腺苷酸化序列鄰側(cè)是Flp靶向性序列frt,其后是Cre重組酶編碼序列。使用Spel和Xhol消化pBS185來除去CMV啟動子序列。擴增3.7kb人SP-C啟動子并且將其克隆入pBS185來產(chǎn)生SP-C-Cre載體。合成包含相同方向的2個含有3個終止密碼子序列(小寫字母)的frt位點(大寫字母)的106bp寡核苷酸(5'-(C-3')(SEQIDNO:l)和互補寡核苷酸，使之退火并且平端克隆入SP-C-Cre載體。通過HincII和Kpnl消化線性化SPC-frt-STOP-frt-Cre載體，分離、純化包含SPC啟動子、鄰側(cè)是終止密碼子序列的frt、Cre重組酶編碼序列和小鼠MT-1多腺苷酸位點的7.6-kb片段，并且將其注射入受精卵母細胞(C57BL6Fl動物)。通過對從尾部活檢組織制備的基因組DNA進行PCR來對后代進行基因分型。圖1中給出了載體構(gòu)建體的示意圖。圖IB中的pSP-C啟動子可以是SP-A的啟動子、克拉拉細胞10蛋白的啟動子、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子l(TTF-l)的啟動子、Tloc的啟動子、水通道蛋白5的啟動子或RAIG-1基因的啟動子。實施例3:轉(zhuǎn)基因小鼠A的產(chǎn)生使用標準轉(zhuǎn)染技術(shù)同時或相繼地將表達盒1和2轉(zhuǎn)染入第一小鼠A(反式作用子小鼠)。小鼠A提供了以肺組織特異性方式進行的并且受香煙煙霧誘導型啟動子，特別是cyplAl啟動子調(diào)控的重組酶，特別是重組酶Cre的散發(fā)性表達。在該構(gòu)型(configuration)中，可由香煙煙霧豫導的Flp表達導致3個MT-1多腺苷酸化序列的缺失，從而導致Cre在肺組織中的表達。通過CplAl-Flp與SP-C-frt-ST0P-frt-Cre小鼠的雜交獲得轉(zhuǎn)基因小鼠A。在該構(gòu)型中，可由香煙煙霧誘導的Flp表達導致終止盒序列的缺失，從而導致Cre在肺組織中的表達。實施例4:將包含目的基因(GOI)的載體轉(zhuǎn)染至小鼠B中如例如Kwak等人(2004)中所述構(gòu)建包含目的基因例如k-Ras12(Jackson等人，2001)或p53和Rb(Meuwissen等人，2001)的載體并且使用標準轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染入第二小鼠B，來產(chǎn)生在其基因組中包含具有重組酶識別序列的被靶向的目的基因，特別是兩側(cè)裝接loxP的被靶向的轉(zhuǎn)基因(例如兩側(cè)裝接loxP的k-Ras12或兩側(cè)裝接loxP的p53和Rb)的小鼠，其中所述基因鄰側(cè)是Cre識別序列連接。實施例5:小鼠AX小鼠B的雜交將小鼠A與小鼠B雜交以產(chǎn)生后代。所述雜交的后代攜帶雙重啟動子系統(tǒng)和兩側(cè)裝接loxP的被靶向的目的基因，并且可用于研究香煙煙霧誘導的疾病的分子機制。這些小鼠中致癌作用的起始在時間方面可通過香煙煙霧暴露來控制。因為重組酶Flp(和從而還有Cre)將只被27香煙煙霧散發(fā)性或時間性誘導，因而在各暴露時間，遺傳突變或畸變將只在幾個鄰近的細胞中發(fā)生，并且在停止暴露后可恢復基因表達，這反映了吸煙者中香煙煙霧的間斷性暴露。因為表面活性劑蛋白A/C或克拉拉細胞IO蛋白只在肺組織中表達，因而重組酶Cre的表達和從而遺傳畸變在肺組織中受組織特異性控制。參考文獻列表Berlinetal,2005,TransgenicResearch14,645-654Ca,b別et:al.,1996;ReguiationoftheCYP1A1promoterintransgenicrnic'白.anexquisfteiysensitiveon-offsystemforceilspecificgeneregulation.■<■/Ce//Sc/.109(Pt11):2619-2625Rs:h&retal..,2001.,Inductionandapoptoticregressionoflungadenocarcinomasbyreg.u〖attonof8K-Rastransg印einthepresenceandabsenceoftumorsuppressorgenes,Ge膽Oei/.15:3249-3262Harro'd:et.al.,.1998;Lung-sp:ecifieexpression,ofadenovirusE3-14.7Kint'ran臺geni:cmice,attenuatesadenovjrgivector-mediatedlunginflammationandenhancesIfansgeneexpression.M/mGe加7Te廣.9:鄉(xiāng)5-1鵬J3cks0netaL2001;Analysisoflungtumoriniftetionandprogressionusingconditi.on.alexpressionofoncogenicK-ras.Genes。ev.15:3243-3243Kwaketal.,2004;Geneticalyengineeredmousemodelsf0rlungcancer,/A加yeRev.戶/ys/'o/.66:647-663Meuwissensta(.,2加1:Mousemode'lforlungtumorigenesis.throughCre/loxcontrolie'dsporadicactivationoftheK-R扭soncogene.Oncogene.20:6551-6558Rydi.叩etal"200:1:;Con:d旭onaltran'sgfenicteGhnologtes...J￡>ic/QGr/rQ/.171;1-14Smith.etaL.,1995;CytochroiineP4501A:1promoterasa'ge'neti《switchfortheregutetableandphysiological:expression'of.aplss'ma:proteirvintran'sgenjc'rriice,.Prt>c歸/4cac/Sc/"SA92:11926-11咖Temannet.si..1998;Expressionofinterleukin9inthe.lungsoftransgenicmicecausesairway'(nfla'mmation'mastcellhyperplasia,andbronchialhype'tresponsiveness,J￡xpMe"微1307-1320Wiimottetaj.,1998;Generationof'atransgenicmoLtse:'withlurvg-specific'overexp:re'ssio'nofthehumaninte:rleu'kin-1receptorantagonistprotein.Am'.JResp/f'Ce〃編S/o/.18:429-43權(quán)利要求1.包含穩(wěn)定地整合入動物基因組的第一和第二表達盒的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活，該表達產(chǎn)物由在誘導型啟動子控制下的多核苷酸編碼。2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物，其包含穩(wěn)定地整合入動物基因組的第一和第二表達盒，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸和任選地另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列阻斷第二效應子多肽的表達以使在非誘導狀態(tài)下沒有從該啟動子的效應核苷酸的表達，并且其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導并且表達第一效應子多肽時，去除對第二表達盒的阻斷并且激活第二效應子多肽的表達。3.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物，其包含穩(wěn)定地整合入動物基因組的第一和第二表達盒，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼效應子多肽的多核苷酸，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活，該表達產(chǎn)物由在誘導型啟動子控制下的多核苷酸編碼，并且其中所述轉(zhuǎn)基因動物在其基因組中包含目的基因(GOI)，該目的基因以活性狀態(tài)整合在動物基因組中和/或從基因組活躍地表達，但當?shù)诙佣嚯谋磉_時發(fā)生失活。4.權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因動物，其包含穩(wěn)定地整合入動物基因組的第一和第二表達盒，其中所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸和任選地另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列阻斷第二效應子多肽的表達以使在非誘導狀態(tài)下沒有從該啟動子的效應核苷酸的表達，并且其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導并且表達第一效應子多肽時，去除對第二表達盒的阻斷，并且激活第二效應子多肽的表達，并且其中所述轉(zhuǎn)基因動物在其基因組中包含目的基因(GOI),該目的基因整合在動物基因組中以使其在非誘導狀態(tài)下活躍地從動物基因紐表達，但當?shù)诙佣嚯谋磉_時發(fā)生失活。5.權(quán)利要求1-4中任一項的轉(zhuǎn)基因動物，其中第一表達盒中控制效應子多肽的表達的誘導型啟動子是被強烈誘導的并且基本上不提供背景活性的開/關(guān)型啟動子，特別是控制細胞色素P450單氧化酶的表達的啟動子或控制cyplAl基因表達的啟動子，所述啟動子依賴于誘導化合物或誘導組合物，特別是單獨地或以一種或多種下述組分的不同組合包含香煙煙霧或至少一種其組分的組合物的劑量和性質(zhì)，所述組分例如是選自尼古丁、多環(huán)芳烴(PAH)例如苯并芘(BaP)和氯化二噁英以及呋喃類例如四氯二苯并二噁英(TCDD)以及|3-萘黃酮(BNF)等的化合物。6.前述權(quán)利要求中任一項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述組織特異性啟動子是肺組織特異性啟動子，特別是控制肺組織特異性蛋白質(zhì)的表達的啟動子，特別是a)控制在呼吸和終末細支氣管的非纖毛支氣管上皮細胞(克拉拉細胞)中特異性表達的蛋白質(zhì)，例如克拉拉細胞io蛋白的啟動子，特別是CC10蛋白啟動子；b)控制在肺泡上皮細胞中特異性表達的蛋白質(zhì)，例如表面活性劑蛋白A/C的啟動子；c)控制在I型和II型肺上皮細胞中特異性表達的蛋白質(zhì)，例如RAIG1的啟動子。7.前述權(quán)利要求中任一項的轉(zhuǎn)基因動物，其中第一和第二效應子多肽是重組酶，特別是Cre重組酶或Flp重組酶。8.載體分子，其包含第一和第二表達盒作為該載體分子的部分，其中所述第一表達盒包含在誘導型啟動子控制下的、編碼第一效應子多肽的多核苷酸，其當被誘導試劑或誘導組合物誘導時表達第一效應子多肽，并且所述第二表達盒包含在組織特異性啟動子控制下的、編碼第二效應子多肽的多核苷酸和任選地另外的核普酸序列，所述另外的核苷酸序列阻斷第二效應子多肽的表達以使在非誘導狀態(tài)下沒有從該啟動子的效應核苷酸的表達，其表達被第一表達盒的表達產(chǎn)物激活。9.權(quán)利要求8的載體分子，其中a)第一表達盒中控制效應子多肽的表達的誘導型啟動子是被強烈誘導的并且基本上不提供背景活性的開/關(guān)型啟動子，特別是控制細胞色素P450單氧化酶的表達的啟動子或控制cyplAl基因表達的啟動子，該啟動子依賴于誘導化合物或組合物，特別是單獨地或以一種或多種下述組分的不同組合包含香煙煙霧或至少一種其組分的組合物的劑量和性質(zhì)，所述組分例如是選自尼古丁、多環(huán)芳烴(PAH)例如苯并芘(BaP)和氯化二噁英以及呋喃類例如四氯二苯并二噁英(TCDD)以及P-萘黃酮(BNF)等的化合物；和b)組織特異性啟動子是肺組織特異性啟動子，特別是控制肺組織特異性蛋白質(zhì)的表達的啟動子，特別是i.控制在呼吸和終末細支氣管的非纖毛支氣管上皮細胞(克拉拉細胞)中特異性表達的蛋白質(zhì)，例如克拉拉細胞IO蛋白的啟動子，特別是CC10蛋白啟動子；ii.控制在肺泡上皮細胞中特異性表達的蛋白質(zhì)，例如表面活性劑蛋白A/C的啟動子；iii.控制在I型和II型肺上皮細胞中特異性表達的蛋白質(zhì)，例如RAIG1的啟動子。10.產(chǎn)生前述權(quán)利要求中任一項的轉(zhuǎn)基因動物的方法，其包括(i)用權(quán)利要求8和9的栽體分子轉(zhuǎn)染靶動物。11.評估當間斷性應用時，試劑或組合物在動物的特定組織中的致癌潛能的方法，其包括(i)將權(quán)利要求1-7中任一項的轉(zhuǎn)基因動物與待評估的試劑或組合物接觸；(ii)阻斷或失活目的基因的表達，從而在動物的特定組織的細胞內(nèi)引起遺傳畸變，(iii)鑒定和測定所述遺傳畸變；(iv)將來自經(jīng)處理的動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目與來自未處理的轉(zhuǎn)基因動物或用對照試劑處理的轉(zhuǎn)基因動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目相比較，其中經(jīng)處理的動物中的轉(zhuǎn)化細胞的數(shù)目與差異指示了測試化合物的致癌潛能。12.用于評估由試劑或組合物誘導的致癌過程的可逆性的方法，其包括(i)按照確定的時間方案間斷性地將權(quán)利要求l—7中任一項的轉(zhuǎn)基因動物與待評估的試劑或組合物接觸；(ii)阻斷或失活目的基因的表達，從而在動物的特定組織的細胞內(nèi)引起遺傳畸變，(iii)鑒定和測定所述遺傳畸變；(iv)中止轉(zhuǎn)基因動物與待評估的試劑或組合物接觸，將來自間斷性處理的動物的樣品中的遺傳改變的細胞的數(shù)目與在已處理中止后給定的時間，來自動物的樣品中的改變的細胞的數(shù)目相比較，和Uv)測定致癌過程的可逆性。全文摘要本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因非人動物，特別是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，但尤其地轉(zhuǎn)基因小鼠，其允許轉(zhuǎn)基因表達的同時、組織特異性和時間控制性調(diào)控并且可用作研究參與某些疾病例如癌癥但特別地肺癌的起始和進展的連續(xù)步驟的工具。文檔編號A01K67/027GK101594777SQ200780050208公開日2009年12月2日申請日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日發(fā)明者J·舒勒,韓萬江申請人:菲利普莫里斯生產(chǎn)公司