專利名稱：：用于細菌感染的抗微生物療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明關(guān)于一種用于定向誘變及異源表達的分子遺傳學(xué)方法以及細菌性發(fā)病機理的活體外和活體內(nèi)模型以闡明金黃色葡萄球菌色素是致病因子及抗微生物療法的潛在新穎目標。
背景技術(shù)：
：Ogston(1881)杜撰了葡萄球菌屬(genusStaphylococcus)以闡述葡萄樣細菌簇(staphylo=葡萄，Gr.)并且自外科手術(shù)膿腫獲取了葡萄球菌屬。此后不久，Rosenbach(1884)在純凈培養(yǎng)物中分離出此病原體并根據(jù)其相對于經(jīng)常寄居在皮膚表面的低毒力葡萄球菌(staphylococci)的特征表面色素沉著提出了種屬名稱金黃色葡萄球菌(S.aureus(金色，拉丁文))。在進入其七十年代后，抗微生物療法時代已大大地減少了由感染性疾病引發(fā)的發(fā)病和死亡。然而，出現(xiàn)的抗性微生物現(xiàn)在已達流行性比例并對醫(yī)學(xué)界提出了巨大的挑戰(zhàn)。突出革蘭氏陽性細菌病原體金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)特別明顯的令人擔憂的趨勢，其對第一線抗生素療法變得越來越?jīng)]有反應(yīng)。在世界上，金黃色葡萄球菌可能是危及生命的急性細菌感染的最常見原因，且其能夠造成各種各樣的疾病，嚴重程度自簡單的燙傷或膿皰病到爆發(fā)性膿毒癥或中毒性休克綜合征。金黃色葡萄球菌是菌血癥、醫(yī)院相關(guān)(院內(nèi))感染、皮膚及軟組織感染、傷口感染、及骨骼和關(guān)節(jié)感染的單一主導(dǎo)因素。其是心內(nèi)膜炎及食物中毒的若干最常見病因中的一種。對24,000種以上侵潤性細菌分離物的全國前瞻性調(diào)研顯示與疾病有關(guān)的具有甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌菌株(MRSA)已經(jīng)自22%(1995年)增加到57%(目前)?，F(xiàn)在，MRSA經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于社會獲得性感染以及醫(yī)院中。急需發(fā)現(xiàn)用以解除此真實公共健康危害的新穎抗生素類別。半世紀以來，人們基于<10個抗菌支架合成類似物已經(jīng)研發(fā)了>100種抗菌劑并將其投放市場，但除了噁唑烷酮核心之外，在過去30年里沒有出現(xiàn)用以解決出現(xiàn)的抗性問題的新穎支架。研發(fā)靶向諸如金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素色素等細菌致病因子的新穎類別抗生素是一種人們尚未注意到其潛在優(yōu)勢的方法。經(jīng)典抗生素方法試圖通過靶向主要細胞功能(例如，細胞壁生物合成、蛋白質(zhì)合成、DNA復(fù)制、RNA聚合酶、或代謝途徑)來殺死細菌或抑制細菌生長。這些常用療法具有較高毒性風(fēng)險，這是因為許多所述細胞功能對于哺乳動物細胞也是十分重要的并且需要在微生物目標與宿主細胞對應(yīng)部分之間進行精細的分子區(qū)分。第二，相同主要目標的重復(fù)使用意味著當細菌在治療期間對特定抗生素藥劑產(chǎn)生抗性時，即使所述細菌從未暴露于作用于所述目標的其它藥劑，其也可能會同時對所述其它藥劑產(chǎn)生交叉抗性。第三，常用療法對細菌施加"生或死"的挑戰(zhàn)，因此，所述細菌會承受發(fā)展針對所述抗微生物藥劑抗性的強大選擇壓力。最后，許多通用抗生素具有廣譜活性以及會根除許多正常菌群組成的副作用，進而產(chǎn)生不期望并發(fā)癥，例如，難辨梭狀芽孢桿菌結(jié)腸炎或續(xù)發(fā)性真菌感染(例如，念珠菌屬(Candida)感染)。在金黃色葡萄球菌感染的經(jīng)驗療法中，出現(xiàn)的MRSA可順應(yīng)甲氧西林及相關(guān)抗生素(苯唑西林(oxacillin)、雙氯西林(dicloxacillin))及所有頭孢菌素類(cephalosporings)(例如，頭孢唑林(cefazolin)、頭孢力新(cephalexin))的臨床使用。MRSA經(jīng)常會對大環(huán)內(nèi)酯類(例如，紅霉素)、(3-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合(例如，優(yōu)立新(Unasyn)、奧格門汀(Augmentin))及氟喹諾酮類(例如，環(huán)丙沙星(ciprofloxacin))具有明顯水平的抗性且偶爾會對克林霉素(clindamycin)、甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲基異噁唑(trimethoprim/sulfamethoxisol)(Bactrim)、及禾U福平(rifampin)產(chǎn)生抗性。在嚴重的金黃色葡萄球菌感染中，靜脈注射萬古霉素是最后的辦法，但現(xiàn)在也有關(guān)于金黃色葡萄球菌對萬古霉素(一種常用于治療MRSA的靜脈注射抗生素)抗性的令人感到驚慌的報告。諸如利奈唑胺(linezolid)(Zyvox)或奎奴普汀(quinupristin)/達福普汀(dalfopristin)(Synercid)(二者均以與核糖體亞單位結(jié)合的方式利用傳統(tǒng)目標來抑制RNA合成)等新穎抗-MRSA藥劑是相當昂貴的。對于金黃色葡萄球菌色素的后續(xù)研究已闡明可產(chǎn)生一系列類胡蘿卜素的具體生物合成途徑。在飲食水果及植物中產(chǎn)生的類似類胡蘿卜素依靠其自由基清除性質(zhì)及淬滅單態(tài)氧的異常能力而成為公認的強效抗氧化劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明闡明類胡蘿卜素在微生物中可用作致病/抗性因子。在一個具體實施例中，本發(fā)明闡明金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素是一種可依靠其抗氧化劑性質(zhì)削弱嗜中性粒細胞殺傷及促進疾病發(fā)病的致病因子，及(2)表明類胡蘿卜素色素生成的藥理抑制可致使有機體對氧化劑及血液殺傷更敏感。本發(fā)明提供一種治療細菌感染的方法，其包括對遭受所述感染的受試者投與可抑制細菌中類胡蘿卜素生成及/或活性的藥劑。在一個實施例中，所述細菌感染是葡萄球菌感染。在另一實施例中，所述細菌是葡萄球菌屬。在又一實施例中，所述細菌是金黃色葡萄球菌。本發(fā)明還提供一種通過靶向類胡蘿卜素來預(yù)防、治療MRSA或改進MRSA治療有效性的方法。一方面，所述類胡蘿卜素是葡萄球菌屬類胡蘿卜素。另一方面，所述方法包括涉及胡蘿卜素形成抑制劑的類胡蘿卜素耙向。在又一實施例中，所述胡蘿卜素形成抑制劑是多功能氧化酶抑制劑，例如，2-二乙基氨基乙基-2，2-二苯基-戊酸酯(SKF525陽A)。本發(fā)明還提供一種篩選用于治療細菌感染的MRSA治療劑的方法，其包括使可產(chǎn)生類胡蘿卜素的細菌與懷疑可抑制類胡蘿卜素生成或活性的測試藥劑接觸，并測量所述藥劑在氧化劑存在及不存在時的效果。圖1A-E顯示金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素色素的遺傳操控及其抗氧化劑功能。A)用于通過等位基因置換實施金黃色葡萄球菌crtM(編碼脫氫角鯊烯合酶)胡蘿卜素形成及誘變作用的生化途徑。B)金黃色葡萄球菌色素沉著在ACrtM突變體中的消除；金黃色葡萄球菌4'4'-二脫輔基鏈孢紅素色素在釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)中的異源表達。金黃色葡萄球菌ACrtM突變體對C)過氧化氫或D)單態(tài)氧殺傷的敏感性增加，在與pCrtMN互補時WT抗性水平恢復(fù)。E)表達4'4'-二脫輔基鏈孢紅素的釀膿鏈球菌的單態(tài)氧敏感性降低。誤差棒代表所繪變量的標準偏差；所示結(jié)果代表至少3組實驗。圖2A-F顯示金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素色素在嗜中性粒細胞及全血中賦予對氧化劑殺傷的抗性。WT及ACrtM金黃色葡萄球菌在A)具有分離人類嗜中性粒細胞的共培養(yǎng)物及B)鼠類全血中的存活率。在(B)中還顯示與單獨載體或pCrtMN互補的ACrtM的全血存活率。(C)crtMN的質(zhì)粒表達對釀膿鏈球菌在小鼠全血中存活率的影響。D)氧化猝發(fā)抑制劑DPI對WT及ACrtM突變體金黃色葡萄球菌人類嗜中性粒細胞共培養(yǎng)物存活率的影響。PhM-/-Ph。"wT及ACrtM突變體金黃色葡萄球菌在E)正常人及缺少NADPH氧化酶功能的gp47Ph°x—、患者或者F)野生型CD1和C57B1/6小鼠及gp91Ph°x—A小鼠的血液中的相對存活率。結(jié)果代表至少3組實驗。使用CGD人類患者血液的分析實施兩次。.圖3A-C顯示金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素在皮下膿腫模型中產(chǎn)生毒力。用接受對比的兩種菌株在小鼠的左右側(cè)進行皮下注射。線型圖繪示由指定菌株產(chǎn)生的總累積皮膚損傷面積。散點圖上的點=自每一小鼠個體皮膚損傷回收的經(jīng)著色菌株與未經(jīng)著色菌株的cfu比例。照片圖像繪示每一治療組的代表性小鼠。A)CD1小鼠中的野生型(WT)與ACrtM突變體金黃色葡萄球菌，B)gp9lPh。"小鼠中的WT與ACrtM突變體金黃色葡萄球菌，及C)葡萄球菌4'4'-二脫輔基鏈孢紅素的釀膿鏈球菌+/-表達。圖4A-B顯示抑制金黃色葡萄球菌色素生成可增加氧化劑敏感性及提高吞噬細胞清除率。在指定濃度的SKF525-A存在或不存在時培養(yǎng)野生型及ACrtM突變體金黃色葡萄球菌。此圖繪示對A)色素沉著表現(xiàn)型、B)單態(tài)氧敏感性、及C)在鼠類全血中存活率的觀測影響。所示結(jié)果代表至少3組實驗。圖5A-D闡明對金黃色葡萄球菌crtM基因的等位基因置換缺少多型性影響。A)活細菌在WT金黃色葡萄球菌與ACrtM突變體的固定相培養(yǎng)物中的固定相濃度的類似性及細菌在新鮮THB培養(yǎng)基中的后續(xù)生長動力學(xué)。WT金黃色葡萄球菌與ACrtM突變體在如下方面缺少可測量差異B)浮力密度，通過在Percoll中遷移評定C)疏水性，通過分配到正十六烷中來測量，及D)表面電荷，通過細胞色素C結(jié)合測定。圖6A-F顯示關(guān)于金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素色素抗吞噬性質(zhì)的進一步分析。A)WT及AcrtM突變體金黃色葡萄球菌是以相當?shù)乃俾适艿饺祟愂戎行粤＜毎淌?。代表性研究的反巻積熒光顯微鏡檢査顯示細胞內(nèi)(綠色)及細胞外(紅色)有機體。B)WT及AcrtM突變體金黃色葡萄球菌可激起類似程度的人類嗜中性粒細胞氧化猝發(fā)，如通過氮藍四唑還原測量得。C)氧化猝發(fā)抑制劑二伸苯基碘鎗(DPI)對WT及ACrtM突變體金黃色葡萄球菌在正常小鼠血液中存活率的影響。WT及ACrtM突變體金黃色葡萄球菌菌株對由D)顆粒蛋白酶組織蛋白酶G及人類嗜中性粒細胞彈性蛋白酶或E)鼠類組織蛋白酶抑制素mCRAMP引發(fā)的殺傷的敏感性。F)嗜中性粒細胞細胞內(nèi)存活率在金黃色葡萄球菌WT與ACrtM突變體金黃色葡萄球菌之間的差異于用自體血清進行預(yù)調(diào)料的實驗(如那些不含血清者)中是類似的(例如，圖6A)。具體實施例方式除非上下文明確指出，否則本文及隨附權(quán)利要求中所用單數(shù)形式"一"、"一個"及"所述"包括復(fù)數(shù)個指示物。由此，例如，當提及"一蛋白質(zhì)"時包括復(fù)數(shù)個所述蛋白質(zhì)且當提及"所述細胞"時包括提及一或多個熟悉所屬技術(shù)的人員已知的細胞，坐坐寸寸°除非另有說明，否則本文所用所有技術(shù)及科學(xué)用語均具有與一熟悉本發(fā)明所屬技術(shù)的普通人員通常所了解的意義相同的意義。盡管本文闡述了例示性方法、裝置及材料，但類似于或等效于那些本文所闡述者的方法及材料也可用于實踐所揭示方法及組合物。上文及本文通篇中所討論公開案僅因為其揭示內(nèi)容先于本申請案的申請日期而提供。不得將本文中任何內(nèi)容解釋為承認本發(fā)明者無權(quán)使本發(fā)明早于先前揭示內(nèi)容。本發(fā)明提供用于治療微生物感染的方法及組合物，其中所述微生物表達類胡蘿卜素。例如，本發(fā)明提供用于治療金黃色葡萄球菌感染(包括那些由甲氧西林-及萬古霉素-抗性菌株產(chǎn)生的感染)的方法及組合物。本發(fā)明的方法及組合物可單獨或聯(lián)合傳統(tǒng)抗微生物劑及抗生素使用以治療所述感染。另外，本文所揭示方法和組合物可用于諸如異物、導(dǎo)管等裝置或血管內(nèi)感染、慢性骨髓炎、醫(yī)院獲得性或手術(shù)后感染、復(fù)發(fā)性皮膚感染、或用于免疫妥協(xié)宿主的金黃色葡萄球菌感染。類胡蘿卜素代表一大類自然色素。在細菌、真菌、藻類、植物及動物中已識別出600種以上不同的類胡蘿卜素(Staub,O.，In:Pfander，H.(編輯)，KeytoCarotenoids，第2版，BirkhuserVerlag,Basel)。所述類胡蘿卜素可用作光合作用的輔助色素、抗氧化劑、人類及動物中維生素的前體以及用于光保護及菌種特異性染色的色素。類胡蘿卜素在歷史上具有重要作用，例如，用于醫(yī)藥、食品著色劑和動物飼料及營養(yǎng)強化劑。如下發(fā)現(xiàn)增強了人們對這些天然產(chǎn)物在醫(yī)藥應(yīng)用方面的興趣這些天然產(chǎn)物在預(yù)防癌癥及慢性疾病方面可起重要作用(主要歸因于其抗氧化性)及，最近，因其與癌細胞之間的特異性相互作用而使其呈現(xiàn)顯著的腫瘤抑制活性(Bertram,J.S.，Nutr.Rev.，1999;57:182-191;Singh等人，Oncology,1998;12:1643-168;Rock,C.L.,Pharmacol,Ther.,1997;75:185-197;Edge等人，J.Photochem.Photobiol.,1997;41:189-200)。類胡蘿卜素可通過組合來自不同有機體的生物合成基因以創(chuàng)造生物合成途徑來在重組微生物中產(chǎn)生。目前，已經(jīng)自可用于制造各種各樣類胡蘿卜素的細菌、植物、藻類及真菌中分離出150個以上的用于24種胡蘿卜素形成酶(crt)的基因。已經(jīng)自許多細菌克隆出若干完整類胡蘿卜素生物合成途徑，其中生物合成酶基因在基因簇中排列(參見Armstrong,Ann.Rev.Microbiol"1997,51:629;Sandmann,Eur.J.Biochem.，1994，223:7)。分別用于合成玉米黃質(zhì)二糖苷及無環(huán)葉黃素球形烯(spheroidene)和球形烯酮(spheroidenone)的Erwinia及Rhodobacter途徑是自其識別出所有涉及酶的第一途徑(Arms加ng等人，Mol.&GeneralGene"1989,216:254;Lang等人，J.Bacteriol.,1995,177:2064;Lee及Liu,Mol.Microbiol"1991,5:217;Misawa等人，J.Bacteriol.,1990,172:6704)。各種技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于克隆胡蘿卜素形成基因(Hirschberg,J.,In:Carotenoids:BiosynthesisandMetabolism,第3巻，Carotenoids,G.Britton,Ed.Basel:BirkhuserVerlag,148-194,1998)。功能顏色互補在自Erwinia表達胡蘿卜素形成基因的大腸桿菌中已成功地用于克隆各種微生物及植物胡蘿卜素形成基因(Verdoes等人，Biotech,andBioeng.,1999,63:750;Zhu等人，PlantandCellPhysiology,1997,38:357;Kajiwara等人，PlantMol.Biol.,1995，29:343;Pecker等人，PlantMol.Biol.，1996,30:807;關(guān)于植物類胡蘿卜素生物合成可參見Hirschberg等人，PureandAppliedChemistry,1997,69:2151;CunninghamandGantt,Ann.Rev.ofPlantPhysiol及PlantMol.Biol"1998，49:557)。編碼早期類胡蘿卜素生物合成酶GGDP合酶、八氫番茄紅素合酶及八氫番茄紅素去飽和酶的基因占所有克隆胡蘿卜素形成基因的一半以上?？色@得不同的八氫番茄紅素去飽和酶基因，其可將2個、3個、4個或5個雙鍵導(dǎo)入八氫番茄紅素中以分別產(chǎn)生胡蘿卜素(植物、藍色細菌、藻類)(Bartley等人，Eur.J.ofBiochem.,1999,259:396)、鏈孢紅素(紅色細菌)(Raisig等人，J.Biochem.,1996,119:559)、番茄紅素(大多數(shù)真細菌及真菌)(Verdoes等人，Biotech,andBioeng.,1999,63:750;RuizHidalgo等人，Mol.&Gen.Genetics,1997,253:734)或3,4-二脫氫番茄紅素(粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa))(Schmidhauser等人，Mol.andCellBiol.，1990,10:5064)。下列是已經(jīng)克隆出類胡蘿卜素生物合成基因的實例crtE:來自莢膜紅色細菌(R.capsulatus)及噬夏孢歐文氏桿菌(E.uredovora)的GGPP-合酶crtB:來自莢膜紅色細菌及噬夏孢歐文氏桿菌的八氫番茄紅素合酶crtl:來自噬夏孢歐文氏桿菌及草生歐文氏菌(E.herbicola)的八氫番琉紅素去飽和酶crtY:來自噬夏孢歐文氏桿菌及草生歐文氏菌的番茄紅素環(huán)化酶crtA:來自莢膜紅色細菌及球形紅細菌(R.spaeroides)的球形烯單氧合酶crtO:來自藍細菌(Synechocistissp)的P-C4-酮酶(氧合酶)。crtW:來自產(chǎn)堿菌(Algaligenessp.)、海洋細菌(A.aurantiacum)的卩-C4-酮酶crtD:來自莢膜紅色細菌及球形紅細菌的甲氧基鏈孢紅素去飽和酶crtX:來自噬夏孢歐文氏桿菌及草生歐文氏菌的玉米黃質(zhì)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶crtZ:來自噬夏孢歐文氏桿菌及草生歐文氏菌的P-胡蘿卜素羥化酶crtU:來自灰色鏈霉菌(S.griseus)的p-胡蘿卜素去飽和酶crtM:來自金黃色葡萄球菌的脫氫角鯊烯合酶crtN:來自金黃色葡萄球菌的脫氫角鯊烯去飽和酶。與經(jīng)常寄居在皮膚表面上的低毒力葡萄球菌(例如，表皮葡萄球菌)相比，主要的人類病原體金黃色葡萄球菌(S.aureus)因其特征金黃色色素沉著(aureus^金色，拉丁文)得名。關(guān)于金黃色葡萄球菌色素的后續(xù)研究揭開了產(chǎn)生一系列類胡蘿卜素的具體生物合成途徑。在飲食水果及植物中產(chǎn)生的類似類胡蘿卜素依靠其自由基清除性質(zhì)及淬滅單態(tài)氧的異常能力而成為公認的強效抗氧化劑。所述金黃色葡萄球菌色素可具有類似性質(zhì)。本發(fā)明檢査了金黃色葡萄球菌是否可利用其金色類胡蘿卜素色素來抵抗宿主先天免疫系統(tǒng)的基于氧化劑的清除機制。例如，嗜中性粒細胞及巨噬細胞可通過使殺死其已吞噬細菌的反應(yīng)性分子(例如，過氧化物、漂白劑及單態(tài)氧)產(chǎn)生"氧化猝發(fā)"來殺死細菌。由類胡蘿卜素色素產(chǎn)生的金色是人類病原體金黃色葡萄球菌的齊名特征。配對誘變與異源表達的分子遺傳學(xué)分析已用于證實此標志表現(xiàn)型實際上是一種借助其抗氧化劑性質(zhì)來保護所述細菌免受吞噬殺傷的致病因子。在本世紀中，在社會及醫(yī)院中，此重要病因的有效控制受到抗微生物劑抗性迅速發(fā)展的危害。本發(fā)明闡明抑制胡蘿卜素形成可為并發(fā)性金黃色葡萄球菌感染治療提供一種新穎治療方法，其可有效地致使所述病原體對由正常宿主先天免疫防御產(chǎn)生的清除更敏感。本發(fā)明闡明類胡蘿卜素色素生成可造成B組鏈球菌(GBS)對巨噬細胞殺傷產(chǎn)生抗性。在人類新生兒中，GBS是諸如肺炎、敗血癥及腦膜炎等侵潤性細菌感染的主要原因。人們已識別出類胡蘿卜素色素(CylE)生成所需基因。所述色素為有機體產(chǎn)生具有在疾病發(fā)病中起重要作用的細胞損傷及促炎性質(zhì)的溶血素/細胞溶素毒素所需。與侵潤性感染相關(guān)的其它細菌及真菌人類病原體(例如，煙曲菌(Aspergillusfumigatus)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcesens"可產(chǎn)生具有抗氧化劑性質(zhì)的類胡蘿卜素或黑色素樣色素，表明常見致病主因并揭露針對吞噬細胞清除機制的潛在色素生成選擇性優(yōu)點。因此，可將用于抗微生物療法的靶向色素生成方法推廣至產(chǎn)生色素(例如，類胡蘿卜素色素或其它可賦予氧化保護的色素)的有機體。確切地說，曲霉菌屬(Aspergillussp.)是導(dǎo)致免疫妥協(xié)受試者(例如，接受癌癥化學(xué)治療者)死亡的重要原因且洋蔥伯克霍爾德氏菌是造成纖維性囊腫患者死亡的重要原因。曲霉菌及伯克霍爾德氏菌二者經(jīng)常具有多種藥物抗性并對現(xiàn)存抗生素療法具有頑抗性。本發(fā)明闡明通過使用耙向基因刪除分子遺傳學(xué)方法(以創(chuàng)造未經(jīng)著色金黃色葡萄球菌突變體)及克隆技術(shù)(以在其它細菌中表達所述金黃色葡萄球菌色素)以創(chuàng)造"活性劑(livingreagent)"來確定所述色素在金黃色葡萄球菌疾病發(fā)病中的真實重要性。金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素色素的確可保護細菌免受過氧化物及單態(tài)氧的損害并使其在小鼠及人類血液中對殺傷更具抗性及對由純化人類嗜中性粒細胞引起的殺傷更具抗性。借助形成金黃色葡萄球菌膿腫的小鼠模型，表明類胡蘿卜素色素在活體內(nèi)可提升細菌存活率及加速疾病進展。使用在嗜中性粒細胞氧化劑生成中受傷的小鼠的對照實驗證實生成的類胡蘿卜素色素可依靠其抗氧化劑性質(zhì)來產(chǎn)生金黃色葡萄球菌毒力。本發(fā)明闡明在藥理學(xué)上抑制金黃色葡萄球菌色素生成可導(dǎo)致所述細菌對氧化劑更敏感并會降低血液存活率。通過吞噬細胞清除病原體的一個重要機制是通過釋放由NADPH氧化酶產(chǎn)生的反應(yīng)性氧物質(zhì)。本發(fā)明闡明諸如那些由金黃色葡萄球菌表達者等類胡蘿卜素起針對這些防御分子的保護作用。例如，與WT金黃色葡萄球菌菌株相比，ACrtM突變體可以lO倍至100倍更有效的方式受到過氧化氫殺傷且其可以100倍至1，000倍更有效的方式受到單態(tài)氧殺傷。類似地，葡萄球菌色素在釀膿鏈球菌中的異源表達與單態(tài)氧致死率降低100倍至1,000倍有關(guān)。本發(fā)明提供用于治療微生物感染及促進抗微生物活性的抑制胡蘿卜素形成的方法及藥劑。例如，一方面，多功能氧化酶抑制劑2-二乙基氨基乙基-2,2-二苯基-戊酸酯(SKF525-A,Calbiochem)顯示在金黃色葡萄球菌中抑制色素形成，且在所述藥劑存在下生長的金黃色葡萄球菌WT菌株中表現(xiàn)出類胡蘿卜素生成的劑量依賴性降低。阻斷金黃色葡萄球菌色素形成導(dǎo)致有機體對單態(tài)氧殺傷的敏感性出現(xiàn)相稱的劑量依賴性增加及其存活于人類全血中的能力降低。作為對照，使ACrtM突變體在平行實驗中暴露于SKF525-A，對氧化劑敏感性或血液存活率無明顯影響。本發(fā)明提供用于通過抑制類胡蘿卜素生成及/或活性來治療細菌感染的方法和組合物。更具體來說，本發(fā)明提供治療具有細菌感染(例如，葡萄球菌屬細菌感染)的受試者的方法，其包括使受試者與可抑制葡萄球菌屬的類胡蘿卜素活性及/或生成的藥劑接觸。一方面，所述藥劑是小分子、聚核苷酸(例如，核酶或反義分子)、多肽(例如，抗體)或擬肽物質(zhì)。在本發(fā)明的一個方面中，所述藥劑是一種可抑制胡蘿卜素形成的藥理劑。例如，所述藥劑可為多功能氧化酶抑制劑，例如2-二乙基氨基乙基-2,2-二苯基-戊酸酯(SKF525-A,Calbiochem)、2,4-二氯-6-苯基苯氧基乙基胺、2,4-二氯-6-苯基苯氧基乙基二乙基胺及胡椒基丁醚。另一方面，所述胡蘿卜素形成抑制劑包括寡核苷酸或聚核苷酸(例如，反義核苷酸、核酶或siRNA)。例如，反義技術(shù)是一種下調(diào)其中目標基因序列已知的基因的方法。在包含葡萄球菌屬基因的技術(shù)中己知諸多類胡蘿卜素基因。在此方面中，己經(jīng)克隆出來自期望基因(例如，crtM及/或crtN)的核酸片段并將其以可操作方式連接到啟動子以便于RNA的反義鏈會受到轉(zhuǎn)錄。隨后將此構(gòu)建體導(dǎo)入目標細胞中并產(chǎn)生RNA的反義鏈。反義RNA可通過阻止編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的mRNA累積來抑制基因表達。因此，針對crtM及/或crtN的反義分子可減少病原微生物的類胡蘿卜素合成，藉此致使所述微生物對由吞噬細胞引起的氧化損傷敏感。熟悉所屬技術(shù)的人員可知應(yīng)考慮某些與反義技術(shù)使用相關(guān)的因素以減少特定基因表達。例如，反義基因的適當表達可能會需要借助熟悉所屬技術(shù)人員己知的不同調(diào)節(jié)因子來使用不同嵌合基因。在本發(fā)明的上下文中，顯然，通過使用抑制性核酸來調(diào)控細菌類胡蘿卜素生物合成途徑的表達可提供一種有用的治療方法。例如，本發(fā)明已識別出編碼類胡蘿卜素生物合成途徑中酶的基因，包括crtM和crtN。或者(或另外)，可能需要剔除導(dǎo)致C3o類胡蘿卜素合成的crtM/crtN基因。常用分子生物技術(shù)可用于產(chǎn)生抑制性核酸分子，例如，可與野生型細菌(例如，葡萄球菌屬)產(chǎn)生的crtN及/或M核酸相互作用的反義分子。本文所用分離核酸實質(zhì)上不含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及與體內(nèi)生成核酸自然締合的其它核酸。通常，所述核酸的純度為至少70重量％、80重量％、90重量％或以上，且用于在活體外合成核酸的常用方法可用于代替活體內(nèi)方法。本文所用"核酸"或"聚核苷酸"或"寡核苷酸"是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，其呈獨立片段形式或作為較大遺傳構(gòu)建體的組成(例如，通過以可操作方式將啟動子連接到編碼(例如)反義分子的核酸)。在所屬技術(shù)中已知許多遺傳構(gòu)建體(例如，質(zhì)粒及其它表達載體)且其可用于在不含細胞的系統(tǒng)或原核細胞或真核(例如，酵母菌、昆蟲、或哺乳動物)細胞中產(chǎn)生本發(fā)明的期望核酸。本發(fā)明的核酸可容易地用于常用分子生物技術(shù)以產(chǎn)生本發(fā)明的肽?？蓪戳x核酸、核酶或siRNA的聚核苷酸插入"表達載體"中。術(shù)語"表達載體"是指一種遺傳構(gòu)建體，例如質(zhì)粒、病毒或其它可經(jīng)改造以含有(例如)反義分子的所屬技術(shù)已知的介體。所述表達載體通常含有復(fù)制源及啟動子以及方便轉(zhuǎn)化細胞表型選擇的基因。各種啟動子(包括誘導(dǎo)型及組成型啟動子)均可用于本發(fā)明。通常，所述表達載體含有源自與宿主/目標細胞兼容的物種的控制序列及復(fù)制子位點?？墒褂檬煜に鶎偌夹g(shù)的人員己知的常用技術(shù)對具有本發(fā)明聚核苷酸的宿主/目標細胞實施轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。例如，當所述宿主細胞是大腸桿菌時，可使用所屬技術(shù)中已知的CaCl2、MgCl2或RbCl方法來制備能夠吸收DNA的感受態(tài)細胞?；蛘?，可使用諸如電穿孔或顯微注射等物理方法。電穿孔可通過高壓電脈沖將聚核苷酸轉(zhuǎn)移到細胞中。另外，可通過原生質(zhì)體融合使用所屬技術(shù)中熟知的方法將聚核苷酸導(dǎo)入宿主細胞中。人們還知道用于轉(zhuǎn)化真核細胞的適宜方法，例如，電穿孔及脂轉(zhuǎn)染。本發(fā)明所涵蓋的宿主細胞或目標細胞是任何其中本發(fā)明的聚核苷酸可用于表達抑制性核酸分子的細胞。所述術(shù)語還包括宿主/目標細胞的任何子代。有用的宿主/目標細胞包括細菌細胞、真菌細胞(例如，酵母菌細胞)、植物細胞及動物細胞。例如，宿主細胞可為高等真核生物細胞(例如，哺乳動物細胞)、低等真核生物細胞(例如，酵母菌細胞)，或者所述宿主細胞可為原核動物細胞(例如，細菌細胞)?？赏ㄟ^磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔來實現(xiàn)所述構(gòu)建體至所述宿主細胞的導(dǎo)入(Davis，L.,Dibner，M.,Battey,L,BasicMethodsinMolecularBiology(1986))。作為適當宿主的代表性實例，可提及真菌細胞，例如，酵母菌；昆蟲細胞，例如，Dros叩hilaS2及Spod叩teraSf9;動物細胞，例如，CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物細胞，及諸如此類。適當宿主的選擇被視為屬于熟悉所屬技術(shù)人員根據(jù)本文教示內(nèi)容可知的范圍。宿主細胞可為真核生物宿主細胞(例如，哺乳動物細胞)。一方面，所述宿主細胞是適合在細胞培養(yǎng)物中生長的哺乳動物產(chǎn)生細胞。常用于工業(yè)的所述細胞的實例為CHO、VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos;Cos-7)、MDCK、293、3T3、C127、骨髓瘤細胞系(尤其為鼠類骨髓瘤細胞系)、PC12及W138細胞。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞廣泛地用于產(chǎn)生若干復(fù)雜的重組蛋白質(zhì)，例如，細胞因子、凝血因子及抗體(Brasel等人，Blood88:2004-2012,1996;Kaufman等人，J.BiolChem263:6352-6362,1988;McKinnon等人，JMolEndocrinol6:231-239,1991;Wood等人，J.Immunol145:3011-3016,1990)。缺乏二氫葉酸還原酶(DHFR)的突變體細胞系(Urlaub等人，ProcNatlAcadSciUSA77:4216-4220，1980)是常用的CHO宿主細胞系，這是因為有效的DHFR可選擇及可擴增基因表達系統(tǒng)有利于在這些細胞中高水平地表達重組蛋白質(zhì)(Kaufman,MethEnzymol185:527-566,1990)。另外，這些細胞易于作為貼壁或懸浮培養(yǎng)物操作并呈現(xiàn)相當好的遺傳穩(wěn)定性。已經(jīng)對CHO細胞及在其中表達的重組蛋白質(zhì)進行了詳盡地表征且所述CHO細胞及重組蛋白質(zhì)已由管理機構(gòu)獲準用于臨床生成?？墒褂弥T如本文所述分析(活體外和活體內(nèi)分析)等熟悉所屬技術(shù)的人員已知的常用方法來測定這些抑制藥劑(例如，小分子(2-二乙基氨基乙基-2,2-二苯基-戊酸酯)及抑制性核酸)的活性。本發(fā)明還提供一種用于通過使細菌與抑制有效量的類胡蘿卜素生物合成抑制劑(即，胡蘿卜素形成抑制劑)接觸來抑制所述細菌生長的方法。術(shù)語"接觸"是指使微生物(例如，細菌)暴露于藥劑以便于所述藥劑能夠抑制、殺死或裂解微生物或致使其對氧化性破壞敏感。有機體與可抑制類胡蘿卜素生物合成的藥劑的接觸可通過(例如)將所述藥劑添加到細菌培養(yǎng)物中或使沾染有細菌的表面與所述藥劑接觸來在活體外發(fā)生。或者，接觸可通過(例如)將所述藥劑投與遭受細菌感染或易受到感染的受試者來在活體內(nèi)發(fā)生?；铙w內(nèi)接觸包括非經(jīng)腸以及局部接觸。"抑制"或"抑制有效量"是指足以產(chǎn)生(例如)抑菌或殺菌作用、減少特定細菌細胞類別著色、或減少由所述細菌產(chǎn)生的特定類胡蘿卜素數(shù)量的藥劑量?？墒艿筋惡}卜素抑制劑使用影響的細菌包括革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌。例如，可受到影響的細菌包括金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌(A組)、鏈球菌屬(草綠色群組(viridansgroup))、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(B組)、豬鏈球菌(S.bovis)、鏈球菌(厭氧型菌種)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、及腸球菌屬(Enterococcussp.);革蘭氏陰性球菌(Gram-negativecocci)，例如，奈瑟氏淋病雙球菌(Neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎雙球菌(Neisseriameningitidis)、及卡他布蘭漢氏菌(Branhamellacatarrhalis);革蘭氏陽性桿菌(Gram-positivebacilli),例如，炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、痤疫丙酸桿菌(P.acne)、白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)及是類白喉菌的棒狀桿菌屬(Corynebacteriumspecies)(需氧型及厭氧型)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、破傷風(fēng)桿菌(Clostridiumtetani)、難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridiumdifficile)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、腸桿菌屬(Enterobacterspecies)、奇異變形桿菌(Proteusmirablis)及其它菌屬、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、月巿炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏桿菌(Shigella),粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia)、及空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)。確切地說，本發(fā)明的方法和組合物可用于抵抗任何可合成賦予抵抗反應(yīng)性氧物質(zhì)(例如，由NADPH氧化酶產(chǎn)生的物質(zhì))保護的類胡蘿卜素的病原體。受到一種或多種這些細菌感染可能會引發(fā)諸如下述等疾病菌血癥、肺炎、腦膜炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎、鼻竇炎、關(guān)節(jié)炎、泌尿道感染、破傷風(fēng)、壞疽、結(jié)腸炎、急性胃腸炎、膿皰病、痤瘡、酒渣鼻痤瘡(acneposacue)、傷口感染、出生感染、筋膜炎、支氣管炎、及各種膿腫、院內(nèi)感染、及伺機性感染。用于抑制細菌生長的方法還可包括使所述細菌與肽和一種或多種抗生素的組合物接觸。真菌有機體(例如，犬小孢子菌(Microsporumcanis)及其它小孢子菌屬(Microsporumsp.);及毛癬菌屬(Trichophytonsp.)，例如紅色毛蘚菌(T.rubrum)及須發(fā)蘚菌(T.mentagrophytes))、酵母菌(例如，白色念珠菌(Candidaalbicans)、熱帶念珠菌(C.Tropicalis)、或其它念珠菌屬)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)、絮狀表皮癬菌(Epidermophytonfloccosum)、糠秕馬拉色菌(Malasseziafurfur〕(圓形糠秕孢子菌(Pityropsporonorbiculare)、或卵圓糠秕孢子菌(P.ovale))、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、煙曲菌(Aspergillusfumigatus)、構(gòu)巢曲酶(Aspergillusnidulans)、及其它曲霉屬、接合菌(Zygomycetes)(例如，根霉菌(Rhizopus)、毛霉菌(Mucor))、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitides)、夾膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、及申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii)也可受到類胡蘿卜素抑制劑的影響?？蓪⒖捎行У匾种祁惡}卜素(賦予(例如)氧化侵襲抗性)生成之量的類胡蘿卜素生物合成抑制劑投與任何宿主，包括人類或非人類動物。一方面，所述投藥可抑制細菌、病毒、及/或真菌的生長。因此，所述方法及組合物可用作抗微生物劑、抗病毒劑及/或抗真菌劑。各種業(yè)內(nèi)已知方法中的任何一種均可用于單獨或聯(lián)合其它抗生素藥劑投與類胡蘿卜素抑制劑。例如，可以非經(jīng)腸方式通過注射或通過經(jīng)過一段時間逐漸輸注實施投藥。所述藥劑可經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、吸入、或經(jīng)皮投與。另一方面，可單獨或聯(lián)合其它用于局部投藥的抗生素/抗真菌劑調(diào)配類胡蘿卜素生物合成抑制劑(例如，乳液、乳霜、噴霧劑、凝膠或軟膏)。這些局部調(diào)配物可用于治療或抑制存于眼睛、皮膚及粘膜(例如，口、陰道及諸如此類)上的或感染這些組織的微生物、真菌、及/或病毒。市售調(diào)配物的實例包括局部用乳液、乳霜、肥皂、擦及諸如此類。其可調(diào)配成脂質(zhì)體以降低毒性或增加生物利用度。用于遞送藥物的其它方法包括需要將所述調(diào)配物囊封于微球體或類蛋白中的口服方法、氣溶膠遞送(例如，給肺)、或經(jīng)皮遞送(例如，通過離子導(dǎo)入法或經(jīng)皮電穿孔)。其它投藥方法為熟悉所屬技術(shù)的人員所知。適于以非經(jīng)腸方式投與包含類胡蘿卜素抑制劑的組合物的制劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液、及乳液。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄欖油)、及可注射有機酯(例如，油酸乙酯)。水性載劑的實例包括水、鹽水、及經(jīng)緩沖的介質(zhì)、醇性/水性溶液、及乳液或懸浮液。非經(jīng)腸媒劑的實例包括氯化鈉溶液、林格氏葡聚糖(Ringer'sdextrose)、葡聚糖及氯化鈉、乳酸林格氏液、及固定油。靜脈注射媒劑包括流體及營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑(例如，那些基于林格氏葡聚糖者)及諸如此類。還可包含防腐劑及其它添加劑，例如，其它抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及諸如此類。本發(fā)明提供一種用于通過對具有細菌、病毒及/或真菌相關(guān)性病況或處于患所述病況風(fēng)險下的受試者單獨或聯(lián)合其它抗微生物劑投與治療有效量的類胡蘿卜素生物合成抑制劑(例如，crtM及/或crtN抑制劑)或者使所述受試者與所述藥劑接觸來抑制所述病況的方法。術(shù)語"抑制"意指預(yù)防或改善病況的病征或癥狀(例如，皮疹、潰瘍及諸如此類)?？傻玫礁纳频募膊〔≌鞯膶嵗ㄊ茉囌叩腡NF血液水平增加、發(fā)燒、低血壓、嗜中性白血球減少癥、白血球減少、血小板減少癥、彌漫性血管內(nèi)凝血、成人呼吸窘迫綜合征、休克、及器官衰竭?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療的受試者實例包括那些處于患毒血癥(例如，由革蘭氏陰性細菌感染引起的內(nèi)毒素血癥)、毒物中毒或肝衰竭的風(fēng)險下或正遭受所述疾病折磨的受試者。其它實例包括具有皮炎的受試者以及那些具有皮膚感染或由革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌、病毒或真菌引起損傷的受試者。候選受試者的實例包括那些正遭受大腸桿菌、腦膜炎雙球菌、葡萄球菌或肺炎球菌感染者。其它受試者包括那些正遭受槍彈傷、腎或肝衰竭、創(chuàng)傷、燒傷、免疫妥協(xié)感染(例如，HIV感染)、造血系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡斯爾曼氏病(Castleman'sdisease)或心臟粘液瘤折磨的受試者。熟悉醫(yī)學(xué)技術(shù)的人員能夠容易地采用常規(guī)標準識別適合根據(jù)本發(fā)明治療的受試者。治療有效量可通過測量皮膚潰瘍的嚴重性程度作為足以減少受試者皮疹或皮炎癥狀的量加以測量。通常，用足以減少疾病或病況癥狀至少50%、90%或100%之量的本發(fā)明治療組合物來治療受試者。一般來說，最佳劑量將取決于所述病況及諸如下述等因素受試者體重、細菌、病毒或真菌感染類型、體重、性別及癥狀嚴重程度。然而，適宜劑量可由一熟悉所屬技術(shù)的人員容易地確定。通常，適宜劑量為0.5至40毫克/公斤體重，例如，l至8毫克/公斤體重。如上文所述，本發(fā)明的組合物和方法可包括額外(例如，除類胡蘿卜素生物合成抑制劑之外)治療劑(例如，TNF抑制劑、抗生素及諸如此類)的使用?？赏瑫r投與但也可相繼投與類胡蘿卜素生物合成抑制劑、其它治療劑及/或抗生素。適宜抗生素包括氨基糖甙類(例如，慶大霉素(gentamicin))、卩-內(nèi)酰胺(例如，青霉素類及頭孢菌素類)、喹諾酮類(例如，環(huán)丙沙星)及新生霉素。通常，會投與殺菌、抗病毒及/或抗真菌量的抗生素。利用類胡蘿卜素生物合成抑制劑的本發(fā)明方法和組合物可用作適用于解決抗生素抗性細菌菌株生長問題的光譜抗微生物劑及用于治療及/或預(yù)防感染性疾病(包括由諸如炭疽、鼠疫、霍亂、胃腸炎、多藥物抗性結(jié)核病(MDRTB)等生物恐怖因素引起的疾病)爆發(fā)。根據(jù)本發(fā)明，包含胡蘿卜素形成抑制劑的醫(yī)藥組合物可呈適用于借助載劑、賦形劑、及添加劑或輔助劑投與受試者的形式。經(jīng)常使用的載劑或輔助劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇及其它糖類、滑石粉、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動物油及植物油、聚乙二醇及溶劑(例如，無菌水、醇、甘油、及多元醇)。靜脈注射用媒劑包括流體及營養(yǎng)補充劑。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體。其它藥學(xué)上可接受的載劑包括水性溶液、無毒性賦形劑(包括鹽)、防腐劑、緩沖劑及諸如此類，如在(例如)Remington'sPharmaceuticalSciences,第15版，Eastern:MackPublishingCo.,1405-1412，1461-1487(1975)及TheNationalFormularyXIV,，第14版，Washington:AmericanPharmaceuticalAssociation(1975)中所述，所述文獻的內(nèi)容均以引用方式并入本文中?？砂凑账鶎偌夹g(shù)中常規(guī)技術(shù)來調(diào)節(jié)所述醫(yī)藥組合物的pH及各組份的確切濃度。參見GoodmanandGilman's，ThePharmacologicalBasisforTherapeutics(第7版)?？梢跃植炕蛉矸绞酵杜c本發(fā)明的醫(yī)藥組合物。"治療有效劑量"是預(yù)防、治愈、或至少部分地減少細菌感染癥狀所需本發(fā)明藥劑的數(shù)量。當然，對此用途有效的數(shù)量應(yīng)取決于所述疾病的嚴重性及受試者的重量和總體情況。通常，于活體外所用劑量可在用于就地投與所述醫(yī)藥組合物的數(shù)量方面提供有用的指導(dǎo)，且動物模型可用于確定用于治療感染的有效劑量。各種考慮因素闡述于(例如)Langer,Science,249:1527,(1990);Gilman等人(編輯)(1990)中，所述文獻各自以引用方式并入本文中。如本文所用"投與治療有效量"意欲包括對可實施醫(yī)藥組合物的預(yù)期治療功能的受試者給予或施用本發(fā)明醫(yī)藥組合物的方法。治療有效量可視諸如下述等因素而有所變化受試者受感染的程度、個體的年齡、性別和體重?？蓪┝糠桨讣右哉{(diào)整以得到最佳治療反應(yīng)。例如，每日可投與若干分開劑量或者所述劑量可根據(jù)治療情形的緊急程度所示按比例減少。所述醫(yī)藥組合物可以常用方式投與，例如，通過注射(皮下、靜脈等)、經(jīng)口投與、吸入、透皮施用或經(jīng)直腸投與。視投藥途徑而定，所述醫(yī)藥組合物可用一材料涂布以保護所述醫(yī)藥組合物免受酶、酸及其它可能會使所述醫(yī)藥組合物失效的自然條件的作用。所述醫(yī)藥組合物也可以非經(jīng)常方式或經(jīng)腹膜腔內(nèi)投與。分散液也可在甘油、液體聚乙二醇、及其混合物中及在油中制備。在一般儲存及使用條件下，這些制劑包含一防腐劑以防止微生物生長。適用于可注射用途的醫(yī)藥組合物包括無菌水溶液(可溶于水的情況下)或分散液和用于當場制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉劑。在各種情況下，所述組合物均應(yīng)為無菌并應(yīng)為可易于注射的流體狀態(tài)。所述載劑可以是溶劑或分散液介質(zhì)，其包含(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇，及類似物質(zhì))、其適宜混合物及植物油。通過使用(例如)一諸如卵磷脂的包覆層、通過保持所需的粒徑(對于分散劑而言)以及通過使用表面活性劑可保持適當?shù)牧鲃有?。通過各種抗細菌劑和抗真菌劑(例如，對氧苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙基汞硫代水楊酸鈉以及諸如此類)可達成防止微生物的作用。在許多情況下，所述組合物中通常可包括等滲劑，例如，糖類、多元醇類(例如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。通過向組合物中加入可延遲吸收的藥劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)可以使可注射組合物的吸收延長。無菌可注射溶液可通過下述來制備將所需量的醫(yī)藥組合物納入含有上述一種成份或多種成份之組合(視需要而定)的適宜溶劑中，隨后進行無菌過濾。一般來說，分散液通過將所述醫(yī)藥組合物納入一含有基本分散介質(zhì)和所需其它成份(來自那些上文所列舉者)的無菌媒劑中來制備。所述醫(yī)藥組合物可經(jīng)口投與，例如，借助惰性稀釋劑或可吸收的食用載劑。還可將所述醫(yī)藥組合物及其它成份封裝入硬殼或軟殼明膠膠囊中、壓縮成片劑或直接納入個體的飲食中。對于口服治療投藥而言，可將所述醫(yī)藥組合物與賦形劑一起納入并以可吸收片劑、口含片、含片、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙囊劑及類似劑型等形式使用。所述組合物及制劑應(yīng)含有至少0.1重量％的活性化合物。當然，所述組合物及制劑的百分比可有所變化且可方便地介于約5重量％至約80重量％之間(以劑量單元計)。所述片劑、含片、丸劑、膠囊及類似劑型還可包含下述粘合劑，例如，黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉、或明膠；賦形劑，例如，磷酸氫鈣；崩解劑，例如，玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸及類似物質(zhì)；潤滑劑，例如，硬脂酸鎂；及甜味劑，例如，蔗糖、乳糖或糖精；或矯味劑，例如，薄荷、冬青油、或櫻桃調(diào)味料。當劑量單元形式為膠囊時，其除含有上述類型物質(zhì)外還可包含一液體載劑。多種其它材料可作為包衣存在或其存在可另外改進劑量單元的物理形式。例如，片劑、丸劑、或膠囊可用蟲膠、糖或二者涂布。糖漿或酏劑可包括所述藥劑、蔗糖(作為增甜劑)、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯(作為保存劑)、染料及調(diào)味料(例如，櫻桃或橙調(diào)味品)。當然，在制備任何劑量單元形式中所使用的任何材料均應(yīng)具藥用純度且在所用量上是實質(zhì)上無毒/生物可兼容的。此外，可將所述醫(yī)藥組合物納入緩釋制劑及調(diào)配物中。因此，"藥學(xué)上可接受的載劑"意欲包括溶劑、分散介質(zhì)、涂布劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及類似物質(zhì)。所述介質(zhì)和藥劑在藥學(xué)上具活性的物質(zhì)中的使用在所屬技術(shù)中已為人所熟知。除任何常用介質(zhì)或藥劑與所述醫(yī)藥組合物不相容的情況以外，本發(fā)明涵蓋所述介質(zhì)和藥劑在治療組合物及治療方法中的用途。也可將輔助活性化合物納入所述組合物中。以劑量單元形式來調(diào)配非經(jīng)腸組合物特別有利于方便地投藥及達成劑量一致性。本文所用"劑量單元形式"是指適于作為單位劑量供擬受治療個體使用的物理分散單元；需計算包含預(yù)定量醫(yī)藥組合物的每一單元以與所需醫(yī)藥載劑一起產(chǎn)生期望的治療效果。關(guān)于本發(fā)明劑量單元形式的說明與所述醫(yī)藥組合物的特征及欲達成特定治療效果有關(guān)。對主要醫(yī)藥組合物加以調(diào)配以方便有效地以有效量及可接受劑量單元形式與適宜藥學(xué)上可接受的載劑一起投與。在含有補充活性成份的組合物中，可參照所述成份的慣用劑量及投與方式來確定給藥。用于抑制細菌有機體(例如，葡萄球菌屬)中胡蘿卜素形成的藥劑可與常用抗生素及/或抗微生物劑組合使用。因此，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可包含胡蘿卜素形成抑制劑及一種或多種額外抗微生物劑或抗生素。本發(fā)明闡述下列實例但不應(yīng)理解將其以任何方式解釋為限制本發(fā)明。實例金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素的生物合成途徑涉及分別編碼脫氫角鯊烯合酶及脫氫角鯊烯去飽和酶的基因crtM及crtN的主要功能。為了探測金黃色葡萄球菌色素的生物活性，通過對crtM實施等位基因置換產(chǎn)生金色人類臨床分離物的同基因突變體。所述ACrtM突變體是無色素的并缺少野生型類胡蘿卜素的特征三重峰光譜(在440、462及491nM波長下)。觀測到WT與ACrtM金黃色葡萄球菌在生長速率、固定相密度、表面電荷、浮力或疏水性方面不存在差異。金黃色葡萄球菌crtM及crtN—起足以產(chǎn)生4,4'-二脫輔基鏈孢紅素(4,4'-diaponeurosporene)。為了方便地實現(xiàn)功能分析，使兩基因在無色素釀膿鏈球菌(與金黃色葡萄球菌具有類似疾病譜的人類病原體)中表達。當用pCrtMN質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時，釀膿鏈球菌獲得具有類胡蘿卜素光譜特征的黃色色素沉著。金黃色葡萄球菌ACrtM突變體與所述pCrtMN載體的互補也會部分地恢復(fù)色素沉著。細菌、小鼠、人類CGD患者及化學(xué)試劑野生型金黃色葡萄球菌菌株(Pigl)，自患特應(yīng)性皮炎的兒童的皮膚分離得。釀膿鏈球菌菌株5448是一種經(jīng)充分定性的M1T1血清型臨床分離物18。GDI及C57Bl/6小鼠是自CharlesRiver購得。gp9lPh。"小鼠是在Veteran'sAdministrationMedicalCenter,SanDiego飼喂并維持甲氧節(jié)氨嘧啶/磺胺甲基異噁唑預(yù)防直至實驗前3天。使金黃色葡萄球菌及釀膿鏈球菌在Todd-Hewitt肉湯(THB)中或在THB瓊脂(Difco,Detroit,MI)上繁殖。除非另有說明，否則所有實驗均用源自金黃色葡萄球36-48小時固定相培養(yǎng)物或釀膿鏈球菌24小時固定相培養(yǎng)物(此時色素沉著表現(xiàn)型清晰可見)的細菌實施。人類CGD患者患者為具有g(shù)p47Ph。x缺陷(外顯子2中存在純合AGT缺失)的18周歲女性。在研究時，她的健康狀況良好且通過皮下注射每周三次僅對她投與藥物干擾素-Y(50mcg/m2)。缺乏類胡蘿卜素的金黃色葡萄球菌突變體，ACrtM的產(chǎn)生。借助如對釀膿鏈球菌"或無乳鏈球菌^所述基于PCR的方法(其中有少許變動)用氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(cat)彈夾對金黃色葡萄球菌crtM基因?qū)嵤┚_的框內(nèi)等位基因置換。根據(jù)公開的金黃色葡萄球菌crtMN序列6交叉參照基因組金黃色葡萄球菌菌株N31521設(shè)計引物。使用PCR借助引物crtMupF5'-TTAGGAAGTGCATATACTTCAC-3'(SEQIDNO:l)及crtMstartR(SEQIDNO:2)在crtM上游擴增~500bp以及借助引物crtMendF(SEQIDNO:3)及ertMdownR5'-GGCACCGTTATACGATCATCGT-3'(SEQIDNO:4)恰在crtM下游擴增約500bp序列。使用分別對應(yīng)于cat基因的5'及3'末端的25bp5'突出端構(gòu)建crtMstartR及crtMendF引物。隨后使上游及下游PCR產(chǎn)物與來自pACYC184的完全cat基因的650bp擴增子(在使用引物crtMupF及crtMdownR的第二輪PCR中作為模板)組合。將所得PCR擴增子(涉及用cat對crtM實施框內(nèi)替換)亞克隆到溫度敏感性載體pHY304中以創(chuàng)造基因剔除質(zhì)粒。首先將這個載體轉(zhuǎn)化成受納金黃色葡萄球菌菌株RN4220(由Dr.PaulSullam提供)且隨后通過電穿孔轉(zhuǎn)化成金黃色葡萄球菌菌株P(guān)igl。使轉(zhuǎn)化體在3(TC下生長，轉(zhuǎn)換到不準許質(zhì)粒復(fù)制的溫度(4(TC)，并借助示差抗生素選擇及色素表現(xiàn)型來識別候選突變體。通過證明自最終突變體ACrtM分離的染色體DNA中已定位插入cat且不存在crtM的PCR反應(yīng)明確地證實其中crtM等位基因的等位基因置換?；パa及異源表達研究.使用引物CrtF5'-CAGTCTAGAAATGGCATTTCAATATAGGAG-3'(SEQIDNO:5)及CrtR5'-ATCGAGATCTCTCACATCTTTCTCTTAGAC-3'(SEQIDNO:6)來擴增來自WT金黃色葡萄球菌菌株P(guān)igl染色體的鄰接CrtM及CrtN基因。將所述片段定向克隆到往復(fù)表達載體pDCerm19中并使用重組質(zhì)粒(pCrtMN)通過電穿孔轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌ACrtM突變體及釀膿鏈球菌菌株5448。金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素的光譜特性.對WT金黃色葡萄球菌Pigl及其同基因△CrtM突變體的固定相(48h)培養(yǎng)物實施甲醇萃取。使用MBA2000光譜儀(PerkinElmer)測量萃取物的吸收率特性。氧化劑敏感性分析.在PBS(金黃色葡萄球菌)或THB(釀膿鏈球菌)中實施對氧化劑敏感性的測試。添加過氧化氫(11202)達1.5%最終濃度，將2X109個細菌在37'C下培育1小時，隨后向驟冷殘留11202中添加1,000U/毫升過氧化氫酶(Sigma)。將稀釋液置于THA上以供計數(shù)存活cfu。對于單態(tài)氧分析而言，將108個金黃色葡萄球菌或4X1()S個釀膿鏈球菌于37r下在24-孔培養(yǎng)板的各孔中于l-6^ig/ml亞甲基藍存在或不存在時并在距離100-watt光源恰好10cm處培育。通過將稀釋液涂覆于THA上在1-3h后評定細菌生存率。以等同方式處理對照平板但將其包裹于鋁箔中或在亞甲基藍不存在時暴露于光，并未顯示明顯的細菌殺傷。全血殺傷分析.將細菌在PBS中洗滌兩次，在25^PBS中稀釋至104cfu接種量并在肝素化試管中與75^d新鮮抽取人類或小鼠血液混合。邊攪動邊將所述試管在37。C下培育4h，此時將稀釋液涂覆于THA上以供計數(shù)存活cfo。嗜中性粒細胞細胞內(nèi)存活率分析.使用Hist叩aque梯度劑(Sigma)按照生產(chǎn)商說明自健康人類志愿者純化嗜中性粒細胞。按照下述實施細胞內(nèi)存活率分析。將細菌培養(yǎng)物在PBS中洗滌兩次，在100^RPMI+10%FCS中稀釋達4.5x106cfu濃度并在相同介質(zhì)中與3><105個嗜中性粒細胞混合(多次重復(fù)感染，MOI=15:l)，在700xg下離心，隨后于37。C下在5MC02培養(yǎng)箱中培育。在10分鐘后，添加慶大霉素(Gibco)(最終濃度，對于金黃色葡萄球菌為400pg/ml且對于釀膿鏈球菌為100^g/ml)以殺死細胞外細菌。在特定時間點，取出試樣孔的內(nèi)容物，離心以使嗜中性粒細胞呈球狀并洗滌以去除抗生素介質(zhì)。隨后在0.02%triton-X中裂解嗜中性粒細胞并通過涂覆于THA上來計算cfu。借助增加一個涉及下述的步驟重復(fù)實施若干分析用10%自體人類血清在冰上將細菌接種物預(yù)培育15分鐘。皮下感染鼠類模型.用細菌測試菌株在10周至16周大CD-1或gp91Ph°x—M、鼠的一側(cè)(隨機選擇)實施皮下注射且同時用不同的菌株在對側(cè)進行注射以供直接對比。按照產(chǎn)生局部金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌皮下感染的確立實驗方案，洗滌、稀釋細菌培養(yǎng)物并將其重新懸浮于PBS中，以指定接種量以1:1與無菌Cytodex珠(Amersham)混合。每日記錄損傷面積，如通過顯現(xiàn)出的潰瘍的最大長度x寬度評定。累積損傷面積是每個治療組中所有動物在某一天的損傷面積總和。在第8天(金黃色葡萄球菌)或在第5天(釀膿鏈球菌)，對動物實施安樂死，切除皮膚損傷部分，在PBS中勻質(zhì)化并置于THA上以供定量培養(yǎng)。統(tǒng)計學(xué).采用非配對Studentst檢驗評估在氧化劑敏感性、血液殺傷和嗜中性粒細胞存活率方面的實驗差異顯著性。釆用配對Student'st檢驗評估小鼠活體內(nèi)激發(fā)研究的結(jié)果。保證.所有動物實驗均由動物使用及管理UCSD委員會獲準并使用公認的獸醫(yī)標準實施。使用人類血液的實驗由雙軌UCSD人類研究保護程序(DualTrackedUCSDHumanResearchProtectionProgram)/CHSDIRB獲準。自人類受試者獲得先前知情同思。用于浮力、表面電荷及疏水性的分析.為了測量浮力，在數(shù)個5ml玻璃試管中制備連續(xù)重疊梯度的1mlPercoll(各自為70%、60%及50%)。將1ml過夜細菌培養(yǎng)物置于Percoll層的頂部，在轉(zhuǎn)動斗式離心機中于500xg下將所述試管離心8min并記錄細菌至各Percoll中間相的遷移。為了測量表面電荷，通過離心收集細菌并在嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液(20mM,pH=7.0)中洗滌。將1ml培養(yǎng)物重新懸浮于0.5mlMOPS中并測量OD600。在室溫下用細胞色素C(Sigma,St.Louis,MO)以0.5mg/ml的最終濃度將細菌細胞培育15分鐘。對試樣進行離心('13,000xg，5min)并在530nm下定量測定殘留于上清液中的細胞色素C的數(shù)量。調(diào)整細胞色素C數(shù)值以反映結(jié)合/培養(yǎng)物OD600=1.0。為了測量疏水性，洗滌0.5ml金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物并將其重新懸浮于1.0mlPBS中，將300pl正十六垸層鋪于所述細胞懸浮液頂部，并將試管渦旋60秒。將試樣在RT下培育30min以便于相分離。去除水相，并測定水相的OD畫與存于PBS中培養(yǎng)物的OD6oo的比率。蛋白酶及組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)敏感性分析.自Calbiochem購得人類嗜中性粒細胞彈性蛋白酶及組織蛋白酶G。用LouisianaStateUniversityProteinFacility(MarthaJuban,Director)合成抗微生物肽mCRAMP。在10mM磷酸緩沖液(pH7.2)+0.5%LB中將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物稀釋(1:2,000)達1X106CFU/ml。將90^此細菌懸浮液添加到96-孔板中的復(fù)制孔中。在10mM磷酸緩沖液中制備組織蛋白酶G(20及100mU/ml)、人類嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(12.5及50嗎/ml)及鼠類CRAMP(0.4-3pM)的稀釋液并將其以10pl體積添加到孔中；單獨的10mM磷酸緩沖液用作陰性對照。在37。C下培育2h后，在PBS中連續(xù)地稀釋每孔的25pl等份并置于THB上。以一式兩份的方式實施每個實驗并重復(fù)之。吞噬吸收分析.在RT下按照生產(chǎn)商指導(dǎo)用SYTOR9(BacLightTM套組(lnvitrogen,Carlsbad,CA)的一種組份)標記金黃色葡萄球菌，15min。將經(jīng)標記細菌洗滌3次以去除過量染劑，隨后在10%自體人類血清中用冰進行預(yù)調(diào)理10min。在MOI-15時，向3><106純化人類嗜中性粒細胞中添加細菌，在37"C下培育5min,隨后在500^g下離心6min以使嗜中性粒細胞沉降。棄置上清液并將細胞小丸重新懸浮于15ml溴化乙錠(0.1mg/ml)存于PBS的混合物中以熄滅細胞外細菌發(fā)出的熒光。通過在熒光顯微鏡下直接顯像來列舉具有細胞內(nèi)細菌的嗜中性粒細胞的百分比。以一式兩份方式實施實驗并重復(fù)之。借助位于UCSDDigitalImagingCoreFacilty中的DeltaVisionDeconvolutionMicroscopeSystem(NikonTE-200Microscope)來捕獲代表性影像。用于金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素6的生物合成途徑涉及分別編碼脫氫角鯊烯合酶及脫氫角鯊烯去飽和酶的基因crtM及crtN的主要功能(圖la)。為了探測金黃色葡萄球菌色素的生物活性，通過對crtM實施等位基因置換產(chǎn)生金色人類臨床分離物的同基因突變體(圖la)。與先前報導(dǎo)一致，野生型(WT)菌株的色素沉著在早期生長固定相中變得明顯并在36-48h時達穩(wěn)定之前繼續(xù)加強(圖lb)。所述ACrtM突變體是無色素的并缺少野生型類胡蘿卜素的特征三重峰光譜(在440、462及491nM波長下)(圖lb)。觀測到WT與ACrtM金黃色葡萄球菌在生長速率、固定相密度、表面電荷、浮力或疏水性方面不存在差異。(圖5a-d)。金黃色葡萄球菌crtM及crtN—起足以產(chǎn)生4,4'-二脫輔基鏈孢紅素3。為了方便地實現(xiàn)功能分析，使兩基因在無色素釀膿鏈球菌(一種與金黃色葡萄球菌具有類似疾病譜的人類病原體)中表達。當用pCrtMN質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時，釀膿鏈球菌獲得具有類胡蘿卜素光譜特征的黃色色素沉著(圖lb)。金黃色葡萄球菌△CrtM突變體與所述pCrtMN載體的互補也會完全地恢復(fù)色素沉著(圖lb)。吞噬細胞清除病原體的一個重要作用機制是通過釋放由NADPH氧化酶產(chǎn)生的反應(yīng)性氧物質(zhì)7。已經(jīng)有人提出諸如那些由金黃色葡萄球菌表達者等細菌類胡蘿卜素可起針對這些防御分子的保護作用8'9'1Q。為了以實驗方式測試此保護作用，在活體外對比WT與ACrtM金黃色葡萄球菌對氧化劑的敏感性。如圖lc及l(fā)d中所示，與WT金黃色葡萄球菌菌株相比，ACrtM突變體可更有效地受到過氧化氫及單態(tài)氧殺傷。與pCrtMN的互補恢復(fù)了ACrtM突變體抵抗單態(tài)氧殺傷的能力(圖ld)。類似地，葡萄球菌色素在釀膿鏈球菌中的異源表達導(dǎo)致單態(tài)氧敏感性明顯降低(圖le)。隨后借助2個體內(nèi)分析系統(tǒng)-人類或小鼠全血存活率及與純化人類嗜中性粒細胞的共培養(yǎng)物來測定所觀測的金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素抗氧化劑活性是否轉(zhuǎn)變?yōu)榧毦鷮ο忍煨悦庖咔宄目剐栽鰪?。與位于人類嗜中性粒細胞(圖2a，圖6f)及正常小鼠或人類供者之全血(圖2b,e)中的細胞內(nèi)無色素ACrtM相比，WT金黃色葡萄球菌在存活率方面明顯更佳。由于WT金黃色葡萄球菌與ACrtM突變體的攝取是相當?shù)?，因此前一種效應(yīng)不能通過吞噬速率的差別來解釋(圖6a)。而且由于攝取的WT及突變體菌株在氮藍四唑鐵(NBT)還原分析中產(chǎn)生了類似結(jié)果，因此所述效應(yīng)也不能通過造成嗜中性粒細胞氧化猝發(fā)程度變化的差異來解釋(圖6b)。金黃色葡萄球菌ACrtM突變體與pCrtMN的互補作用恢復(fù)了對小鼠全血殺傷的抗性(圖2b)。同樣地，表達葡萄球菌類胡蘿卜素的經(jīng)染色釀膿鏈球菌在人類嗜中性粒細胞較在親株中顯示升高存活率(圖2c)。為了驗證金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素表達與增強吞噬細胞抗性之間的關(guān)系是否是其抗氧化劑性質(zhì)的直接結(jié)果，于氧化猝發(fā)抑制劑二亞苯基碘鎗(DPI)存在下重復(fù)進行分析。當借助DPI抑制氧化猝發(fā)時，WT與ACrtM金黃色葡萄球菌在人類嗜中性粒細胞(圖2d)與小鼠血液(圖6d)中的存活率是相同的。Gp47Ph。"是一種經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于慢性肉芽腫病(CGD)患者中的遺傳性吞噬細胞氧化猝發(fā)功能缺陷，且gp9lPh。"小鼠代表一種人類X-鏈接CGD的模型11。WT優(yōu)于無色素ACrtM金黃色葡萄球菌的存活率優(yōu)勢僅在正常人類及小鼠(CD1或C57Bl/6)的血液中表現(xiàn)出而在缺少NADPH氧化酶活性的人類gp47Ph。"患者或gp9lPh"小鼠的血液中沒有表現(xiàn)出(圖2e,f)。近來，據(jù)報道由反應(yīng)性氧物質(zhì)產(chǎn)生的明顯的病原體嗜中性粒細胞殺傷可在很大程度上反映通過鉀離子流變化調(diào)節(jié)的顆粒蛋白酶的活化。WT與ACrtM金黃色葡萄球菌在對組織蛋白酶G抗微生物作用的敏感性方面無差別，且兩種菌株均如先前對金黃色葡萄球菌所觀測得情況一般對人類嗜中性粒細胞彈性蛋白酶具有抗性13(圖6d)。對先天性免疫防御十分重要的哺乳動物嗜中性粒細胞的其它效應(yīng)分子屬于抗微生物肽的組織蛋白酶抑制素家族14。當與WT菌株相比時，缺少類胡蘿卜素的金黃色葡萄球菌突變體同樣對鼠類組織蛋白酶抑制素mCRAMP殺傷敏感(圖6e)。這些結(jié)果表明金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素的自由基清除抗氧化劑性質(zhì)在抵抗嗜中性粒細胞介導(dǎo)的殺傷中的主要作用。體外及體內(nèi)結(jié)果均表明金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素是必需的且足以促進氧化劑抗性及提高吞噬細胞存活率。為了評估這些觀測結(jié)果對疾病發(fā)病的重大意義，己研發(fā)出適于皮下激發(fā)的鼠類模型。在這些研究中，用WT金黃色葡萄球菌菌株在一側(cè)及用ACrtM突變體在對側(cè)同時對各動物進行注射。在WT注射(106cfu)位點，小鼠出現(xiàn)相當大的膿腫損傷，在第4天時累積面積達80mm2.,同等接種量的缺乏類胡蘿卜素的突變體在對側(cè)的注射沒有產(chǎn)生可見的損傷(圖3a)。以兩種不同激發(fā)劑量(10、fu至107cfu)注射時，來自皮膚損傷的定量培養(yǎng)物一致地表明在各小鼠中存活WT金黃色葡萄球菌較ACrtM突變體明顯更多(圖3a)。Ph°x-A為了確證抗氧化劑作用是金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素在活體內(nèi)提供保護機制的關(guān)鍵，對gp9lPh。"小鼠重復(fù)實施皮下感染實驗。于不存在宿主NADPH氧化酶功能時，WT及ACrtM突變體金黃色葡萄球菌產(chǎn)生類似累積損傷面積并借助定量膿腫培養(yǎng)物檢測到?jīng)]有存活率優(yōu)勢(圖3b)。隨后通過對比由表達CrtMN的釀膿鏈球菌產(chǎn)生的感染過程與僅經(jīng)載體轉(zhuǎn)化的對照來確定金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素足以增進細菌毒力。在圖3c中，由表達類胡蘿卜素的菌株產(chǎn)生的損傷較那些由WT菌株產(chǎn)生的損傷明顯更大并含有更多的存活細菌。于表l中提供來自活體內(nèi)實驗的原始數(shù)據(jù)。表1:活體內(nèi)小鼠激發(fā)研究的損傷面積及細菌培養(yǎng)物計數(shù)<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>倘若金黃色色素供給細菌以保護作用，則抑制胡蘿卜素形成的藥理劑可能會致使金黃色葡萄球菌對免疫清除更敏感。多功能氧化酶抑制劑2-二乙基氨基乙基-2,2-二苯基-戊酸酯(SKF525-A,Calbiochem)先前已經(jīng)顯示可抑制金黃色葡萄球菌中的色素形成，但在那些實驗中應(yīng)注意S類胡蘿卜素中間體的適當殘余累積。如圖4a中所示，在于此試劑存在下生長的金黃色葡萄球菌WT菌株中獲得色素生成的劑量依賴性降低。阻斷金黃色葡萄球菌色素形成導(dǎo)致有機體對單態(tài)氧殺傷敏感性出現(xiàn)劑量依賴性增加(圖4b)且其使WT金黃色葡萄球菌存活于人類全血中的能力降低(圖4c)。作為對照，在平行實驗中使ACrtM突變體暴露于SKF525-A，對氧化劑敏感性或血液存活率沒有明顯作用(圖4b,c)。類胡蘿卜素色素賦予的金色是人類病原體金黃色葡萄球菌的齊名特征。實施配對誘變作用與異源表達的分子遺傳學(xué)分析以顯示此標志表現(xiàn)型實際上是一種通過其抗氧化劑性質(zhì)來用以保護細菌免受吞噬細胞殺傷的致病因子。在本世紀中，在社會及醫(yī)院中，此重要病因的有效控制受到抗微生物劑抗性迅速發(fā)展的危害。原則上，抑制胡蘿卜素形成可為并發(fā)性金黃色葡萄球菌感染治療提供一種新穎治療方法，其可有效地致使所述病原體對由正常宿主先天免疫防御產(chǎn)生的清除更敏感。另外，WT金黃色葡萄球菌較無色素ACrtM在人類供者全血或正常小鼠中及在人類嗜中性粒細胞細胞內(nèi)以明顯更佳的方式存活。由于WT金黃色葡萄球菌與ACrtM突變體的攝取是相當?shù)模虼撕笠环N效應(yīng)不能通過吞噬速率的差別來解釋。而且由于攝取的WT及突變體菌株在氮藍四唑鑰(NBT)還原分析中產(chǎn)生了類似結(jié)果，因此所述效應(yīng)也不能通過造成嗜中性粒細胞氧化猝發(fā)程度變化的差異來解釋。金黃色葡萄球菌ACrtM突變體與pCrtMN之間的互補恢復(fù)了對小鼠全血或人類嗜中性粒細胞殺傷的抗性。同樣地，表達葡萄球菌類胡蘿卜素的經(jīng)染色釀膿鏈球菌在人類嗜中性粒細胞較在親株中顯示更高存活率。為了驗證金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素表達與增強吞噬細胞抗性之間的關(guān)系是否是其抗氧化劑性質(zhì)的直接結(jié)果，于氧化猝發(fā)抑制劑二亞苯基碘鐵(DPI)存在下重復(fù)進行分析。當借助DPI抑制氧化猝發(fā)時，WT與ACrtM金黃色葡萄球菌在人類嗜中性粒細胞與小鼠血液中的存活率是相同的。Ph。x一gp9lPh。"-小鼠代表一種人類X-鏈接慢性肉芽腫病(一種遺傳性吞噬細胞氧化猝發(fā)功能缺陷)的模型。Ph。x一WT優(yōu)于無色素ACrtM金黃色葡萄球菌的存活率優(yōu)勢僅在正常小鼠(CD1或C57Bl/6)的血液中表現(xiàn)出而在缺少NADPH氧化酶活性的gp9lPh。x;小鼠的血液中沒有表現(xiàn)出。近來，據(jù)報道由反應(yīng)性氧物質(zhì)產(chǎn)生的明顯的病原體嗜中性粒細胞殺傷可在很大程度上反映通過鉀離子流變化調(diào)節(jié)的顆粒蛋白酶的活化。已確定WT與ACrtM金黃色葡萄球菌在對組織蛋白酶G抗微生物作用的敏感性方面無差別，且兩種菌株均如先前對金黃色葡萄球菌所觀測得情況一般對人類嗜中性粒細胞彈性蛋白酶具有抗性。對先天性免疫防御十分重要的哺乳動物嗜中性粒細胞的其它效應(yīng)分子屬于抗微生物肽的組織蛋白酶抑制素家族。當與WT菌株相比時，缺乏類胡蘿卜素的金黃色葡萄球菌突變體同樣對鼠類組織蛋白酶抑制素mCRAMP殺傷敏感。這些結(jié)果表明金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素的自由基清除抗氧化劑性質(zhì)在抵抗嗜中性粒細胞介導(dǎo)的殺傷中的主要作用。體外及體內(nèi)結(jié)果均表明金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素是必需的且足以促進氧化劑抗性及提高吞噬細胞存活率。為了評估這些觀測結(jié)果對疾病發(fā)病的重大意義，己研發(fā)出適于皮下激發(fā)的鼠類模型。在這些研究中，用WT金黃色葡萄球菌菌株在一側(cè)及用ACrtM突變體在對側(cè)同時對各動物進行注射。在WT注射位點，小鼠出現(xiàn)相當大的皮下膿腫；同等接種量的缺乏類胡蘿卜素突變體在對側(cè)的注射沒有產(chǎn)生可見的損傷。來自皮膚損傷的定量培養(yǎng)物一致地表明在各小鼠中存活WT金黃色葡萄球菌較ACrtM突變體明顯更多。Ph。x一為了確證抗氧化劑作用是金黃色葡萄球菌類胡蘿卜素在活體內(nèi)提供保護機制的關(guān)鍵，對gp9lPh。"小鼠重復(fù)實施皮下感染實驗。于不存在宿主NADPH氧化酶功能時，WT及ACrtM突變體金黃色葡萄球菌產(chǎn)生類似累積損傷面積且借助定量膿腫培養(yǎng)物檢測到?jīng)]有存活率優(yōu)勢。而且，當釀膿鏈球菌感染與壞死性潰瘍而非膿腫形成相關(guān)時，由表達類胡蘿卜素的菌株產(chǎn)生的損傷較那些由WT菌株產(chǎn)生的損傷明顯更大并含有更多的存活細菌。倘若由金黃色色素供給細菌以保護作用，則對抑制胡蘿卜素形成的藥理劑進行測試以確定所述藥劑是否會致使金黃色葡萄球菌對免疫清除更敏感。多功能氧化酶抑制劑2-二乙基氨基乙基-2,2-二苯基-戊酸酯(SKF525-A，Calbiochem)先前已經(jīng)顯示可抑制金黃色葡萄球菌中的色素形成，且在于此試劑存在下生長的金黃色葡萄球菌WT菌株中表現(xiàn)出類胡蘿卜素生成的劑量依賴性色素降低。阻斷金黃色葡萄球菌色素形成導(dǎo)致有機體對單態(tài)氧殺傷敏感性出現(xiàn)相稱的劑量依賴性增加且其于人類全血中存活的能力降低。作為對照，在平行實驗中使ACrtM突變體暴露于SKF525-A，對氧化劑敏感性或血液存活率沒有明顯作用。盡管上文已經(jīng)闡述了許多實施例及特征，但熟悉所屬技術(shù)的人員應(yīng)理解在不背離本發(fā)明的教示或由隨附權(quán)利要求書界定的本發(fā)明范圍的情況下，可對所述實施例及特征進行若干修飾及變更。本發(fā)明的附錄供進一步闡明而非限制本發(fā)明。權(quán)利要求1、一種治療細菌感染的方法，其包括對遭受所述感染的受試者投與可抑制所述細菌中類胡蘿卜素生成及/或活性的藥劑。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述細菌感染是葡萄球菌感染。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述細菌是葡萄球菌屬。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細菌是金黃色葡萄球菌。5、一種通過靶向類胡蘿卜素來預(yù)防、治療MRSA或改進MRSA治療有效性的方法。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述類胡蘿卜素是葡萄球菌屬類胡蘿卜素。7、如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述耙向類胡蘿卜素涉及胡蘿卜素形成抑制劑。8、如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述胡蘿卜素形成抑制劑是多功能氧化酶抑制劑。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述多功能氧化酶抑制劑是選自由2-二乙基氨基乙基-2,2-二苯基-戊酸酯、2,4-二氯-6-苯基苯氧基乙基胺、2,4-二氯-6-苯基苯氧基乙基二乙基胺、及胡椒基丁醚組成的群組。10、如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述多功能氧化酶是2-二乙基氨基乙基-2,2-二苯基-戊酸酯。11、如權(quán)利要求1或5所述的方法，其中所述靶向或抑制類胡蘿卜素包括抑制類胡蘿卜素的合成、增加類胡蘿卜素的降解或去除、或抵消類胡蘿卜素的功能。12、一種抑制微生物生長的方法，其包括使所述微生物與抑制有效量的胡蘿卜素形成抑制劑接觸。13、如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述接觸是在活體外進行。14、如權(quán)利要求13所述的方法,其中所述接觸是在懷疑具有微生物的表面上進行.15、如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述微生物包含類胡蘿卜素。16、如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述微生物是細菌。17、如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述接觸是在活體內(nèi)進行。18、如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述活體內(nèi)接觸是通過局部投藥來進行。19、如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細菌是革蘭氏陽性菌。20、如權(quán)利要求19所述的方法,其中所述細菌是金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球.21、如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細菌是革蘭氏陰性菌。22、如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細菌是選自由大腸桿菌(E.coli)、綠膿桿菌(Raeruginosa)及鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium.)組成的群組。23、如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述胡蘿卜素形成抑制劑是與至少一種抗生素組合投與。24、如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述抗生素屬于選自由下列組成之群組的類別氨基糖甙類、青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類(carbapenems)、單環(huán)|3-內(nèi)酰胺類(monobactams)、喹諾酮類、四環(huán)素類、糖肽類、氯霉素(chloramphenicol)、克林霉素(clindamycin)、甲氧節(jié)氨嘧啶(trimethoprim)、磺胺甲基異噁唑(sulfamethoxazole)、呋喃妥因(nitrofuirantoin)、利福平(rifampin)及莫匹羅星(mupirocin)。25、如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述抗生素是選自由下列組成的群組阿米卡星(amikacin)、慶大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、奈替米星(netilmicin)、妥布霉素(tobramycin)、f連霉素(streptomycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、紅霉素(erythromycin)、依托紅霉素/琥乙紅霉素/葡庚糖酸紅霉素/乳糖酸紅霉素/硬脂酸紅霉素、青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、氨節(jié)西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、替卡西林(ticarcillin)、羧節(jié)西林(carbenicillin)、美洛西林(mezlocillin)、阿洛西林(azlocillin)、哌拉西林(piperacillin)、頭孢噻吩(cephalothin)、頭孢唑林(cefazolin)、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢西丁(cefoxitin),頭孢呋辛(cefuiroxime)、頭孢尼西(cefonicid)、頭孢美唑(cefmetazole)、頭孢替坦(cefotetan)、頭孢丙烯(cefprozil)、氯碳頭孢(loracarbef)、頭孢他美(cefetamet)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢唑月虧(ceftizoxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢磺啶(cefsulodin)、亞月安培南(imipenem)、氨曲南(aztreonam)、氟羅沙星(fleroxacin)、萘啶酸(nalidixicacid)、諾氟沙星(norfloxacin),環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、西諾沙星(cinoxacin)、多西環(huán)素(doxycycline)、米諾環(huán)素(minocycline)、四環(huán)素、萬古霉素(vancomycin)、及替考拉寧(teicoplanin)。26、一種組合物，其包含胡蘿卜素形成抑制劑及藥學(xué)上可接受的載劑。27、如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述組合物是乳液、乳霜、凝膠、軟膏或噴霧劑。28、如權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述組合物用于局部投藥。29、一種篩選用于治療細菌感染的MRSA治療劑的方法，其包括使產(chǎn)生類胡蘿卜素的細菌與懷疑可抑制類胡蘿卜素生成或活性的測試藥劑接觸，并測量所述藥劑在氧化劑存在及不存在時的效果。全文摘要本發(fā)明提供一種用于定向誘變和異源表達的分子遺傳學(xué)方法以及細菌性發(fā)病機理的活體外和活體內(nèi)模型以闡明金黃色葡萄球菌(S.aureus)色素是致病因子及抗微生物療法的潛在新穎目標。文檔編號A01N37/12GK101198252SQ200680018200公開日2008年6月11日申請日期2006年4月17日優(yōu)先權(quán)日2005年4月18日發(fā)明者喬治·Y·劉,維克托·尼澤申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會