專利名稱：增加被子植物中無融合生殖表達(dá)頻率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有花植物(被子植物)中雜種優(yōu)勢(shì)和其它性狀通過無融合生殖(無性種子形成)方式從種子到種子的永續(xù)。更具體地，本發(fā)明提供用于從有性或兼性無融合生殖植物產(chǎn)生表達(dá)增加百分比的如下胚珠的后代植物的可預(yù)測(cè)的方法，所述胚珠中正常有性發(fā)育被無孢子生殖的或二倍性孢子生殖的(diplosporous)(無融合生殖的)胚囊形成、孤雌生殖(不經(jīng)受精而從卵形成胚胎)、不定胚生殖(從非卵的細(xì)胞形成胚胎)、或自主類型(中央細(xì)胞未受精)或假受精類型(中央細(xì)胞受精)的胚乳形成所代替。本發(fā)明還描述了對(duì)負(fù)責(zé)無融合生殖的基因進(jìn)行作圖和克隆所必需的胚胎學(xué)表型。本發(fā)明使用植物細(xì)胞胚胎學(xué)方法鑒定和選擇就大孢子發(fā)生(雌性減數(shù)分裂)、胚囊形成(包括卵和中央細(xì)胞成熟)、受精、胚形成(embryony)和胚乳形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間而言具有適當(dāng)遺傳變異性的植物或一組植物；使用植物育種方法產(chǎn)生許多趨異的遺傳重組后代；和使用植物細(xì)胞胚胎學(xué)或后代檢測(cè)方法選擇表達(dá)增加頻率的無孢子生殖的或二倍性孢子生殖的胚囊形成、孤雌生殖或不定胚形成、和/或自主的或假受精的胚乳形成的分離植物。
背景技術(shù)：
無融合生殖是一種天然但罕見的異?，F(xiàn)象，在不足1％的被子植物屬中發(fā)生(Carman1997)。其在大多數(shù)世界上重要的食物和纖維作物，包括稻、小麥、玉米、大麥、黍、高梁、大豆、馬鈴薯，大多數(shù)蔬菜和油類作物、棉等等中均不存在(Asker和Jerling1992)。正是在這些作物中，無融合生殖具有提供商業(yè)和人道主義利益的最大潛力。賦予全球作物無融合生殖性能可以在至少三個(gè)方面利于作物生產(chǎn)。
首先，可以將近交/自交作物(inbred crops)，例如小麥、稻和大豆轉(zhuǎn)化成產(chǎn)量出眾的雜種作物，從而使得雜種優(yōu)勢(shì)可以從種子到種子持久遺傳。目前，雜種小麥比近交/自交品種產(chǎn)生多高達(dá)15％的谷粒，但是國(guó)際上栽培的大多數(shù)小麥?zhǔn)瞧贩N(variental)——不是雜種。與產(chǎn)生品種種子的低成本相比，產(chǎn)生雜種種子的高成本目前限制了雜種小麥種子在世界最高小麥生產(chǎn)區(qū)域的應(yīng)用(Guillen-Portal等，2002)。
正是大多數(shù)世界作物的解剖學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)在目前阻礙了大量雜種種子的經(jīng)濟(jì)型生產(chǎn)。這些經(jīng)濟(jì)因素又妨礙次等品種向優(yōu)良雜種的全球轉(zhuǎn)化。無融合生殖可以消除這一經(jīng)濟(jì)學(xué)瓶頸。對(duì)于稻，雜種優(yōu)勢(shì)的全面開發(fā)可以使稻產(chǎn)量與目前全球大多數(shù)稻耕作面積上栽培的近交/自交品種的產(chǎn)量相比提高30％至50％(Yuan1993)。通過賦予稻和其它主要世界作物以無融合生殖性能，生產(chǎn)雜種種子將與生產(chǎn)品種種子一樣便宜。這是因?yàn)闊o融合生殖雜種可以以無性方式從種子到種子，即從一個(gè)種子世代到下一種子世代，進(jìn)行自身克隆。本質(zhì)上，無融合生殖種子生產(chǎn)系統(tǒng)無需用于產(chǎn)生雜種種子的昂貴的異花傳粉方法。
其次，無融合生殖可以通過減少與目前以雜種栽培的作物的雜種種子生產(chǎn)相關(guān)的費(fèi)用，而增加作物生產(chǎn)力。例如，玉米的雜種種子通過鑒定在相互雜交或雙雜交時(shí)產(chǎn)生產(chǎn)量?jī)?yōu)良的雜種后代的遺傳趨異近交/自交親本系來制備。在鑒定或培育了適當(dāng)親本系后，需要大量異花傳粉以產(chǎn)生商業(yè)數(shù)量的雜種種子。無融合生殖可以消除大多數(shù)異花傳粉費(fèi)用，即，一旦產(chǎn)生了無融合生殖雜種，其可以通過自己的種子一代一代地克隆自身。美國(guó)的種子公司目前每年花費(fèi)大約$600M生產(chǎn)雜種玉米種子。無融合生殖可以消除異花傳粉步驟，為美國(guó)的玉米種子生產(chǎn)者每年節(jié)約超過$300M。
第三，可以使用無融合生殖將生物技術(shù)和生產(chǎn)力進(jìn)步轉(zhuǎn)移至發(fā)達(dá)國(guó)家的邊遠(yuǎn)農(nóng)場(chǎng)以及轉(zhuǎn)移給發(fā)展中國(guó)家的資源貧瘠的農(nóng)民(Toenniessen2001)。目前，與生產(chǎn)雜種種子或賦予作物以增值的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)(agbiotech)性狀相關(guān)的高費(fèi)用，阻礙了雜種或增值的性狀在世界的資源貧瘠地區(qū)的應(yīng)用。由于無融合生殖可以使此增值的性狀(雜種性或農(nóng)業(yè)生物技術(shù)改良)從種子到種子永續(xù)保持，故無融合生殖能夠成為一種有成本效益的媒介用于將這些性狀傳遞給貧困國(guó)家的資源貧瘠的農(nóng)民。
在能夠?qū)崿F(xiàn)無融合生殖的主要益處前，必須開發(fā)并完善在主要作物中誘導(dǎo)無融合生殖和增強(qiáng)其表達(dá)的方法。本說明書提供用于此誘導(dǎo)和增強(qiáng)的新方法。
本發(fā)明的新穎性本說明書的方法增加無融合生殖在植物中的表達(dá)。這些方法與目前其他科學(xué)家從事的方法無關(guān)，也不是目前其他科學(xué)家從事的方法的延伸。提供現(xiàn)有方法的以下討論以清楚地確定區(qū)分本說明書方法和目前從事的所有其它方法的關(guān)鍵因素。
目前由其它科學(xué)家研究的用于賦予有性作物以無融合生殖性能的方法是1.野生無融合生殖體與親緣有性物種雜交，之后漸滲育種以將假定的“無融合生殖基因”從野生無融合生殖體轉(zhuǎn)移至有性物種2.在有性物種中誘導(dǎo)突變以試圖通過突變方式從頭產(chǎn)生無融合生殖基因，之后選擇表達(dá)無融合生殖的植物3.作圖并克隆天然無融合生殖體中的無融合生殖基因，將此(這些)無融合生殖基因通過轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)移至作物4.從頭構(gòu)建無融合生殖基因，之后將此(這些)基因通過轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)移至作物。
盡管這些方法每一個(gè)都取得了進(jìn)展，但仍無一成功地將有性物種轉(zhuǎn)化為商業(yè)上可行的無融合生殖體(Spielman等2003，Estrada-Luna等2002，Richards2003)。這四種方法基于一個(gè)共同的信念，即，可以通過一個(gè)至極少數(shù)個(gè)經(jīng)由突變或調(diào)節(jié)基因的外遺傳(epigenetic)改變而演化出的無融合生殖基因賦予無融合生殖(Koltunow和Grossniklaus2003)。因此，據(jù)認(rèn)為1.可以通過植物育種使無融合生殖基因或外遺傳調(diào)節(jié)元件從無融合生殖物種漸滲入有性物種中2.可以通過突變正?；蛟谟行灾参镏挟a(chǎn)生無融合基因3.可以通過突變、雜交、多倍體化或其它染色體畸變，在有性植物中產(chǎn)生外遺傳調(diào)節(jié)元件4.可以在無融合植物中對(duì)無融合生殖基因或外遺傳調(diào)節(jié)元件作圖，并將其克隆和通過轉(zhuǎn)基因方式插入有性植物5.可以通過生物化學(xué)修飾已有基因，然后以轉(zhuǎn)基因方式將該經(jīng)修飾基因插入有性植物，從而產(chǎn)生無融合生殖基因或外遺傳調(diào)節(jié)元件。
本發(fā)明的發(fā)明人采取的方法不是基于相信可以通過常規(guī)或分子育種方法操作或創(chuàng)造的、一個(gè)或極少數(shù)個(gè)突變來源的無融合生殖基因；也并非基于相信無融合生殖是由基因調(diào)節(jié)上的外遺傳改變所致的結(jié)果。相反地，本發(fā)明所基于的是本發(fā)明的發(fā)明人的一系列新發(fā)現(xiàn)，即，可以將無融合生殖歸入如下受到遺傳調(diào)節(jié)的性狀類型中，這些性狀通過基因組水平上的結(jié)構(gòu)雜合性得以穩(wěn)定。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在相同物種、屬或科的植物中，相對(duì)于胚珠的非配子體(孢子體)組織的成熟水平，大孢子母細(xì)胞(MMC)分化、大孢子發(fā)生、胚囊形成、受精、胚形成(embryony)和胚乳形成(下文稱作種系發(fā)育序列(GDS)或胚珠發(fā)育序列(ODS)的組分)的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間存在廣泛的遺傳變異性。這種變異目前在本發(fā)明的發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中針對(duì)幾種物種，包括蝶須屬(Antennaria)(


圖1-3)、摩擦禾屬(Tripsacum)(圖4)、高粱屬(Sorghum)(圖5)和擬南芥屬(Arabidopsis)(圖6)，已經(jīng)進(jìn)行了表征。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，這種變異性在自然界中是生態(tài)型分隔的，并且受到多種基因的控制，其中這些基因在相同種、屬或科的相關(guān)生態(tài)型中散布著多個(gè)等位基因。于是，本發(fā)明人猜測(cè)這些生態(tài)型分隔的等位基因賦予了各生態(tài)型對(duì)其各自的生境的適應(yīng)性，并且可以通過(a)將在大孢子發(fā)生和胚囊發(fā)育的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間上趨異的生態(tài)型雜交、(b)獲得后代和(c)篩選無融合生殖后代，由此從有性植物產(chǎn)生無融合生殖植物。在這些雜種中，非同步表達(dá)的發(fā)育信號(hào)在胚珠發(fā)育期間出現(xiàn)彼此競(jìng)爭(zhēng)，并出現(xiàn)無融合生殖，即，胚囊形成占先于大孢子發(fā)生，胚形成(embryony)占先于受精(圖7-9；J.G.Carman，1997，制備無融合生殖植物的方法，WO98/33374，并入此處作為參考，下文稱為“WO 98/33374”)。本發(fā)明發(fā)明人然后提供可以用于遺傳穩(wěn)定無融合生殖的方法，即，可以用于防止在表達(dá)無融合生殖關(guān)鍵的各基因座出現(xiàn)遺傳重組的方法(J.G.Carman，1999，穩(wěn)定和控制無融合生殖的方法，WO 01/32001，并入此處作為參考，下文稱為“WO 01/32001”)。WO 98/33374和WO 01/32001是本發(fā)明的發(fā)明人所得的結(jié)果1.教導(dǎo)了親緣植物之間在GDS組分的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間上存在廣泛的遺傳變異性，而且該變異使得可以天然地進(jìn)化出無融合生殖植物(Carman1997，2000，2001)2.驗(yàn)證了在GDS組分的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間上存在遺傳變異性(
圖1-6)3.使用GDS組分起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間上的遺傳變異性，從有性植物產(chǎn)生無融合生殖F1雜種植物(圖7-9；WO 98/33374)4.通過修飾基因組結(jié)構(gòu)，遺傳穩(wěn)定了合成的無融合生殖體，使得基本上消除了有性生殖(WO 01/32001)。
本說明書描述本發(fā)明人的現(xiàn)有技術(shù)方法——可預(yù)測(cè)地從有性植物產(chǎn)生無融合生殖植物的方法——的一個(gè)重要進(jìn)展。在詳細(xì)地描述該進(jìn)展之前，重要的是注意到本發(fā)明人的方法(WO 98/33374，WO 01/32001)是目前公開的唯一的可以預(yù)測(cè)地從有性植物產(chǎn)生無融合生殖植物并使這些無融合生殖植物遺傳穩(wěn)定的方法。在此方面，WO 98/33374和WO01/32001教導(dǎo)，可以通過制備如下F1雜種誘導(dǎo)無融合生殖，在所述F1雜種中非同步表達(dá)的發(fā)育程序之間存在發(fā)育破壞性競(jìng)爭(zhēng)(
圖10)。在適當(dāng)?shù)剡x擇親本系時(shí)，在F1雜種的胚珠中大孢子發(fā)生和胚囊形成信號(hào)的表達(dá)在時(shí)間上重疊。在這些雜種中胚囊形成常常傾向于取代大孢子發(fā)生或珠心細(xì)胞發(fā)育，這分別造成二倍性孢子生殖的或無孢子生殖的胚囊形成(圖7-9)。
WO 01/32001還教導(dǎo)，以有性方式來源于“遺傳不穩(wěn)定無融合生殖體”的后代通常會(huì)由于負(fù)責(zé)無融合生殖的多個(gè)基因座處的遺傳重組而大部分回復(fù)成有性的。在遺傳不穩(wěn)定的兼性無融合生殖體中，兼性有性生殖過程中的遺傳分離傾向于產(chǎn)生其中的如下等位基因聯(lián)合受到破壞的后代，所述等位基因聯(lián)合造成負(fù)責(zé)無融合生殖的不同步競(jìng)爭(zhēng)。因此，遺傳不穩(wěn)定的兼性無融合生殖體的有性來源后代傾向于表達(dá)較低的無融合生殖外顯率。WO 01/32001。相反地，申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)，某些遺傳不穩(wěn)定兼性無融合生殖體有低百分比的有性來源后代，由于特定的稀少的重組事件(該事件的頻率可以由植物育種工作者預(yù)測(cè))，實(shí)際上表達(dá)較高水平的無融合生殖。在此背景下，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)1.調(diào)節(jié)MMC分化的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因很大程度上獨(dú)立于(除非存在連鎖)調(diào)節(jié)大孢子形成、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因2.調(diào)節(jié)大孢子形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因很大程度上獨(dú)立于(除非存在連鎖)調(diào)節(jié)胚囊發(fā)生、受精、胚形成和胚乳形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因3.調(diào)節(jié)胚囊發(fā)生的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因很大程度上獨(dú)立于(除非存在連鎖)調(diào)節(jié)受精、胚形成和胚乳形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因4.調(diào)節(jié)受精的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因很大程度上獨(dú)立于(除非存在連鎖)調(diào)節(jié)胚形成和胚乳形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因5.調(diào)節(jié)胚形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因很大程度上獨(dú)立于(除非存在連鎖)調(diào)節(jié)胚乳形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因(
圖1-6)。
此發(fā)現(xiàn)的意義在于，各種GDS組分，甚至是每個(gè)GDS組分中的過程，的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間并非專門地由相同基因控制?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人提出如下理論1.各GDS組分的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間可以通過植物育種和選擇而在遺傳上彼此解偶聯(lián)2.可以通過借助植物育種或分子方法有意地修飾某些GDS組分的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間，制備表達(dá)更高水平的無融合生殖(每植物有更多胚珠表達(dá)無融合生殖)的品系3.如果GDS組分在時(shí)間上解偶聯(lián)以致喪失早期大孢子發(fā)生的信號(hào)而保持早期胚囊形成的信號(hào)和/或喪失早期卵細(xì)胞形成和受精的信號(hào)而保持早期胚形成和胚乳形成的信號(hào)，則人工制備的或天然的遺傳不穩(wěn)定無融合生殖體的有性重組后代將表達(dá)更高水平的無融合生殖。本文給出的數(shù)據(jù)說明，GDS階段，例如減數(shù)分裂和胚囊形成，的起始時(shí)間安排是數(shù)量遺傳的性狀，這使得可以如本文所報(bào)道的(
圖11)，在分離中的后代中預(yù)期這些性狀的越親分離(Rieseberg等，2003)。
4.也可以使用在無融合生殖植物產(chǎn)生所需的胚胎學(xué)表型方面表現(xiàn)出等位基因變異性的成對(duì)植物，來作圖和克隆負(fù)責(zé)無融合生殖的基因。
從遺傳不穩(wěn)定兼性無融合生殖體出發(fā)，表達(dá)增加水平的無融合生殖的有性來源(遺傳重組的)后代的百分比一般是低的，但是在植物育種工業(yè)常用的篩選方法的范圍內(nèi)。在被子植物中增加無融合生殖表達(dá)頻率的此新方法已經(jīng)經(jīng)過測(cè)試和實(shí)施(
圖11-14)，由此要求專利保護(hù)。
本說明書公開了增加被子植物的無融合生殖表達(dá)頻率的方法。這些新公開的方法由于本發(fā)明人在GDS組分的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的遺傳控制方面的驚人發(fā)現(xiàn)而成為可能。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，某些遺傳不穩(wěn)定兼性無融合生殖體的低百分比有性來源后代會(huì)由于特定的罕見重組事件而實(shí)際上表達(dá)較高水平的無融合生殖?；诖梭@人發(fā)現(xiàn)的進(jìn)一步研究和開發(fā)，導(dǎo)致了制備和/或增強(qiáng)無融合生殖植物的本公開方法。
發(fā)明概述本說明書的一個(gè)目的是提供從有性被子植物或與所制備的無融合生殖植物相比表達(dá)較低頻率的無融合生殖的被子植物，制備無融合生殖植物的方法。本說明書的另一目的是提供制備無融合生殖得以增強(qiáng)的植物的方法，所述無融合生殖得以增強(qiáng)的植物，相對(duì)于用于產(chǎn)生所述無融合生殖得以增強(qiáng)的植物的植物材料，表達(dá)較高頻率的無融合生殖各種組分(或元素)之一種或多種。無融合生殖元素包括未減數(shù)胚囊形成(無孢子生殖的或二倍性孢子生殖的(diplosporous))、孤雌生殖或不定胚生殖、和自主的或假受精的胚乳形成。本說明書的再一目的是提供增加植物個(gè)體在各種GDS組分的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間方面的遺傳變異性的新方法，其中所述各種GDS組分包括大孢子發(fā)生、胚囊形成(包括卵和中央細(xì)胞形成和成熟)、受精、胚胎形成和胚乳形成。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將在詳述部分闡述或者可以通過本發(fā)明的實(shí)施來彰顯。
為了實(shí)現(xiàn)前述目的，以及根據(jù)本文描述的發(fā)明，本說明書提供用于如下用途的方法-從由如下植物組成的起始植物材料制備無融合生殖植物·有性植物；·與所述的無融合生殖植物相比具有較低無融合生殖的兼性無融合生殖植物；或·有性植物和與所述無融合生殖植物相比具有較低無融合生殖的兼性無融合生殖植物；-制備無融合生殖得以增強(qiáng)的植物，該植物相對(duì)于起始植物材料而言表達(dá)更高頻率的各種無融合生殖元素之一種或多種，所述起始植物材料可以由有性或兼性無融合生殖植物組成；-選擇用于產(chǎn)生所述無融合生殖的或無融合生殖得以增強(qiáng)的植物的起始植物材料；和-從推定的無融合生殖的或無融合生殖得以增強(qiáng)的植物中鑒定出所述無融合生殖植物或無融合生殖得以增強(qiáng)的植物。
特別地，起始植物材料可以由如下組成-有性植物；-與所述無融合生殖的或無融合生殖得以增強(qiáng)的植物相比，表達(dá)較低頻率的無融合生殖或其元素的兼性無融合生殖植物；
-屬于相同物種或親緣物種(同一科內(nèi))的兩種或兩種以上有性植物；-屬于相同物種或親緣物種的兩種或兩種以上兼性無融合生殖植物，其中每種植物均比所述無融合生殖的或無融合生殖得以增強(qiáng)的植物表達(dá)更低頻率的無融合生殖或其元素；或-屬于相同物種或親緣物種的兩種或兩種以上植物，其中所述植物中的一種或多種僅表達(dá)有性生殖，并且所述植物中的一種或多種與所述無融合生殖的或無融合生殖得以增強(qiáng)的植物相比表達(dá)較低頻率的無融合生殖或其元素。
可以理解，可以利用本說明書的方法制備眾多植物，而且相對(duì)于起始植物材料，所制備的這眾多植物在無融合生殖表達(dá)上將表現(xiàn)出一個(gè)從較低表達(dá)至較高表達(dá)的范圍。
一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備無融合生殖植物的方法，所述植物與用于產(chǎn)生該無融合生殖植物的親本植物相比具有更高頻率的無融合生殖種子結(jié)實(shí)(seed set)。本發(fā)明還涉及制備如下植物的方法，所述植物表達(dá)增加頻率的一種或多種無融合生殖元素。無融合生殖元素優(yōu)選包括未減數(shù)胚囊形成(無孢子生殖的或二倍性孢子生殖的)、孤雌生殖或不定胚生殖、和自主的或假受精的胚乳形成。一般地，這些方法包括步驟(a)獲得表達(dá)一種或多種無融合生殖元素而遺傳上該無融合生殖元素不穩(wěn)定的親本植物；(b)使親本植物自花受精或使該親本植物與也表達(dá)無融合生殖元素但遺傳上該無融合生殖元素不穩(wěn)定的另一親緣親本植物進(jìn)行同胞交配；(c)從親本植物獲得種子；(d)播種獲得的種子；(e)由此培育出后代植物；(f)篩選與親本植物相比具有增加頻率的無融合生殖種子結(jié)實(shí)的后代植物；和(g)分離表達(dá)增加頻率的無融合生殖種子結(jié)實(shí)的后代植物。
優(yōu)選地，與親本植物相比，在產(chǎn)生的該分離的后代植物中無融合生殖種子結(jié)實(shí)的頻率高至少5％，更優(yōu)選地比親本植物高至少20％，最優(yōu)選地比親本植物高40％。
在此實(shí)施方案中，步驟(b)至(e)可以任選地重復(fù)至少一次以獲得與前一代相比無融合生殖種子結(jié)實(shí)的頻率增加的第二代或更高世代的后代。
優(yōu)選地，同胞交配是全同胞交配或半同胞交配，但是也可以設(shè)想到其它寬泛的同胞交配，并且這些同胞交配旨在包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在再一實(shí)施方案中，親本植物通過如下方式獲得從繁殖種群中鑒定表現(xiàn)出極端的GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系(breeding lines)；從表現(xiàn)極端的GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系選擇第一和第二植物，其中相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平，第一植物的胚囊形成平均起始時(shí)間出現(xiàn)于第二植物的大孢子發(fā)生平均起始時(shí)間之后或之前不久；將第一和第二親本植物雜交；從第一或第二植物獲得種子；播種獲得的種子；由此培育出后代植物；和鑒定表達(dá)無融合生殖元素且該元素在遺傳上不穩(wěn)定的植物，以獲得親本植物。
本發(fā)明還涉及選擇可以用作用于產(chǎn)生表達(dá)無融合生殖的植物的繁殖種群的一組植物的方法。該方法優(yōu)選包括如下步驟(a)選擇相同被子植物種、屬或科的遺傳趨異生態(tài)型或繁殖品系；(b)相對(duì)于非配子體胚珠或子房結(jié)構(gòu)的成熟水平，表征所述生態(tài)型或繁殖品系的GDS；(c)在所述繁殖種群中包括表現(xiàn)極端和中點(diǎn)的GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系，由此以包括如下植物，在該植物中-在某(些)植物中，相對(duì)于孢子體胚珠和子房結(jié)構(gòu)的成熟水平而言，GDS階段(大孢子發(fā)生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成)提早發(fā)生，-在某(些)植物中，相對(duì)于孢子體胚珠和子房結(jié)構(gòu)的成熟水平而言，GDS階段推遲發(fā)生，
-在某(些)植物中，相對(duì)于孢子體胚珠和子房結(jié)構(gòu)的成熟水平而言，一些GDS階段提早發(fā)生而其它的推遲發(fā)生。
本發(fā)明還涉及為了產(chǎn)生表達(dá)增加頻率的無融合生殖胚囊形成的植物而從繁殖種群選擇親本植物的方法，和為了產(chǎn)生表達(dá)增加頻率的孤雌生殖、不定胚生殖、假受精胚乳形成或自主胚乳形成的植物而從繁殖種群選擇親本植物的方法。這些方法優(yōu)選地包括步驟從繁殖種群鑒定表現(xiàn)極端GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系；和從所鑒定的生態(tài)型或繁殖品系中選出成對(duì)的植物用作親本，使得相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平而言一個(gè)親本中的胚囊形成平均起始時(shí)間提早出現(xiàn)，而另一親本中的雌性減少分裂(大孢子發(fā)生)平均起始時(shí)間推遲出現(xiàn)。
本發(fā)明還包括從有性或兼性無融合生殖親本植物產(chǎn)生無融合生殖的或無融合生殖得以增強(qiáng)的后代植物的方法，包括步驟(a)從被子植物種、屬或科中選擇第一和第二有性或兼性無融合生殖親本植物，其中，相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平，第一親本植物的胚囊形成平均起始時(shí)間與第二親本植物的大孢子發(fā)生平均起始時(shí)間于大約相同時(shí)間發(fā)生，或第一親本植物的胚囊形成平均起始時(shí)間早于第二親本植物的大孢子發(fā)生平均起始時(shí)間；(b)將第一和第二親本植物雜交；(c)從第一或第二植物獲得種子；(d)播種獲得的種子；(e)由此培育出后代植物；(f)鑒定表達(dá)無融合生殖元素且該無融合生殖元素在遺傳上不穩(wěn)定的后代植物；(g)使所鑒定的一個(gè)或多個(gè)后代植物自花受精或同胞交配；(h)從后代植物獲得第二代種子；(i)播種獲得的第二代種子；(j)由此培育出第二代植物；和(k)篩選和鑒定無融合生殖的第二代植物。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從有性或兼性無融合生殖親本植物產(chǎn)生無融合生殖后代植物的方法，包括步驟(a)選擇相同被子植物種、屬或科的遺傳趨異生態(tài)型或繁殖品系；(b)根據(jù)種系發(fā)生序列(GDS)，相對(duì)于孢子體胚珠或子房結(jié)構(gòu)的成熟水平，表征該生態(tài)型或繁殖品系；(c)產(chǎn)生包括了表現(xiàn)極端的GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系的繁殖種群，該種群包含-相對(duì)于孢子體胚珠和子房結(jié)構(gòu)的成熟水平而言具有提早發(fā)生的GDS階段的植物和相對(duì)于孢子體胚珠和子房結(jié)構(gòu)的成熟水平而言具有推遲發(fā)生的GDS階段的植物；或-相對(duì)于孢子體胚珠或子房結(jié)構(gòu)的成熟水平而言具有提早發(fā)生的一些GDS階段和推遲發(fā)生的其它GDS階段的植物；(d)從該繁殖種群鑒定表現(xiàn)極端的GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系；(e)從所鑒定的生態(tài)型或繁殖品系選擇親本植物，其中所選親本植物具有以下特征-相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平而言，在一個(gè)親本植物中的胚囊形成平均起始時(shí)間于另一親本植物的大孢子發(fā)生平均起始時(shí)間之后或之前不久發(fā)生；和-相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平而言，一個(gè)親本植物中的胚胎和胚乳形成的平均起始時(shí)間于另一親本植物的胚囊成熟、卵成熟、中央細(xì)胞成熟和受精階段的平均起始時(shí)間之后或之前不久發(fā)生；(f)使親本植物雜交，由此獲得種子，播種種子，培育出F1后代植物，將F1后代自花受精或互交(intercrossing)，從F1植物獲得F2或雙雜交種子，播種F2或雙雜交種子，由此培育出F2或雙雜交后代；和(g)篩選相對(duì)于親本植物具有增加頻率的無融合生殖種子結(jié)實(shí)的F2或雙雜交后代。
在此實(shí)施方案中，步驟(f)可以任選地重復(fù)至少一次以獲得更高的繁殖世代(breeding generations)，之后從此更高世代的植物中篩選相對(duì)于親本植物具有增加頻率的無融合生殖種子結(jié)實(shí)的植物。
本發(fā)明方法還可以包括步驟使后代的染色體數(shù)目加倍以穩(wěn)定無融合生殖。本發(fā)明還涉及根據(jù)本文公開的方法產(chǎn)生的無融合生殖植物或無融合生殖得以增強(qiáng)的植物，及其后代。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法中使用的植物是稻、小麥、玉米、大麥、高粱、黍、大豆、馬鈴薯或棉花植物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述植物是高粱。
附圖簡(jiǎn)述
圖1從A.corymbosa、A.aromatica、A.umbrinella、A.marginata和A.microhpylla的特定種質(zhì)份(acessions)得到的二分體和ES-2階段的代表性DIC顯微照片。顯微照片中長(zhǎng)的雙箭頭線指示胚珠長(zhǎng)度，其由珠柄長(zhǎng)度加上珠柄遠(yuǎn)端合點(diǎn)組織的長(zhǎng)度構(gòu)成。顯微照片中珠被長(zhǎng)度由較短的雙箭頭線指示，包括遠(yuǎn)端珠被結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度加上近側(cè)合點(diǎn)組織的長(zhǎng)度。后者產(chǎn)生珠被。c＝合點(diǎn)，d＝二分體，f＝珠柄，i＝珠被，n＝珠心。(Kowallis，Carman和Bayer，準(zhǔn)備中)被子植物中，珠心和MMC在珠柄和合點(diǎn)發(fā)育的早期并在珠被分化之前開始分化。然后，由合點(diǎn)表皮中的平周分裂引起珠被的分化。合點(diǎn)、珠柄和珠被在大孢子發(fā)生和早期胚囊形成過程中大部分保持未分化的(Esau1977)。在蝶須屬(Antennaria)，位于合點(diǎn)/珠柄和合點(diǎn)/珠被接合處附近的居間分生組織中的協(xié)調(diào)的平周細(xì)胞分裂的區(qū)造成胚珠彎曲，并呈現(xiàn)出倒生形狀(見顯微照片，左欄)。技術(shù)上，正如文獻(xiàn)中常常陳述的，珠被并不圍繞正在發(fā)育的配子體生長(zhǎng)。相反地，珠被的末端保持緊靠珠柄基部，居間分生組織產(chǎn)生的細(xì)胞的伸長(zhǎng)造成合點(diǎn)和附著合點(diǎn)的性母細(xì)胞或配子體向子房腔(子房室)內(nèi)深處后退。
觀察到倒生胚珠的形成是一個(gè)渠限化的過程，對(duì)于所評(píng)價(jià)的所有蝶須屬物種，該過程基本上一致。在此方面，珠被末端至珠柄起點(diǎn)的距離在所研究的所有物種中是相似的，并且在胚囊形成過程中不發(fā)生可觀的改變(圖2)?？v觀所研究的物種，珠柄、合點(diǎn)和珠被中的細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分化是高度協(xié)調(diào)的過程，其導(dǎo)致基本上一致形狀的倒生胚珠。
在所研究的蝶須屬物種中，倒生胚珠的形成在發(fā)育上看來是渠限化的。相反地，在各份種質(zhì)中觀察到，相對(duì)于倒生胚珠的變化的大小和形狀，大孢子發(fā)生和胚囊發(fā)育的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間存在大的遺傳決定的異時(shí)性(heterochronicity)(圖3)。在A.corymbosa、A.racemosa和A.aromatica中二分體階段常常在倒生形狀完全達(dá)成之前到達(dá)，而在A.microphylla、A.marginata和A.umbrinella中二分體階段卻在該形狀達(dá)成之后很久才到達(dá)(比較
圖1二分體顯微照片和圖2-3)。
圖2針對(duì)31份蝶須屬種質(zhì)，于二分體、四分體、2核胚囊和成熟胚囊階段，胚珠長(zhǎng)度相對(duì)于珠被長(zhǎng)度的線性回歸。在所研究的種質(zhì)份中，胚珠生長(zhǎng)速度傾向于等于珠被生長(zhǎng)速度(y＝1.00(x))，珠被末端至珠柄基部的距離(
圖1)幾乎未從58.7Φm發(fā)生變化。包括了來自A.aromatica(MT00005，MT98034，MT98043，WY98005)、A.racemosa(MT00003，MT00004，MT00006，MT99001)、A.corymbosa(C000001，C000004，MT00001，MT99006)、A.umbrinella(C098031，MT98026，MT98042，MT99003，WY98007，WY99004)、A.microphylla(C098001，C098006，C098009，C098037，C098029，MT98001，MT98007，MT98024，WY98003)、A.marginata(NM98015)、A.densifolia(YK98006，YK98007)和A.rosulata(AZ98008)的數(shù)據(jù)。本發(fā)明人收集了種質(zhì)份并分配了份號(hào)。(Kowallis，Carman和Bayer，準(zhǔn)備中)圖3收集自New Mexico、Colorado、Wyoming和Montana的6份蝶須屬物種種質(zhì)在4個(gè)GDS階段的平均胚珠和珠被長(zhǎng)度。圖中央一組6條疊加的平行線代表觀察到的
圖1所示6份種質(zhì)的平均胚珠和珠被長(zhǎng)度值(這些數(shù)據(jù)也用于回歸分析，圖2)。6條未疊加的線與圖中的那些相同，但是每條線的珠被長(zhǎng)度值進(jìn)行了調(diào)整以利于討論相對(duì)于孢子體倒生胚珠組織的成熟水平而言各線之間在各個(gè)GDS階段的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間上存在的異時(shí)性差異。每條線上的四個(gè)點(diǎn)，從最低點(diǎn)開始向上移動(dòng)，分別代表二分體、四分體、2核胚囊(ES-2)和成熟胚囊(ES-M)階段。與A.corymbosa的C000004份種質(zhì)有關(guān)的標(biāo)記“IL+100”意指為了達(dá)到所觀察到的珠被長(zhǎng)度值(如圖中央所示)，應(yīng)當(dāng)在該線各點(diǎn)的珠被長(zhǎng)度值上增加數(shù)值100。向剩余的線也作了相似的調(diào)整，以使這些線展開。
圖3中未調(diào)整的線是平行和疊加的，這說明倒生胚珠的合點(diǎn)、珠柄和珠被的生長(zhǎng)是發(fā)育上渠限化的事件，即，在各份種質(zhì)之間發(fā)育在很大程度上是不變的(與
圖1、2比較)。相反地，在各份種質(zhì)之間觀察到，相對(duì)于倒生胚珠的成熟水平而言，GDS階段的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間存在廣泛的遺傳變異。例如，在A.corymbosa、A.racemosa和A.aromatica的種質(zhì)份中，二分體和四分體階段平均在胚珠仍然小而不成熟時(shí)出現(xiàn)。相反地，在A.umbrinella、A.marginata和A.microphylla的種質(zhì)份中，二分體和四分體階段出現(xiàn)在胚珠較大并且更成熟時(shí)(與
圖1比較)。注意到，A.marginata和A.umbrinella的ES-2階段出現(xiàn)在珠被/珠柄結(jié)構(gòu)成熟得多時(shí)。也注意到，二分體和四分體階段的時(shí)間安排與ES-2和ES-M階段的時(shí)間安排不相關(guān)。這有力地證實(shí)，每個(gè)GDS階段的起始時(shí)間至少在某種程度上獨(dú)立于其它GDS階段的起始時(shí)間，即，各GDS階段的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間至少在某種程度上是遺傳上相互獨(dú)立的。(Kowallis，Carman和Bayer，準(zhǔn)備中)圖4源于Illinois、Florida、Venezuela和Mexico的5份摩擦禾屬物種(Tripsacum sp.)種質(zhì)在8個(gè)GDS階段的平均內(nèi)珠被長(zhǎng)度。相對(duì)于內(nèi)珠被成熟水平(長(zhǎng)度)，觀察到種質(zhì)份之間在GDS階段的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間上存在廣泛的遺傳變異。T.zopilotense和T.floridanum的二分體和四分體階段平均在內(nèi)珠被仍小且不成熟時(shí)發(fā)生。相反地，T.dactyloides和T.dactyloides var meridionale的二分體和四分體階段在內(nèi)珠被大得多且更成熟時(shí)發(fā)生。注意到，T.floridanum的ES-1階段平均發(fā)生在T.dactyloides種質(zhì)份發(fā)生減數(shù)分裂之前。也注意到，減數(shù)分裂等的時(shí)間安排與其它GDS階段的時(shí)間安排不相關(guān)。這有力地證明，每個(gè)GDS階段的起始時(shí)間在某種程度上獨(dú)立于其它GDS階段的起始時(shí)間，即，各GDS階段的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間在某種程度上是遺傳上彼此獨(dú)立的。摩擦禾屬(Tripsacum)品系的身份T.dactyloides，Illinois，WW-1276(USDA，Woodward，Oklahoma)；T.dactyloides，F(xiàn)lorida，WW-2435；T.dactyloides varmeridionale，MIA 34575(USDA，Miami)，Santander，Clumbia；T.zopilotense，7129-4(CIMMYT，Mexico)，Canon del Zopilote，Esdtado de Guerero，Mexico；T.floridanum，F(xiàn)lorida，MIA 34719。(Bradley和Carman，準(zhǔn)備中)。
圖5測(cè)量雙色蜀黍(Sorghum bicolor)品系之間的GDS變異的不同方式。(A)17份種質(zhì)在5個(gè)GDS階段的平均內(nèi)珠被長(zhǎng)度(DY＝二分體階段、TET＝四分體階段、ES-1＝1核胚囊階段、ES-8＝早期8核胚囊階段、ES-S＝柱頭外露(stigma exertion)階段)。在種質(zhì)份之間觀察到相對(duì)于內(nèi)珠被的成熟水平(長(zhǎng)度)而言GDS階段的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間存在廣泛的遺傳變異。注意到，在1.2、1.1、7.3、5.2和7.1種質(zhì)份中胚囊形成的起始(黃條底部)平均發(fā)生在3.1和9.2種質(zhì)份達(dá)到減數(shù)分裂的二分體階段(橙黃色條底部)之前。也注意到，二分體和四分體階段的時(shí)間安排與ES-1、ES-8和ES-S(柱頭外露時(shí)的胚囊)階段的時(shí)間安排不相關(guān)。這有力地證明，每個(gè)GDS階段的起始時(shí)間安排在很大程度上獨(dú)立于其它GDS階段的起始時(shí)間安排，即，GDS階段的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間在很大程度上是遺傳上彼此獨(dú)立的。高粱屬品系的身份1.2，雙色蜀黍，Aispuri(轉(zhuǎn)變的)、PI 533817(USDA，GRIN)；1.1，雙色蜀黍，Aispuri，PI 253638；7.3，雙色蜀黍(雜種)，0-756，PI302166；5.2，雙色蜀黍，Westland，NSL 4003(USDA)；7.1，石茅高粱(Sorghum halepense)，1111，PI 542649；6.1，雙色蜀黍，Colby，PI 571105；2.1，雙色蜀黍，Kafir(IS 2942)，NSL 51477；7.4，石茅高粱，Zhuronskiya，PI 539065；8.2，Sorghum arundinaceum，R-319，PI 329251；5.1，雙色蜀黍，Early Kalo，NSL 3999；4.2，雙色蜀黍，Karad Local，PI 248318；10.1，雙色蜀黍，Lydenberg Red，IS 2386(ICRISAT)；8.1，Sorghum arundinaceum，IS 12693，PI225905；3.1，雙色蜀黍，IS 3922，NSL 51483；9.1，雙色蜀黍，Vir-5049，PI 562347；4.1，雙色蜀黍，Karad Local，PI 533932；9.2，雙色蜀黍，Agira，PI 217855。(B)兩個(gè)GDS趨異的高粱屬品系在DY、ES1和ES8階段的胚珠面積和珠被角度(與垂直方向的度數(shù)，見圖5C)。注意到，1.2品系的ES1階段平均比9.2品系的DY階段發(fā)生在更小的珠被角度時(shí)(較不成熟的胚珠)(見圖5C)。(C)二分體、ES1和ES8階段的顯微照片，顯示了9.2和1.2品系在胚珠大小(所有的顯微照片均為相同放大倍數(shù))和珠被角度(見圖5B)上存在的差異。注意到，1.2品系比9.2品系在胚珠發(fā)育(大小和珠被角度)的早得多的時(shí)期實(shí)現(xiàn)大孢子發(fā)生和胚囊形成(見圖5A，B)。
圖6擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態(tài)型間的GDS變異；ES2＝具液泡前的2核胚囊階段，ES-8＝早期8核胚囊階段。上部曲線圖和圖片兩種生態(tài)型(Kashmir 0和Canary Islands)的平均胚珠面積和種系結(jié)構(gòu)(二分體、ES2或ES8)深度。從矢狀切面獲取胚珠面積，其包括合點(diǎn)、珠被和珠心。通過從面積測(cè)量的合點(diǎn)周界向珠被頂繪制一條線，然后測(cè)定該種系結(jié)構(gòu)的合點(diǎn)端相對(duì)于該線的深度(見插入的顯微照片)，由此測(cè)定該種系結(jié)構(gòu)的深度。注意，在Kashmire 0品系中比在Canary Islands品系中二分體階段于早得多的發(fā)育時(shí)期(種系深度的百分?jǐn)?shù))發(fā)生(頂部插圖是Kashmir 0的典型二分體階段；底部插圖是Canary Islands生態(tài)型的典型二分體階段)。下部曲線圖和圖片兩種生態(tài)型(Kashmir S和Columbia 0)的平均胚珠面積和種系結(jié)構(gòu)(二分體、ES2或ES8)深度。注意，在Kashmire S品系中比在Columbia 0品系中ES2階段于發(fā)育的較早時(shí)期(種系深度的百分?jǐn)?shù)和胚珠面積)發(fā)生(頂部插圖是Kashmir 0的典型ES2階段；底部插圖是Columbia 0的典型ES2階段)。
圖7在通過GDS趨異的二倍體有性蝶須屬種質(zhì)份(對(duì)于蝶須屬種質(zhì)份之間在GDS時(shí)間安排上的趨異，見
圖1)的雜交產(chǎn)生的F1雜種中，無融合生殖胚囊(無孢子生殖的和二倍性孢子生殖的)和自主胚乳形成的代表性DIC顯微照片。A-G，A.umbrinella(MT99003B)X A.racemosa(MT99001D)A，含有蒲公英屬植物類型的二倍性孢子生殖二分體和具液泡的合點(diǎn)成員(chalazal member)的胚珠；B，含有擴(kuò)大的具液泡的蝶須屬植物類型二倍性孢子生殖MMC的胚珠；C，含有退化中的(非功能性的)四分體(由指向左下方的四個(gè)箭頭標(biāo)示)大孢子的胚珠，所述四分體正在被側(cè)面珠心來源的兩個(gè)1核具液泡的無孢子生殖的胚囊(由另兩個(gè)箭頭指示)消耗；D，含有線性四分體的胚珠，該四分體正在被合點(diǎn)珠心來源的合點(diǎn)2核無孢子生殖的胚囊消耗；E，含有合點(diǎn)珠心來源的3核無孢子生殖的胚囊的胚珠，該胚囊與2核有性胚囊競(jìng)爭(zhēng)；F-G，同一胚珠的兩個(gè)焦平面，顯示早期自主胚乳形成和多核體中的6個(gè)胚乳核。H，A.marginata(NM98015B)X A.racemosa(MT00006D)含有側(cè)面和末端來源的4個(gè)1核無孢子生殖的胚囊的胚珠，這些胚囊與2核有性胚囊競(jìng)爭(zhēng)。I-J，A.corymbosa(C000002A)X A.microphylla(C098030E)含有擴(kuò)大的2核具液泡的蝶須屬植物類型二倍性孢子生殖胚囊的胚珠。
圖8在通過GDS趨異的二倍體有性摩擦禾屬種質(zhì)份(對(duì)于摩擦禾屬種質(zhì)份之間在GDS時(shí)間安排上的趨異，見圖4)的雜交產(chǎn)生的F1雜種中，無融合生殖胚囊(無孢子生殖的和二倍性孢子生殖的)和孤雌生殖胚胎發(fā)育的代表性DIC顯微照片。A-B，T.floridanum(TB23.01C)XT.zopilotense(TB42.01B)含有退化中的四分體加上三個(gè)1核無孢子生殖胚囊和1個(gè)4核無孢子生殖胚囊的胚珠的兩個(gè)焦面。C，T.floridanum(TB23.01A)X T.dactyloides(TB09.08B)含有退化中的四分體(黑色箭頭)和3個(gè)1核無孢子生殖胚囊(白色箭頭)的胚珠。D-F，T.laxum(75-911)X T.pilosum(39-1830)雙倍體(Leblanc等1995)D，含有擴(kuò)大的1核具液泡的蝶須屬植物類型二倍性孢子生殖胚囊的胚珠，E，含有擴(kuò)大的具液泡的蝶須屬植物類型二倍性孢子生殖胚囊的胚珠，所述胚囊處于第一次核有絲分裂的中期，F(xiàn)，含有8-12核(球形期)孤雌生殖胚胎(大箭頭)和未受精的中央細(xì)胞(小箭頭)的胚珠。
圖9在通過GDS趨異的二倍體有性高粱屬種質(zhì)份(對(duì)于高粱屬種質(zhì)份的身份以及種質(zhì)份之間在GDS時(shí)間安排上的趨異，見圖5)的雜交產(chǎn)生的F1雜種中，無融合生殖胚囊(無孢子生殖的和二倍性孢子生殖的)形成的代表性DIC顯微照片。A-B，5.2X9.2A，成熟有性MMC；B，擴(kuò)大并伸長(zhǎng)的二倍性孢子生殖MMC。C，5.1X4.1擴(kuò)大并伸長(zhǎng)的二倍性孢子生殖MMC。D-E，9.1X1.2D，有性四分體的退化中成員(黑色箭頭)被2核無孢子生殖胚囊(白色箭頭指向核)取代。E，有性四分體的退化中成員(黑色箭頭)被1核無孢子生殖胚囊(白色箭頭指向核，白色雙箭頭指向液泡)取代。F，(5.2X9.2)X5.2有性四分體的退化中成員(黑色箭頭)被1核無孢子生殖胚囊(白色箭頭)取代。G-H，2.1X1.1有性四分體的退化中成員(黑色箭頭)的兩個(gè)焦面，所述成員被與1核有性胚囊(H白色箭頭指向核，黑色箭頭指向退化中的大孢子)競(jìng)爭(zhēng)的2核無孢子生殖胚囊(G白色箭頭指向核，白色雙箭頭指向液泡)取代。I，7.4X9.2多個(gè)無孢子生殖胚囊。(Carman和Naumova，準(zhǔn)備中)
圖10如WO 98/33374教導(dǎo)的從有性植物產(chǎn)生無融合生殖植物的方法。在第1階段開始時(shí)，染色體組II產(chǎn)生過早的減數(shù)分裂信號(hào)，由于孢原母細(xì)胞(archespore mother cell)尚未形成，因此這些信號(hào)失效，即，染色體組II以中間表型指示的中間速度發(fā)育。在第2階段開始時(shí)，來自染色體組II的減數(shù)分裂結(jié)束的關(guān)卡信號(hào)使減數(shù)分裂終止，并以類似于在不同步的酵母異核體中觀察到的方式使染色體組I與染色體組II同步化。如果減數(shù)分裂被成功地終止，則出現(xiàn)幾種二倍性孢子生殖形式中的一種，即，直接從大孢子母細(xì)胞(蝶須屬植物類型二倍性孢子生殖)或從幼小的雌性性母細(xì)胞(蒲公英屬植物或苦荬菜屬植物類型二倍性孢子生殖)形成胚囊。如果未能成功終止減數(shù)分裂，則可出現(xiàn)無孢子生殖，即，可以從鄰近的珠心細(xì)胞形成一個(gè)或多個(gè)胚囊。這主要出現(xiàn)在含有多個(gè)或不確切的頸卵器細(xì)胞的物種中。在無孢子生殖和二倍性孢子生殖中，均形成遺傳上未減數(shù)的胚囊。根據(jù)此中間表型(推遲的)進(jìn)度安排，胚珠和子房的孢子體組織繼續(xù)發(fā)育。相反地，由于染色體組I的胚囊發(fā)育基因(僅在胚囊中)與基因組II的胚囊發(fā)育基因的同步化，配子體(胚囊)繼續(xù)過早地發(fā)育。來自兩個(gè)同步化染色體組的信號(hào)誘導(dǎo)卵形成和孤雌生殖，相對(duì)于胚珠和子房的孢子體組織的發(fā)育，兩者在大多數(shù)無融合生殖體中均過早地發(fā)生。授粉根據(jù)此中間表型進(jìn)度安排而發(fā)生，但是卵不再有接受力而且在大多數(shù)情況下卵已經(jīng)分裂。如果不是自主的，中央細(xì)胞會(huì)受精并發(fā)育出胚乳和孤雌生殖胚胎(WO 98/33374)。
圖11兩個(gè)雙色蜀黍親本品系(5.1，7.1)、由其產(chǎn)生的F1雜種(1184A.04)和21個(gè)分離的F2后代(對(duì)于親本品系的來源，見圖5)，在減數(shù)分裂(M)和1核胚囊階段的平均內(nèi)珠被長(zhǎng)度。注意到，在134 F2中ES1起始時(shí)間安排上出現(xiàn)越親分離(Rieseberg等，2003)，即，在134中ES1的起始時(shí)間安排早于其任一祖父母。也注意到，在150 F2和12 F2中出現(xiàn)減數(shù)分裂起始時(shí)間安排的越親分離，即，在這些植物中減數(shù)分裂的發(fā)生晚于其任一祖父母。
圖12相對(duì)于21個(gè)F2后代的減數(shù)分裂(二分體和四分體階段)期珠被長(zhǎng)度和1核胚囊期珠被長(zhǎng)度間的差異(見
圖11)，表達(dá)無孢子生殖胚囊形成的胚珠的百分?jǐn)?shù)的一階倒數(shù)回歸(first order inverseregression)。隨著減數(shù)分裂和1核胚囊形成之間的時(shí)間間隔的縮短，由于遺傳因素，無孢子生殖胚囊形成的趨勢(shì)增加。(Carman和Naumova，準(zhǔn)備中)
圖13相對(duì)于21個(gè)F2后代的減數(shù)分裂(二分體和四分體階段)期珠被長(zhǎng)度和1核胚囊期珠被長(zhǎng)度間的差異(見
圖11)，胚囊發(fā)育失敗的百分?jǐn)?shù)的線性回歸。胚囊發(fā)育夭折一般發(fā)生在四分體形成后不久，即，在減數(shù)分裂和1核胚囊正常形成時(shí)之間的時(shí)期。隨著這兩個(gè)事件之間的時(shí)間間隔的增加，由于遺傳因素，胚囊發(fā)育出現(xiàn)早期夭折的趨勢(shì)也增加。(Carman和Naumova，準(zhǔn)備中)
圖14在從1184A.04產(chǎn)生的F2s(見
圖11)中，無孢子生殖胚囊形成、四分體或早期胚囊退化和四分體極性逆轉(zhuǎn)的代表性DIC顯微照片。A-F，無孢子生殖胚囊形成A，含有4個(gè)無孢子生殖原始細(xì)胞(擴(kuò)大的珠心細(xì)胞)和1核有性胚囊的胚珠；B，含有早期退化的四分體和大的1核無孢子生殖胚囊(四分體的右邊)的胚珠；C，含有晚期退化的四分體和大的1核無孢子生殖胚囊(四分體的右下面)的胚珠；D，含有晚期退化的四分體和3個(gè)1核無孢子生殖胚囊(四分體右面)的胚珠；E，含有晚期退化的四分體和大的1核無孢子生殖胚囊(四分體右面)的胚珠；F，含有極晚期退化的四分體和大的2核無孢子生殖胚囊(四分體右面)的胚珠。G-J，四分體或早期有性胚囊的退化G，四分體形成后發(fā)生的退化以及一些關(guān)于功能性大孢子已開始形成的跡象；H，四分體階段發(fā)生的退化，無功能性大孢子發(fā)育的跡象；I，明顯在有性胚囊開始形成之后，可能地在1或2核期發(fā)生的退化；J，可能遲至4核有性胚囊階段的退化。K，四分體極性逆轉(zhuǎn)(polarity reversal)，其中珠孔成員已經(jīng)形成4核有性胚囊，而其它四分體成員形成1核有性胚囊。ai＝無孢子生殖原始細(xì)胞，es1＝1核有性胚囊，aes1或aes2＝1或2核無孢子生殖胚囊。(Carman和Naumova，準(zhǔn)備中)
圖15有關(guān)i)高粱屬植物有性大孢子發(fā)生和胚囊形成、ii)通過本發(fā)明方法從有性高粱屬植物產(chǎn)生的合成無融合生殖體(來自兩個(gè)雙色蜀黍品系NSL 3999和PI 542649的雜交的F2)的無融合生殖(無孢子生殖)胚囊形成、和iii)通過本發(fā)明方法從有性摩擦禾屬二倍體植物產(chǎn)生的合成三倍體(3x)無融合生殖體的二倍性孢子生殖胚囊形成(T.laxum/T.pilosum 4x復(fù)倍體//T.laxum 2x)的圖和DIC顯微照片。產(chǎn)生無融合生殖胚囊的胚珠的百分?jǐn)?shù)對(duì)于合成高粱屬和摩擦禾屬無融合生殖體分別大約為25％和90％。注意，體細(xì)胞染色體數(shù)目(2n)在有性過程中減至1n，而在無融合生殖方式產(chǎn)生的胚囊的核中保持在2n。在無孢子生殖中，產(chǎn)生胚囊的有性過程夭折(在圖中被叉掉)，并被其中珠心，或罕見地珠被，的體細(xì)胞再分化并發(fā)育成遺傳未減數(shù)的胚囊的過程所代替。在二倍性孢子生殖中，大孢子母細(xì)胞未能完成減數(shù)分裂或在一些情況下甚至未能開始減數(shù)分裂(取決于二倍性孢子生殖的類型，減數(shù)分裂步驟在圖中被叉掉)，而是再分化并直接發(fā)育成遺傳未減數(shù)的胚囊。
圖16根據(jù)網(wǎng)狀進(jìn)化結(jié)構(gòu)雜合性(RS)模型，蝶須屬植物的無融合生殖起源實(shí)例。該示意圖描述在無融合生殖Antennaria rosea的有性祖先中觀察到的趨異GDS表型(見
圖1-3)。GDS表型由通過生境物種形成過程進(jìn)化的相互適應(yīng)的基因復(fù)合體編碼。二級(jí)接觸雜交(secondarycontact hybridization)以及之后的網(wǎng)狀進(jìn)化造成影響GDS時(shí)間安排的趨異等位基因的洗牌。觀察到3類分離子1)具有造成有性不育或半不育的未解決的GDS異步的分離子(遠(yuǎn)交抑制；見
圖11、14)；2)具有解決的GDS異步的有性能育分離子(見
圖11、15)；和3)具有造成無融合生殖的獨(dú)特ESDS異步的分離子(無性能育性，見
圖11、14)。在后者(無融合生殖)中，胚囊形成占先于減數(shù)分裂，胚形成占先于受精。然后，無融合生殖需要結(jié)構(gòu)雜合性或有性不育來獲得遺傳穩(wěn)定(
圖17；WO 01/32001)。正是結(jié)構(gòu)雜合性造成了無融合生殖模擬簡(jiǎn)單遺傳。
圖17使造成無融合生殖的連鎖不平衡得以穩(wěn)定的核型機(jī)制。為了使遺傳穩(wěn)定性得以存在，必須使大量連鎖基因座處的連鎖不平衡(見
圖11-13)不僅通過以無性方式(經(jīng)無融合生殖)產(chǎn)生的后代世代而且通過經(jīng)正常有性過程以兼性方式產(chǎn)生的后代世代來維持。圖示機(jī)制通過有效地將成百至成千個(gè)基因連接在一起成為復(fù)合基因座(超基因簇)——在這種基因座中重組受到抑制——而有效地實(shí)現(xiàn)該穩(wěn)定化。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳述術(shù)語在公開和描述增加被子植物無融合生殖表達(dá)頻率的本發(fā)明方法前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于特定的配置、方法步驟以及材料，因?yàn)檫@些配置、方法步驟和材料可以進(jìn)行相當(dāng)程度的變化。也應(yīng)理解，本文所用術(shù)語僅僅旨在用于描述特定實(shí)施方案，并不旨在進(jìn)行限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅僅受到后附權(quán)利要求及其等同方案的限制。
本文中提及的出版物和其它參考資料被并入以描述本發(fā)明的背景和提供有關(guān)本發(fā)明實(shí)施的附加細(xì)節(jié)。提供本文討論的參考文獻(xiàn)僅因?yàn)槠湓诒旧暾?qǐng)?zhí)峤蝗罩耙压_。在此不應(yīng)理解為承認(rèn)本發(fā)明人無權(quán)依據(jù)在先發(fā)明而優(yōu)先于這些公開。
必須注意，在本說明書和所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“a”、“an”、和“the”，除非上下文中有清楚的申明，否則包括復(fù)數(shù)的所指事物。
在描述和要求保護(hù)本發(fā)明前，根據(jù)以下闡述的定義來使用如下術(shù)語。
本文中，“包含”、“包括”、“含有”、“特征在于”和它們的語法上的等價(jià)物均是包括性或開放式術(shù)語，其不排除其它的、未述及的成員或方法步驟?！鞍睉?yīng)解釋為包括了更具限制性的術(shù)語“由......組成”和“基本上由......組成”。
本文中，“由......組成”及其語法等價(jià)物排除了未在權(quán)利要求中規(guī)定的任何成員、步驟或成分。
本文中，“基本上由......組成”及其語法等價(jià)物將權(quán)利要求的范圍限制在規(guī)定的材料或步驟以及那些不實(shí)質(zhì)上地影響所要求保護(hù)的發(fā)明的基本新特征(1個(gè)或多個(gè))的材料和步驟。
本文中，“無融合生殖”及其語法等價(jià)物指植物通過種子的無性繁殖。主要是在比較老的文獻(xiàn)中，該術(shù)語無融合生殖包括了通過種子以外的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)進(jìn)行的繁殖。然而，在過去50年期間，術(shù)語“無融合生殖”在文獻(xiàn)中越來越被限制為無性種子形成，包括導(dǎo)致無性種子形成的配子體無融合生殖(無孢子生殖和二倍性孢子生殖)和不定胚形成形式(Asker和Jerling 1992)。在本說明書中，使用術(shù)語“無融合生殖”的此受限制的定義。因此，無融合生殖植物的以無融合生殖方式產(chǎn)生的種子含有一般是母本植物之遺傳克隆的胚胎。
本文中，“兼性無融合生殖”及其語法等價(jià)物指單體植物可以以有性方式和無融合生殖方式繁殖，即，該植物的一個(gè)或多個(gè)胚珠可以以有性方式產(chǎn)生種子而且該植物的一個(gè)或多個(gè)胚珠可以以無融合生殖方式產(chǎn)生種子。幾乎沒有例外地，所有被子植物無融合生殖體都被認(rèn)為是兼性無融合生殖體(Asker和Jerling 1992)。
本文中，“專性無融合生殖”及其語法等價(jià)物指單體植物僅通過無融合生殖方式繁殖。據(jù)認(rèn)為，自然界中即使有的話也只有很少的專性植物無融合生殖體存在(Asker和Jerling 1992)。
本文中，“無融合生殖水平”及其語法等價(jià)物指植物中以無融合生殖方式產(chǎn)生種子的胚珠的百分?jǐn)?shù)。高度無融合生殖的或強(qiáng)無融合生殖的植物的大多數(shù)胚珠以無融合生殖方式產(chǎn)生種子。一般地，近專性無融合生殖植物的胚珠中有98％以上以無融合生殖方式產(chǎn)生種子。弱無融合生殖植物的胚珠中只有很少以無融合生殖方式產(chǎn)生種子。
本文中，“遺傳不穩(wěn)定無融合生殖植物”及其語法等價(jià)物指這樣的無融合生殖植物，其中，在該遺傳不穩(wěn)定無融合生殖植物的有性來源后代中無融合生殖水平平均低于該遺傳不穩(wěn)定無融合生殖植物的無融合生殖水平。自遺傳不穩(wěn)定兼性無融合生殖體開始，經(jīng)過數(shù)個(gè)有性來源世代后，兼性無融合繁殖傾向于被有性繁殖或不育代替(WO01/32001)。
本文中，“MMC”及其語法等價(jià)物指被子植物胚珠中的大孢子母細(xì)胞(megasporocyte)。
本文中，“GDS組分”及其語法等價(jià)物指種系發(fā)育序列(germlinedevelopment sequence)的組分。這些組分是由MMC分化、大孢子發(fā)生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成組成。
本文中，“無融合生殖元素”及其語法等價(jià)物包括未減數(shù)的胚囊形成(無孢子生殖的和/或二倍性孢子生殖的)、孤雌生殖和/或不定胚生殖和自主的或假受精的胚乳形成。
歷史背景無融合生殖天然地在僅少數(shù)作物和僅少數(shù)其它作物的近親中發(fā)生。其存在于甘蔗、柑橘、蘋果、桃、芒果、黑莓、覆盆子、胡桃、草莓、向日葵、甜菜、黃瓜和洋蔥的栽培種或近緣野生物種中。在飼料和草皮作物中，其存在于早熟禾屬(Poa)(草地早熟禾)、臂形草屬(Brachiaria)、垂穗草屬(Bouteloua)、披堿草屬(Elymus)、蒺藜草屬(Cenchrus)、畫眉草屬(Eragrostis)、黍?qū)?Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)和雀稗屬(Paspalum)的野生或栽培種中(Carman1997)。本發(fā)明涉及在這些作物以及所有其它可能不具有無融合生殖近親的被子植物作物中誘導(dǎo)或增強(qiáng)無融合生殖表達(dá)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明存在其它的商業(yè)用途，例如，在諸如園藝、花卉栽培和林業(yè)(尤其是闊葉樹)等領(lǐng)域的應(yīng)用。
被子植物中無融合生殖胚珠發(fā)育常始于大孢子發(fā)生被自MMC自身(二倍性孢子生殖)或自附近珠心(圍繞MMC的組織)細(xì)胞或罕見地自珠被(圍繞珠心的葉狀結(jié)構(gòu)，無孢子生殖，
圖15)開始的過早胚囊形成所占先。二倍性孢子生殖的和無孢子生殖的胚囊含有遺傳未減數(shù)的卵和核(圖7-9，14)。在無融合生殖體中，遺傳未減數(shù)的卵的受精一般被自該卵(孤雌生殖)或罕見地自該胚囊的另一未減數(shù)細(xì)胞開始的過早胚胎形成所占先。這些事件常常發(fā)生在柱頭能夠接受花粉之前。無融合生殖發(fā)育也可以自不定胚形成開始，其中珠心或珠被的體細(xì)胞發(fā)育成胚胎，該胚胎有效地取代有性方式產(chǎn)生的卵或胚胎。無融合生殖發(fā)育結(jié)束于(1)在遺傳未減數(shù)的無孢子生殖或二倍性孢子生殖胚囊中自主的(中央細(xì)胞不受精)或假受精的(中央細(xì)胞被一個(gè)或兩個(gè)精核受精)胚乳形成；或(2)在遺傳減數(shù)的胚囊中正常的胚乳形成(中央細(xì)胞被單個(gè)精核受精)，其中有性胚囊被不定胚取代(Asker和Jerling1992)。
造成無融合生殖的信號(hào)的強(qiáng)度的擺動(dòng)使得無融合生殖體中可以兼性表達(dá)有性生殖。如果不是所有的也是大多數(shù)的無融合生殖體是兼性的，這意味著無融合生殖體產(chǎn)生的種子中有一定百分?jǐn)?shù)將通過有性方式而非無融合生殖方式形成，而且該百分?jǐn)?shù)受到遺傳和環(huán)境因素的影響(Asker和Jerling 1992)。在近專性無融合生殖體中，每株植物的種子中以有性方式形成的種子的百分?jǐn)?shù)可能低于1％。相反地，弱兼性無融合生殖體可能以無融合生殖方式產(chǎn)生不足1％的種子。
幾種類型的無融合生殖已有描述。大多數(shù)發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)早期。在蝶須屬植物類型的二倍性孢子生殖中，極早出現(xiàn)了用于過早胚囊形成的信號(hào)，這些信號(hào)導(dǎo)致正常會(huì)經(jīng)歷大孢子發(fā)生的MMC形成遺傳未減數(shù)的胚囊，而沒有開始大孢子發(fā)生的痕跡。在蒲公英屬植物類型的二倍性孢子生殖中，用于胚囊形成的信號(hào)不太過早出現(xiàn)，在第一次減數(shù)分裂后使大孢子發(fā)生中斷。無融合生殖Elymus rectisetus中胚囊形成開始時(shí)間的擺動(dòng)使得可以出現(xiàn)有性發(fā)育、蒲公英屬植物類型二倍性孢子生殖、蝶須屬植物類型二倍性孢子生殖以及介于蒲公英屬植物類型和蝶須屬植物類型之間的各種形式(Crane和Carman 1987)。在山柳菊屬(Hieracium)植物類型的無孢子生殖中，被過早的和異位的胚囊誘導(dǎo)信號(hào)影響的細(xì)胞位于珠心或罕見地珠被中。這些受影響的珠心或珠被細(xì)胞經(jīng)歷三輪核內(nèi)有絲分裂，產(chǎn)生成熟的遺傳未減數(shù)的8核胚囊。在黍?qū)?Panicum)植物類型的無孢子生殖中，僅發(fā)生兩輪核內(nèi)有絲分裂，導(dǎo)致成熟的遺傳未減數(shù)的4核胚囊。其它無融合生殖類型也已有描述，并由Asker和Jerling(1992)作了綜述。
在過去的100年間已經(jīng)提出了5種無融合生殖遺傳模型假說1.染色體異源(遠(yuǎn)源雜交)模型，其中無融合生殖幾乎不或完全不需要基因作用；2.數(shù)量遺傳模型，其中無融合生殖需要許多突變來源的無融合生殖基因；3.簡(jiǎn)單遺傳模型，其中無融合生殖需要一個(gè)至極少數(shù)個(gè)突變來源的無融合生殖基因；4.外遺傳模型，其中無融合生殖不需要無融合生殖基因；5.網(wǎng)狀來源的結(jié)構(gòu)雜合性(RS)模型，其中野生型等位基因的獨(dú)特組合造成無融合生殖，并且該組合通過結(jié)構(gòu)雜合性得以穩(wěn)定(本發(fā)明人的模型)。
染色體異源模型在20世紀(jì)早期得到Ernst的支持。其提出，無融合生殖是染色體異源的一個(gè)功能，即，它是遠(yuǎn)緣雜交造成的幾種細(xì)胞遺傳異常中的一種。因此，無融合生殖不受基因控制，而是染色體結(jié)構(gòu)趨異的結(jié)果。該假說在其出現(xiàn)后不久就被拋棄，因?yàn)闊o融合生殖被證實(shí)可以發(fā)生在染色體很大程度上同源的植物中。20世紀(jì)后期，遺傳研究提示，無融合生殖是簡(jiǎn)單遺傳的，即，它涉及到基因(Carman1997)。
數(shù)量遺傳模型在20世紀(jì)早期至中期盛行。其擁護(hù)者是Muntzing和Powers，Muntzing相信無融合生殖是由少數(shù)至許多隱性基因的精致平衡所導(dǎo)致的，而Powers相信隱性基因造成了無融合生殖的三個(gè)主要元素大孢子發(fā)生的失敗、無融合生殖胚囊形成和孤雌生殖。在20世紀(jì)后半葉，從眾多的無融合生殖遺傳分析(包括許多天然無融合生殖體)得到的結(jié)果強(qiáng)烈暗示無融合生殖是簡(jiǎn)單遺傳的。因此，數(shù)量遺傳假說被大部分放棄(Asker和Jerling 1992)。
從20世紀(jì)60年代至今，大多數(shù)無融合生殖科學(xué)家支持簡(jiǎn)單遺傳模型，即，一個(gè)或兩個(gè)顯性基因賦予了無融合生殖。直到最近，該結(jié)論一直表現(xiàn)出存在充分的根據(jù)，因?yàn)槊系聽柗治鲋貜?fù)地產(chǎn)生簡(jiǎn)單遺傳分離比率，例如在有性植物和無融合生殖植物的雜交中常常產(chǎn)生1∶1的無融合生殖后代與有性后代的比率(Asker和Jerling 1992；Savidan 2000，2001；Sherwood 2001)。基于這些發(fā)現(xiàn)，在20世紀(jì)80年代和90年代啟動(dòng)了幾個(gè)得到充分資助的R & D計(jì)劃，這些計(jì)劃集中于將“無融合生殖基因”從野生型天然無融合生殖物種通過漸滲植物育種方案(雜交和回交)轉(zhuǎn)移至有性親緣作物物種。然而，盡管存在表面上的簡(jiǎn)單遺傳，然而數(shù)年的努力仍未導(dǎo)致假定的“無融合生殖基因”的鑒定和分離，也未導(dǎo)致該基因向有性作物轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生商業(yè)有價(jià)值的作物。盡管已經(jīng)容易地產(chǎn)生無融合生殖野生型親緣植物與作物物種間的無融合生殖雜種，然而該雜種與其后代仍是雜草樣的或者很大程度上不育(Spielman等2003)。而且，作圖研究目前指示，如果無融合生殖由一個(gè)或少數(shù)無融合生殖基因控制，則這些基因位于重組受到抑制的大染色體區(qū)域中(Spielman等2003；Koltunow和Grossniklaus2003)。因此，今天的許多科學(xué)家正在考慮無融合生殖可能被許多基因和調(diào)節(jié)物控制的可能性(Carman 1997；WO 98/33374；WO 01/32001；Grimanelli等2001；Grossniklaus等2001；Richards 2003；Spielman等2003；Koltunow和Grossniklaus 2003)。
外遺傳模型提出，無融合生殖由基因調(diào)節(jié)上的可遺傳的外遺傳改變所致。這些外遺傳改變由DNA甲基化的改變而引起，其中DNA甲基化的改變可能由于雜交、染色體重排和多倍性而伴隨著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變。該模型組合了突變和雜交模型的元素。外等位基因(epiallele)是可遺傳的，如突變一樣，并且它們可以通過雜交和多倍體化來誘導(dǎo)(Koltunow和Grossniklaus 2003)。然而，外遺傳模型未對(duì)如下事實(shí)作出解釋雜交和多倍體化在460多個(gè)被子植物科的進(jìn)化和物種形成中扮演著主要角色(Ramsey和Schemske 1998)，然而含有無融合生殖物種的屬有75％以上屬于僅僅3個(gè)科(Carman 1997)。
本發(fā)明的發(fā)明人研發(fā)了RS模型，該模型提出無融合生殖是多個(gè)通過結(jié)構(gòu)雜合性獲得遺傳穩(wěn)定的數(shù)量遺傳性狀的產(chǎn)物(
圖16-17)。RS模型的許多元素在以前已經(jīng)得以證實(shí)。例如，通過使表達(dá)趨異的GDS時(shí)間安排的生態(tài)型雜交，可以產(chǎn)生無融合生殖植物(WO 98/33374)，并且通過防止構(gòu)成原因的這些基因座的重組，可以在遺傳上穩(wěn)定無融合生殖植物(WO 01/32001)。在WO 98/33374和WO 01/32001提交后發(fā)現(xiàn)了RS模型的其它元素，這些元素在本文中第一次進(jìn)行了闡述。這些元素使得可以產(chǎn)生與用于制備它們的植物相比具有更高的無融合生殖表達(dá)頻率的植物(
圖11-12)。在這點(diǎn)上，在此提出專利申請(qǐng)，以保護(hù)以可預(yù)測(cè)的方式從有性或兼性無融合生殖植物產(chǎn)生表達(dá)增加百分?jǐn)?shù)的無融合生殖的后代植物，即，其中更大百分?jǐn)?shù)的胚珠通過無融合生殖方式發(fā)育的植物的方法。
使發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)的發(fā)現(xiàn)兩件早先的專利申請(qǐng)，WO 98/33374和WO 01/32001，和本說明書中描述的新技術(shù)是制備無融合生殖植物的領(lǐng)域的主要進(jìn)展。這些專利申請(qǐng)與制備無融合生殖植物的其它已公開方法相比是獨(dú)特的，因?yàn)楸景l(fā)明人的方法涉及操作大孢子發(fā)生、胚囊形成、柱頭外露(stigmaexertion)、受精、胚形成和胚乳形成(所有這些均是正常有性過程)在起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間上的天然存在的遺傳變異性(
圖1-6，11-13)。相反地，其它已公布的方法涉及的是，操作突變來源的假定的無融合生殖基因或操作基因調(diào)節(jié)的外遺傳改變(Spielman等2003；Koltunow和Grossniklaus 2003)。
本說明書和WO 98/33374彼此相似，因?yàn)閮烧呔婕爸苽渑c起始植物相比表達(dá)更高無融合生殖頻率的植物的方法。它們?cè)谌绾问勾箧咦影l(fā)生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成解偶聯(lián)以允許無融合生殖發(fā)生上是根本不同的。WO 98/33374中的方法主要依賴于整個(gè)GDS序列的非同步性(
圖10)。本發(fā)明依賴于如下方法，該方法(a)使大孢子發(fā)生與胚囊形成在時(shí)間上解偶聯(lián)從而致使無孢子生殖或二倍性孢子生殖的胚囊形成可以發(fā)生(與大孢子發(fā)生的同時(shí)或之前編碼的胚囊形成)和(b)使卵成熟、中央細(xì)胞形成和成熟及受精與胚形成和胚乳形成在時(shí)間上解偶聯(lián)從而致使孤雌生殖和自主的或假受精的胚乳形成可以發(fā)生(
圖11-16)。
在闡明本發(fā)明的具體方法前，對(duì)目前有關(guān)調(diào)節(jié)無融合生殖各種元素的基因的假說進(jìn)行綜述是有利的。通過比較這些假說與本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，可清楚地看出本發(fā)明人的方法在開發(fā)可預(yù)測(cè)地產(chǎn)生無融合生殖植物的方法上使現(xiàn)有技術(shù)獲得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。
無融合生殖的元素在20世紀(jì)前半葉已進(jìn)行了清楚描述，其包括大孢子發(fā)生的中斷或夭折、無孢子生殖或二倍性孢子生殖的胚囊形成、孤雌生殖或不定胚生殖和自主的或假受精的胚乳形成(Gustafsson1946，1947a，1947b)。很清楚，在過去的40年關(guān)于無融合生殖的遺傳調(diào)節(jié)的最流行觀點(diǎn)派別是，造成無孢子生殖或二倍性孢子生殖胚囊形成的單突變可能多效性地也造成孤雌生殖(Savidan 2000，2001)。然而，自20世紀(jì)前半葉的幾個(gè)科學(xué)家開始，許多科學(xué)家已經(jīng)在遺傳上使無融合生殖胚囊形成與孤雌生殖解偶聯(lián)，這提示無融合生殖的這些元素是受不同基因調(diào)節(jié)的(Gustafsson 1947a；Spielman等2003)。對(duì)于分立的發(fā)育步驟的解偶聯(lián)的這種理解最先在20世紀(jì)前半葉形成(Gustafsson 1947a)，之后Nogler對(duì)此理解進(jìn)行了記載，并且其通過將無融合生殖胚囊形成描述為連接大孢子發(fā)生和有性胚囊形成之間的發(fā)育聯(lián)結(jié)的斷開(或解偶聯(lián))而對(duì)該觀點(diǎn)作了延伸(Nogler 1984)。
今天研究無融合生殖的大多數(shù)科學(xué)家相信，造成無融合生殖的這些解偶聯(lián)的和重新洗牌的事件在大多數(shù)情況下由至少兩個(gè)在遺傳上緊密連鎖的無融合生殖基因(正?；虻耐蛔?控制，或由野生型基因調(diào)節(jié)上的外遺傳修飾來控制(Spielman等2003；Koltunow和Grossniklaus 2003)。相反地，本發(fā)明的發(fā)明人證實(shí)，無融合生殖是天然地或通過雜交有意地組合在一起的各非同步表達(dá)的發(fā)育程序間相互競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。正如WO 98/33374中教導(dǎo)的，無融合生殖胚囊形成可以發(fā)生在起始有性胚囊形成的基因(遺傳自其中大孢子發(fā)生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成在胚珠發(fā)育中較早發(fā)生的植物)與起始大孢子發(fā)生的基因(遺傳自其中的大孢子發(fā)生等等在胚珠發(fā)育中相對(duì)晚地發(fā)生的不同植物)于大約相同時(shí)間表達(dá)時(shí)或者前者在后者表達(dá)之前表達(dá)時(shí)(
圖10)。因此，無融合生殖不是由無融合生殖基因本身或外遺傳修飾引起的，而是一種遺傳性狀，在該性狀中相對(duì)于孢子體胚珠組織的發(fā)育成熟度，負(fù)責(zé)早胚囊形成的野生型等位基因與負(fù)責(zé)晚大孢子發(fā)生的野生型等位基因競(jìng)爭(zhēng)并占先，而負(fù)責(zé)早胚形成和胚乳形成的野生型等位基因與編碼卵和中央細(xì)胞成熟及受精的所需條件的野生型等位基因競(jìng)爭(zhēng)并占先。
WO 01/32001教導(dǎo)，兼性無融合生殖植物的有性來源分離子將表達(dá)與親本植物相同的(相同百分?jǐn)?shù)的胚珠通過無融合生殖方式發(fā)育)無融合生殖水平或比親本植物低的無融合生殖水平。例如，涉及負(fù)責(zé)無融合生殖的雜合基因座(非同步表達(dá)的雌性發(fā)育序列)的重組，如果獲得遺傳，可能導(dǎo)致在這些關(guān)鍵基因座純合的后代，這可能破壞負(fù)責(zé)無融合生殖的發(fā)育競(jìng)爭(zhēng)。在這點(diǎn)上，大孢子發(fā)生和受精的解偶聯(lián)僅被視為這些過程被競(jìng)爭(zhēng)信號(hào)搶先除去(
圖10)。WO 98/33374中從未考慮或提示過大孢子發(fā)生、胚囊形成、受精等等的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間是彼此獨(dú)立地調(diào)節(jié)的。相反地，它教導(dǎo)了非同步性涉及整個(gè)序列(
圖10)而不是該序列的個(gè)體組分(
圖11-14，16)。
本發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)，控制大孢子發(fā)生的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因與控制胚囊形成等的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因不同(
圖11-14)。基于此發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出如下理論(1)MMC形成、大孢子發(fā)生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成可以通過育種和單獨(dú)地對(duì)每個(gè)步驟的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行選擇而在遺傳上彼此解偶聯(lián)，和(2)來自遺傳不穩(wěn)定無融合生殖體的有性重組后代，在遺傳分離造成等位基因重新洗牌以致早大孢子發(fā)生等位基因喪失而早胚囊形成的等位基因得以保持時(shí)，可以表達(dá)更高水平的無融合生殖(
圖11-13)。在檢驗(yàn)此理論時(shí)，證實(shí)在來自合成產(chǎn)生的和遺傳不穩(wěn)定的兼性無融合生殖植物的有性分離子中有低百分?jǐn)?shù)的有性分離子比母本植物表達(dá)高得多頻率的無融合生殖胚珠發(fā)育(
圖11-12)。此現(xiàn)象是可預(yù)測(cè)的并且是本發(fā)明的發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)。
本說明書與WO 98/33374和WO 01/32001結(jié)合在一起，提供了從有性或兼性無融合生殖植物產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的無融合生殖植物的方法，其中前者比產(chǎn)生的該無融合生殖植物具有較低的無融合生殖。高頻率的無融合生殖(近專性表達(dá))對(duì)于無融合生殖的許多農(nóng)業(yè)應(yīng)用是重要的。近專性表達(dá)可以保證作物的均一性(花期、植物高度、產(chǎn)量變量、營(yíng)養(yǎng)變量等)，這是現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)實(shí)踐所必需的。因此，有利的是提供產(chǎn)生具有增加頻率的無融合生殖表達(dá)的植物的方法，其中所述頻率的增加是相對(duì)于該改良品系的來源植物而言的。應(yīng)當(dāng)理解，本申請(qǐng)的這些和其它優(yōu)點(diǎn)(以下討論)是當(dāng)前技術(shù)水平中的主要進(jìn)展。
本發(fā)明的方法為了方便起見，將本發(fā)明的方法分成五類(a)匯編含有足夠遺傳變異性的植物品系群，以通過植物育種或遺傳工程產(chǎn)生植物內(nèi)的無融合生殖(或其一個(gè)或多個(gè)元素)表達(dá)頻率增加的植物，(b)將所述的品系群自交、雜交或進(jìn)行其它遺傳修飾以致產(chǎn)生可以從中獲得具有更高無融合生殖的植物的植物，(c)產(chǎn)生后續(xù)世代的重組植物，(d)篩選無融合生殖植物，和(e)重復(fù)某些步驟以增加產(chǎn)生無融合生殖得以增強(qiáng)的植物的頻率。
匯編從中可以產(chǎn)生無融合生殖水平增加的植物的植物品系群本發(fā)明方法的一個(gè)步驟涉及選擇或產(chǎn)生有性或兼性無融合生殖的植物，其中從這些植物可以產(chǎn)生無融合生殖生殖表達(dá)增加的植物。獲得所述有性或兼性無融合生殖植物的一個(gè)方法是沿襲WO 98/33374的方法。因此，每一所述有性或兼性無融合生殖植物的親本植物將已有詳細(xì)表征，以致相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的發(fā)育成熟度，一個(gè)親本的胚囊形成的起始在另一親本的大孢子發(fā)生的大約同時(shí)或之前發(fā)生(
圖1-6，10)。
另一步驟涉及選擇所述親緣植物(related plants)以便它們給下一代雜種貢獻(xiàn)在大孢子發(fā)生、胚囊形成、受精、胚胎形成或胚乳形成相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織而言的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間上的遺傳變異性(不同等位基因)(
圖1-6，11-13，16)。例如，如果相對(duì)于孢子體胚珠和子房組織的發(fā)育成熟度，所述有性或兼性無融合生殖雜種植物的一個(gè)親本的胚囊形成在另一親本的大孢子發(fā)生的大約同一時(shí)間或之前發(fā)生，但是相對(duì)于孢子體胚珠和子房組織的發(fā)育成熟度而言兩個(gè)親本植物的受精于大約相同時(shí)間發(fā)生，那么，可以選擇受精發(fā)生時(shí)間比這兩個(gè)親本早得多或晚得多的植物作為所述的親緣植物。
應(yīng)當(dāng)理解，胚珠中各雌性發(fā)育階段的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的遺傳變異性是本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)(
圖1-6，11-13)，而且無融合生殖看來在自然界中由于網(wǎng)狀進(jìn)化(
圖16)(涉及控制胚珠發(fā)育階段的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的基因的分離重組)及之后的如WO 01/32001所述的遺傳穩(wěn)定化(
圖17)的結(jié)果而進(jìn)化。因此，如上所述，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供增加植物個(gè)體或植物群體中在大孢子發(fā)生、胚囊形成、受精、胚胎形成和胚乳形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間方面的遺傳變異性的方法，其中從所述的植物個(gè)體和植物群體可以產(chǎn)生無融合生殖表達(dá)增強(qiáng)的植物。
遺傳修飾植物品系群以增加產(chǎn)生無融合生殖水平增高的植物的頻率本發(fā)明方法的另一步驟涉及使所述有性或兼性無融合生殖雜種植物雜交或自交或使它們中的一個(gè)或多個(gè)與相同種、屬或科的親緣植物遠(yuǎn)交。預(yù)期將很快克隆出控制GDS階段的時(shí)間安排的基因，并且可以將這些基因用于如下替代方法中，在該替代方法中涉及轉(zhuǎn)化以便按適當(dāng)方式修飾GDS時(shí)間安排從而誘導(dǎo)無融合生殖。對(duì)于植物育種，可以使用標(biāo)準(zhǔn)植物育種程序例如Poehlman(1987)教導(dǎo)的程序完成自交、雜交或遠(yuǎn)交，對(duì)于作圖、克隆和轉(zhuǎn)化，可以使用該產(chǎn)業(yè)中充分實(shí)踐的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如Weigel和Glazebrook(2002)中教導(dǎo)的方法。
產(chǎn)生從中可以選出無融合生殖水平增加的植物的后續(xù)世代重組植物本發(fā)明方法的其它步驟包括播種從自交、回交、交叉雜交(例如，全同胞或半同胞雜交，見Poehlman 1987)、遠(yuǎn)交或遺傳工程得到的種子，和培育所得的第二代或后續(xù)世代植物。
選擇無融合生殖水平增加的植物本發(fā)明方法的其它步驟包括通過(a)使用細(xì)胞胚胎學(xué)方法(圖7-9，11-14)或(b)產(chǎn)生第一代、第二代或后續(xù)世代植物的后代并對(duì)這些植物進(jìn)行后代測(cè)定以鑒定比其親本表達(dá)更高無融合生殖頻率的無融合生殖植物，來篩選第一代、第二代或后續(xù)世代植物以獲得無融合生殖。
重復(fù)某些步驟以增加產(chǎn)生無融合生殖得以增強(qiáng)的植物的頻率本發(fā)明方法的其它步驟包括重復(fù)一次或多次前面的步驟以產(chǎn)生額外的分離世代，從這些分離世代通過實(shí)施額外的篩選和后代測(cè)定步驟可以獲得和鑒定無融合生殖增強(qiáng)的植物。
實(shí)施例本發(fā)明參考如下實(shí)施例進(jìn)行描述。這些實(shí)施例僅為舉例說明目的而提供。它們不旨在以任何方式限制本發(fā)明。使用了本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或以下具體描述的技術(shù)?？梢岳斫猓景l(fā)明可以在不偏離其精神或本質(zhì)特征的情況下以多種具體形式實(shí)施。
實(shí)施例1選擇可以產(chǎn)生無融合生殖增強(qiáng)的植物的蝶須屬植物品系無融合生殖最先在Antennaria alpina中作了胚胎學(xué)水平的描述(Juel 1900)。蝶須屬植物(x＝14)是雌雄異株的草本多年生植物，并通常具匍匐莖。32個(gè)有性二倍體物種的基于形態(tài)學(xué)的分支分析結(jié)合對(duì)核內(nèi)核糖體DNA的已測(cè)序內(nèi)部轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)的分析(ITS-1 & ITS-2)指示，蝶須屬植物由6個(gè)進(jìn)化枝組成(Bayer 1990；Bayer等1996)。無融合生殖僅出現(xiàn)在Catepes進(jìn)化枝，其包含32個(gè)有性蝶須屬植物物種中的17個(gè)以及4x至12x的有性和無融合生殖多倍體(Bayer和Stebbins 1987；Bayer和Minish 1993)。該組的所有成員均具有匍匐莖并且是兩性異形的。有性和無融合生殖蝶須屬物種的品種間雜交得到的5個(gè)地理趨異綜種(無融合生殖綜種(agamic complexes))，A.alpine(L.)Gaetn.，A.howellii E.L.Greene，A.parliniiFern.，A.parvifolia Nutt.，和A.rosea，從Catipes的有性成員中進(jìn)化產(chǎn)生(Bayer 1987；Bayer等1996)。
表1蝶須屬物種，收集的棲所的數(shù)目和緯度范圍

A.rosea無融合生殖綜種的多樣性中心是北美的落基山脈，其范圍從New Mexico和southern California，北至Alaska和NorthwestTerritories，以及東至Alberta、Saskatchewan、北部的Great Lakes，在Atlantic Canada有間斷分布群體(Bayer 1989a)。其一般是四倍體，但是也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三倍體和五倍體植物(Bayer和Stebbins 1987)。其似乎是通過涉及A.aromatica Evert，A.corymbosa E.Nelson，A.pulchella E.Greene，A.marginata E.Greene，A.microphyllaRydb.，A.racemosa Hook.，A.rosulata Rydb.和A.umbrinella Rydb.的復(fù)交(multiple hybridizations)和漸滲來產(chǎn)生的。這些物種是主要棲息在西部山系未覆冰部分的有性物種。表型性分析說明，A.aromatica、A.corymbosa、A.microphylla、A.pulchella/media和A.umbrinella是A.rosea綜種的主要有性祖先。僅僅少數(shù)A.rosea克隆表現(xiàn)出可以歸因于A.marginata或A.rosulata的形態(tài)學(xué)特征(Bayer 1990)。33個(gè)A.rosea群體的所有成對(duì)酶譜比較分析顯示僅僅有微小的趨異。遺傳同一性(I)平均為0.944(范圍＝0.802-0.997)。大多數(shù)A.rosea群體與A.corymbosa、A.microphylla、A.pulchella/media和A.umbrinella最相似。較少數(shù)與A.aromatica、A.marginata和A.rosulata相似(Bayer 1989b)。
在對(duì)生物和非生物因子的廣泛調(diào)查中，有性A.aromatica、A.corymbosa、A.marginata、A.media/pulchella、A.microphylla、A.racemosa、A.rosulata和A.umbrinella出現(xiàn)在不同的生境，而無融合生殖A.rosea占據(jù)了整個(gè)排列(ordination)的中央并與除了A.aromatica和A.racemosa之外的所有其它有性物種的排列(ordination)空間的至少部分發(fā)生重疊(Bayer等1991)。此研究也支持了A.rosea的復(fù)交雜種起源的假說。A.rosea的許多棲所與其二倍體有性祖先占據(jù)了相似的生境，而其它棲所占據(jù)了居于其有性祖先的生境之間的雜種生境(hybrid habitats)(Bayer等1991)。因此，存在來自各種來源(形態(tài)學(xué)的、同工酶的、生態(tài)學(xué)的)的良好證據(jù)來支持A.rosea無融合生殖綜種的復(fù)交雜種起源假說。
遍及Rocky Mountain Cordillera從有性蝶須屬植物的天然生境收集有性蝶須屬植物，對(duì)其進(jìn)行栽培、胚胎學(xué)分析GDS變異(
圖1-3)，并進(jìn)行育種以產(chǎn)生表達(dá)無融合生殖的植物(圖7)。
實(shí)施例2選擇可以從中產(chǎn)生無融合生殖得以增強(qiáng)的植物的高粱屬品系有證據(jù)證明在至少一些高粱屬品系中存在低水平的兼性無融合生殖種子形成(不超過25％)(Hanna等1970；Tang等1980；Schertz1992；Bala Ravi 1993)。為了評(píng)價(jià)這些品系中的無融合生殖是否產(chǎn)生自雜交而非偶發(fā)突變，我們檢驗(yàn)了如下虛假設(shè)(null hypothesis)無融合生殖不能出現(xiàn)在通過將已知兼性無融合生殖高粱屬品系的祖先雜交產(chǎn)生的雜種中。就我們所知，這種簡(jiǎn)單的檢驗(yàn)以前從未進(jìn)行過，即，傳統(tǒng)知識(shí)認(rèn)為無融合生殖通過突變產(chǎn)生。獲得了兩個(gè)兼性無融合生殖高粱屬品系‘R473’和‘302’的祖先。R437的祖先是‘IS 2942’(日中性Kafir系)和‘Aispuri’(短日照Indian品種)(Tang等1980)。302的祖先是‘IS 3922’和‘Karad Local’(Rana等1981)。基于生境的多樣性或被進(jìn)行無融合生殖研究前的歷史，選擇了合計(jì)20種雙色蜀黍(S.bicolor)、14種四倍體Sorghum X Almum、4種四倍體石茅高粱(S.halapense)、3種S.arundinacium、3種三倍體S.australiense(2n＝4x＝20，即，n＝5)、以及2種未知家系的遠(yuǎn)源雜種的其它品系。表2列出了參與產(chǎn)生隨后用于無融合生殖胚胎學(xué)篩選的雜種的GDS已表征品系。
表2用于產(chǎn)生從中篩選無融合生殖的雜種的GDS已表征品系

species物種；Race品種；name名稱；origin起源；Sensitivity靈敏性；status狀況；Landrace地方品種；breeding material育種材料；wild野生；S.bicolor雙色蜀黍?qū)嵤├?表征高粱屬品系中的GDS變異和產(chǎn)生表達(dá)無融合生殖的植物如Peel等(1997a，b)中所述，將用于細(xì)胞學(xué)分析的雌蕊處死、固定、作透明處理，并利用DIC顯微鏡觀察。獲得MMC、二分體、三分體/四分體、功能性大孢子、1核胚囊、2核胚囊、4核胚囊、早期8核胚囊、成熟胚囊、柱頭外露以及成熟種子階段的細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)。針對(duì)所分析的每一個(gè)胚珠，獲得如下數(shù)據(jù)減數(shù)分裂或胚囊發(fā)育階段、雌蕊長(zhǎng)度和寬度、珠被長(zhǎng)度和寬度和性母細(xì)胞或胚囊的長(zhǎng)度和寬度。表3-4示例了用于對(duì)高粱屬品系進(jìn)行GDS表征的從MMC至成熟胚囊階段的數(shù)據(jù)一覽表(顯示了來自品系SB1001.1的數(shù)據(jù))。其它數(shù)據(jù)一覽表用于獲得柱頭外露和成熟種子階段的細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)。栽培表2的植物，胚胎學(xué)分析其GDS變異(圖5)，并使用該植物通過WO 98/33374的方法(圖9)以及通過本發(fā)明的方法(
圖11-15)產(chǎn)生表達(dá)無融合生殖的植物。
相對(duì)于內(nèi)珠被的成熟水平(長(zhǎng)度)而言，兩個(gè)雙色蜀黍親本品系(5.1，7.1)的21個(gè)F2在減數(shù)分離和胚囊形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間上存在廣泛的遺傳分離(
圖11)。幾個(gè)F2朝一個(gè)或另一個(gè)親本分離，例如，在245和150達(dá)到M和ES-1時(shí)內(nèi)珠被長(zhǎng)度與母本的相似，而108在這些階段的珠被長(zhǎng)度類似父本。這些數(shù)據(jù)提供了額外的證據(jù)證實(shí)影響減數(shù)分裂起始時(shí)間的基因可能與影響胚囊形成起始時(shí)間的基因不同。
圖11中的F2后代按M至ES1的持續(xù)時(shí)間(黃條長(zhǎng)度)遞減的方式排列。本發(fā)明的一個(gè)目的是強(qiáng)調(diào)遞減的M至ES1持續(xù)時(shí)間(黃條長(zhǎng)度)與無孢子生殖胚囊形成百分?jǐn)?shù)(
圖11中頂部數(shù)字；見
圖12)負(fù)相關(guān)(具有高度的顯著性)，并與胚珠退化(
圖11中底部數(shù)字；見
圖13)正相關(guān)(顯著的)。胚珠退化的頻率和無孢子生殖胚囊形成的頻率在親本中是低的。在5.1中135個(gè)處于適當(dāng)階段的胚珠僅有4％形成了無孢子生殖原始細(xì)胞；無一形成無孢子生殖胚囊。相反地，由其產(chǎn)生所有F2的F1雜種(1184A.04)中，許多(9％)胚珠顯示了無孢子生殖胚囊形成(百分?jǐn)?shù)以處于功能性大孢子階段至2核胚囊階段，即易于觀察到無孢子生殖胚囊形成的階段的胚珠中是否存在無孢子生殖活性作為基礎(chǔ))。在這點(diǎn)上，大多數(shù)F2，相對(duì)于其F1親本，以遠(yuǎn)離無孢子生殖胚囊形成的方式分離。然而，一些F2保持了相似水平的無孢子生殖胚囊活性(
圖11，植物70、218、12)，而兩個(gè)F2超過F1水平2至3倍(
圖11，植物182 & 134；
圖14，15)。來自各種F2的胚珠表現(xiàn)出非無孢子生殖和二倍性孢子生殖胚囊形成的異常，包括四分體退化、線性四分體的極性逆轉(zhuǎn)和多個(gè)四分體成員經(jīng)歷胚囊形成(
圖14)。這些異?？赡苡韶?fù)責(zé)GDS時(shí)間安排的等位基因間的不和諧引起(Carman和Naumova，準(zhǔn)備中)。
表3包括雙色蜀黍SB1001.1原始數(shù)據(jù)(總結(jié)在表3中)的數(shù)據(jù)一覽表

固定目錄注釋雙色蜀黍Tag # PI253638 植物#1-1 品種Aispuri(高)子房＝解剖顯微鏡12X 250um＝3.25 lines胚珠和珠被＝01ympus顯微鏡20X 1um＝0.835cm




表4雙色蜀黍品系在9個(gè)胚珠發(fā)育階段的子房、外和內(nèi)珠被及生殖結(jié)構(gòu)(性母細(xì)胞或ES)的平均長(zhǎng)度和標(biāo)準(zhǔn)差(總共3450個(gè)胚珠)

前面實(shí)施例中描述的步驟和材料在任何方面都僅僅被視為舉例說明性質(zhì)不非限制性的，本發(fā)明的范圍由后附權(quán)利要求而非前面的描述來指示。處于權(quán)利要求的等同意義和范圍內(nèi)的所有改變均包括在其范圍內(nèi)。
參考文獻(xiàn)Asker SE，L Jerling.1992.植物無融合生殖(Apomixis inplants).CRC Press，Boca RatonBala Ravi S.1993.高梁屬植物品系R473中無融合生殖——真或假？已發(fā)表工作的評(píng)論性分析.Cur Sci 64306-315Bayer RJ.1989a.Antennaria rosea(菊科Inuleae)多倍體無融合生殖綜種中的同工酶變異模式.Sys Bot 14389-397Bayer RJ.1989b.Antennaria rosea(AsteraceaeInuleaeGnaphaliinae)多倍體綜種的分類學(xué)修訂.Brittonia 4153-60Bayer RJ.1990.Antennaria Gaertner(AsteraceaeInuleae)的系統(tǒng)發(fā)育重建.Canad J Bot 681389-1397Bayer RJ，BG Purdy，DG Lebedyk.1991.8個(gè)AntennariaGaertner(AsteraceaeInuleae)有性物種及其異源多倍體衍生物A.rosea之間的生態(tài)位差異.Evol Trends Plants 5109-123Bayer RJ，DE Soltis，PS Soltis.1996.基于來自細(xì)胞核核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的序列的蝶須屬植物(AsteraceaeGnaphalieae)系統(tǒng)發(fā)育推論.Amer J Bot 83516-527Bayer RJ，GL Stebbins.1987.蝶須屬植物(AsteraceaeInuleae)的染色體數(shù)目、分布模式和無融合生殖.Sys Bot 12305-319Bayer RJ，TM Minish.1993.Antennaria soliceps(AsteraceaeInuleae)，一種來自Spring Mountain的地理局限性高山無融合生殖體，的同工酶變異、生態(tài)學(xué)和植物地理學(xué).Nevada.Madrono 4075-89Carman JG.1997.被子植物中重復(fù)基因的非同步表達(dá)可以造成無融合生殖、僅雙孢擔(dān)子形成、四分孢子狀態(tài)、和多胚現(xiàn)象.Biol J LinnSoc 6151-94Carman JG.2000.配子體無融合生殖的進(jìn)化.T Batygina編有花植物胚胎學(xué)(Embryology of Flowering Plants)，Vol.3繁殖系統(tǒng).Russian Academy of Sciences，St.PetersburgCarman JG.2001.基因效應(yīng)基因組碰撞和無融合生殖.YSavidan，JG Carman，T Dresselhaus編無融合生殖的繁盛從機(jī)制到遺傳工程(The Flowering of ApomixisFrom Mechanisms toGenetic Engineering).Mexico，D.F.C1MMYT，IRD，EuropeanCommission DG VI(FAIR)Crane CF，JG Carman.1987.東亞和新西蘭的Elymus rectisetus的無融合生殖機(jī)制.Amer J Bot 74477-496Esau K.1977.種子植物解剖學(xué)(Anatomy of Seed Plants).JohnWiley & Sons，New YorkEstrada-Luna AA，W Huanca-Mamani，G Acosta-Garcia，GLeon-Martinez，A Becerra-Flora，RI Perez-Ruiz，J-PHVielle-Calzada.2002.超越混雜有花植物中從有性至無融合生殖.In Vitro Cell Devel Biol Plant 38146-151Grimanelli D，O Leblanc，E Perotti，U Grossniklaus.2001.配體子無融合生殖的發(fā)育遺傳學(xué).Trends Genet 17597-604Grossniklaus U，GA Nogler，PJ Van Dijk.2001.如何避免性配子體無融合生殖的遺傳控制.Plant Cell 131491-1498Guillen-Portal F.R，D.D.Baltensperger，L.A.Nelson，G.Frickel，2002，針對(duì)Nebraska Panhandle評(píng)價(jià)硬質(zhì)紅色冬小麥F2和F3雜種，Community Soil Science and Plant Analysis，Monticello，N.Y.，Marcel Dekker Inc.，33(5/6)p.963-972Gustafsson A.1946.高等植物的無融合生殖.I.無融合生殖的機(jī)制.Lunds Universitets Arsskrift 421-67Gustafsson A.1947a.高等植物的無融合生殖.II無融合生殖的原因.Lunds Universitets Arsskrift 4369-179Gustafsson A.1947b.高等植物的無融合生殖，III.生物型和物種形成.Lunds Universitets Arsskrift 43181-370Hanna WW，KF Schertz，EC Bashaw.1970.Sorghum bicolor(L.)Moench中的無孢子生殖.Science 170338-339Juel O.1900.Vergleichende untersuchungen über typischeund parthenogenetische forpf lanzung bei der gattung AntennariaKgl.Sven Vetenskapsakad，Ak.Handl.33 No.51-59Koltunow AM，U Grossniklaus.2003.無融合生殖發(fā)展前景.Annual Review of Plant Biology 54547-574Leblanc O，M Duenas，M Hern ández，S Bello，V Garcia，JBerthaud，Y Savidan.1995.Tripsacum的染色體加倍人為有性四倍體植物的產(chǎn)生.Plant Breeding 114226-230Nogler GA 1984.配子體無融合生殖.BM Johri編，被子植物胚胎學(xué)(Embryology of Angiosperms)，Berlin，Germany，SpringerVerlagPeel MD，JG Carman，O Leblanc.1997a.無融合生殖綠毛蒺藜草、草地草熟禾、Pennisetum squamulatum Fresen、Tripsacum L.、和彎葉畫眉草的大孢子母細(xì)胞胼胝質(zhì).Crop Sci 37724-732Peel MD，JG Carman，ZW Liu，RR-C Wang.1997b.小麥和無融合生殖Elymus rectisetus(Nees in Lehm.)的雜種中的減數(shù)分裂異常A.Love & Connor.Crop Sci 37717-723Poehlman JM.1987.大田作物育種(Breeding Field Crops).VanNostrand Reinhold，New YorkRamsey J，DW Schemske.1998.有花植物中多倍體形成的途徑、機(jī)制和比率.Ann Rev Ecol Syst 29467-501Rana BS，CS Reddy，VJM Rao，NGP Rao.1981.谷物高粱的無融合生殖種子結(jié)實(shí)的分析和選擇結(jié)果.Indian J Genet Plant Breed41118-123Richards AJ.2003.有花植物的無融合生殖綜述(Apomixis inflowering plantsan overview).Philosophical Transactions ofthe Royal Society of London B 3581085-1093Rieseberg LH，Widmer A，Arntz AM，Burke JM.2003.越親分離所必需的遺傳體系結(jié)構(gòu)在天然和馴化種群中是共同的.Philosophical Transactions of the Royal Society of London B 3581141-1147.
Savidan Y.2000.無融合生殖遺傳和育種.Plant Breed.Rev.1813-86Savidan YH.2001.配子體無融合生殖雌性配子發(fā)生的成功突變.S.S.Bhojwani，WY Soh(編)，被子植物胚胎學(xué)當(dāng)前趨勢(shì)(CurrentTrends in the Embryology of Angiosperms).
Schertz KF.1992.高粱屬植物的無融合生殖.JH Elgin，JPMiksche編，Proceedings of the Apomixis Workshop，F(xiàn)ebruary11-12，1992，Atlanta，Georgia，USDA-ARS，ARS-104Sherwood RT.2001.無融合生殖遺傳分析.Y Savidan，JG Carman，T Dresselhaus(編)，無融合生殖的繁盛從機(jī)制到遺傳工程，Mexico，D.F.CIMMYT，IRD，European Commission DG VI(FAIR)Spielman M，R Vinkenoog，RJ Scott.2003.無融合生殖遺傳機(jī)制，Phil Trans Royal Soc Lon B 3581095-1103Tang CY，KF Schertz，EC Bashaw.1980.高粱屬植物品系及其F1后代中的無融合生殖.Bot Gaz 141294-299Toenniessen GH.2001.21世紀(jì)的世界糧食供應(yīng)植物育種、生物技術(shù)和無融合生殖的潛在作用，Y Savidan，JG Carman，TDresselhaus(編)，無融合生殖的繁盛從機(jī)制到遺傳工程(TheFlowering of ApomixisFrom Mechanisms to Genetic Engineering)，Mexico，D.F.CIMMYT，IRD，European Commission DG VI(FAIR)Weigel D，J Glazebrook.2002.擬南芥屬植物，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Arabidopsis，A Laboratory Manual).Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New YorkYuan LP.1993.雜交稻育種的兩系法系統(tǒng)的進(jìn)展，KMuralidhoran，EA Siddig(編)，水稻研究中的新領(lǐng)域(NewFrontiersin Rice Research)，Hyderabad，IndiaDirectorate ofRice Research，pg 86-9權(quán)利要求
1.產(chǎn)生無融合生殖種子結(jié)實(shí)的頻率增加的無融合生殖后代植物的方法，包括步驟(a)獲得表達(dá)一種或多種無融合生殖元素且該無融合生殖元素在遺傳上不穩(wěn)定的親本植物；(b)使該親本植物自花受精或使該親本植物與另一也表達(dá)無融合生殖元素但該無融合生殖元素在遺傳上不穩(wěn)定的親緣親本植物進(jìn)行同胞交配；(c)從這些親本植物獲得種子；(d)播種獲得的種子；(e)由此培育出后代植物；(f)從這些后代植物中篩選與親本植物相比無融合生殖種子結(jié)實(shí)的頻率增加的植物；(g)分離表達(dá)增加頻率的無融合生殖種子結(jié)實(shí)的后代植物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所分離的后代植物中無融合生殖種子結(jié)實(shí)的頻率比親本植物高至少5％。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所分離的后代植物中無融合生殖種子結(jié)實(shí)的頻率比親本植物高至少20％。
4.權(quán)利要求1的方法，其中由親本植物表達(dá)的所述一種或多種無融合生殖元素選自不減數(shù)胚囊形成、孤雌生殖、不定胚生殖、假受精的胚乳形成和自主的胚乳形成。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述一種或多種無融合生殖元素是不減數(shù)胚囊形成和孤雌生殖。
6.權(quán)利要求1的方法，還包括重復(fù)步驟(b)至(e)至少一次以獲得與前面世代相比無融合生殖種子結(jié)實(shí)的頻率增加的第二代或更高世代的后代。
7.權(quán)利要求1的方法，其中同胞交配是全同胞交配或半同胞交配。
8.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生的無融合生殖植物是稻、小麥、玉米、大麥、大豆、馬鈴薯或棉花植物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生的無融合生殖植物是高粱。
10.權(quán)利要求1的方法，其中親本植物通過如下方式獲得從繁殖種群中鑒定表現(xiàn)極端GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系；從表現(xiàn)極端的GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系中選擇第一和第二植物，其中相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平，第一植物的胚囊形成平均起始時(shí)間出現(xiàn)于第二植物的大孢子發(fā)生平均起始時(shí)間之后不久或之前不久；將第一和第二親本植物雜交；從第一或第二植物獲得種子；播種獲得的種子；由此培育出后代植物；和鑒定表達(dá)無融合生殖元素且該無融合生殖元素在遺傳上不穩(wěn)定的植物，以獲得親本植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的無融合生殖植物及其無融合生殖后代。
12.權(quán)利要求11的無融合生殖植物或其后代，其中該植物是稻、小麥、玉米、大麥、大豆、馬鈴薯或棉花植物。
13.權(quán)利要求11的無融合生殖植物或其后代，其中該植物是高粱。
14.產(chǎn)生表達(dá)更高頻率的一種或多種無融合生殖元素的后代植物的方法，包括步驟(a)獲得兼性表達(dá)無融合生殖元素的親本植物；(b)使該親本植物自花受精或使該親本植物與另一也兼性表達(dá)無融合生殖元素的親緣親本植物進(jìn)行同胞交配；(c)從親本植物獲得種子；(d)播種所得種子；(e)由此培育出后代植物；(f)從這些后代植物中篩選與親本植物相比一種或多種無融合生殖元素的表達(dá)頻率增加的植物；和(g)分離表達(dá)增加頻率的一種或多種無融合生殖元素的后代植物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述一種或多種無融合生殖元素選自不減數(shù)胚囊形成、孤雌生殖、不定胚生殖、假受精的胚乳形成和自主的胚乳形成。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述一種或多種無融合生殖元素是不減數(shù)胚囊形成和孤雌生殖。
17.權(quán)利要求14的方法，還包括重復(fù)步驟(b)至(e)至少一次以獲得與前面世代相比一種或多種無融合生殖元素的頻率增加的第二代或更高世代的后代。
18.權(quán)利要求14的方法，其中同胞交配是全同胞交配或半同胞交配。
19.權(quán)利要求14的方法，其中產(chǎn)生的植物是稻、小麥、玉米、大麥、大豆、馬鈴薯或棉花植物。
20.權(quán)利要求14的方法，其中產(chǎn)生的植物是高粱。
21.權(quán)利要求14的方法，其中親本植物通過如下方式獲得從繁殖種群中鑒定表現(xiàn)極端GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系；從表現(xiàn)極端的GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系中選擇第一和第二植物，其中相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平，第一植物的胚囊形成平均起始時(shí)間出現(xiàn)于第二植物的大孢子發(fā)生平均起始時(shí)間之后不久或之前不久；將第一和第二親本植物雜交；從第一或第二植物獲得種子；播種獲得的種子；由此培育出后代植物；和鑒定表達(dá)無融合生殖元素且該無融合生殖元素在遺傳上不穩(wěn)定的植物，以獲得親本植物。
22.根據(jù)權(quán)利要求14的方法產(chǎn)生的具有增加頻率的一種或多種無融合生殖元素的植物，及其后代。
23.權(quán)利要求22的植物或其后代，其中該植物是稻、小麥、玉米、大麥、大豆、馬鈴薯或棉花植物。
24.權(quán)利要求22的植物或其后代，其中該植物是高粱。
25.從有性或兼性無融合生殖親本植物產(chǎn)生無融合生殖后代植物或無融合生殖得以增強(qiáng)的后代植物的方法，包括步驟(a)從被子植物種、屬或科中選擇第一和第二有性或兼性無融合生殖親本植物，其中相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平，第一親本植物的胚囊形成平均起始時(shí)間出現(xiàn)于第二親本植物的大孢子發(fā)生平均起始時(shí)間的大約同時(shí)或之前；(b)將第一和第二親本植物雜交；(c)從第一或第二植物獲得種子；(d)播種所得種子；(e)由此培育出后代植物；(f)鑒定表達(dá)無融合生殖元素且該無融合生殖元素在遺傳上不穩(wěn)定的后代植物；(g)使鑒定的一個(gè)或多個(gè)后代植物自花受精或同胞交配；(h)從該后代植物獲得第二代種子；(i)播種獲得的該第二代種子；(j)由此培育出第二代植物；和(k)篩選并鑒定無融合生殖的第二代植物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中重復(fù)步驟(f)至(j)至少一次以產(chǎn)生第三代或更高世代的植物用于從中篩選無融合生殖種子結(jié)實(shí)增加的植物。
27.權(quán)利要求25的方法，還包括步驟使第二代或更高世代的植物的染色體數(shù)目加倍。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的方法產(chǎn)生的無融合生殖植物或無融合生殖得以增強(qiáng)的植物，及其后代。
29.從有性或兼性無融合生殖親本植物產(chǎn)生無融合生殖后代植物的方法，包括步驟(a)選擇相同被子植物種、屬或科的遺傳趨異生態(tài)型或繁殖品系；(b)相對(duì)于非配子體胚珠或子房結(jié)構(gòu)的成熟水平，根據(jù)種系發(fā)育序列(GDS)表征生態(tài)型或繁殖品系；(c)產(chǎn)生包括了表現(xiàn)極端GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系的繁殖種群，該種群包含-相對(duì)于孢子體胚珠和子房結(jié)構(gòu)的成熟水平而言具有提早發(fā)生的GDS階段的植物和相對(duì)于孢子體胚珠和子房結(jié)構(gòu)的成熟水平而言具有推遲發(fā)生的GDS階段的植物；或-相對(duì)于孢子體胚珠或子房結(jié)構(gòu)的成熟水平而言具有提早發(fā)生的GDS階段和推遲發(fā)生的其它GDS階段的植物；(d)從該繁殖種群鑒定表現(xiàn)極端的GDS時(shí)間安排的生態(tài)型或繁殖品系；(e)從所鑒定的生態(tài)型或繁殖品系選擇親本植物，其中所選親本植物具有如下特征-相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平而言，在一個(gè)親本植物中的胚囊形成平均起始時(shí)間于另一親本植物的大孢子發(fā)生平均起始時(shí)間之后或之前不久出現(xiàn)；和-相對(duì)于孢子體胚珠或子房組織的成熟水平而言，一個(gè)親本植物中的胚胎和胚乳形成的平均起始時(shí)間于另一親本植物的成熟胚囊、卵成熟、中央細(xì)胞成熟和受精階段的平均起始時(shí)間之后或之前不久出現(xiàn)；(f)使親本植物雜交，由此獲得種子，播種該種子，培育出F1后代植物，使F1后代自花受精或互交，從F1植物獲得F2或雙雜交種子，播種該F2或雙雜交種子，由此培育出F2或雙雜交后代；和(g)篩選相對(duì)于親本植物具有增加頻率的無融合生殖種子結(jié)實(shí)的F2或雙雜交后代。
30權(quán)利要求29的方法，還包括重復(fù)步驟(f)至少一次以獲得更高的繁殖世代，并從該更高世代的植物中篩選相對(duì)于親本植物而言具有增加頻率的無融合生殖種子結(jié)實(shí)的植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及有花植物(被子植物)中雜種優(yōu)勢(shì)和其它性狀通過無融合生殖(無性種子形成)方式從種子到種子的保持。更具體地，涉及用于從有性或兼性無融合生殖植物產(chǎn)生如下后代植物的可預(yù)測(cè)方法，所述后代植物表達(dá)增加百分比的無融合生殖種子結(jié)實(shí)或一種或多種無融合生殖元素。本發(fā)明使用植物細(xì)胞胚胎學(xué)方法鑒定和選擇就大孢子發(fā)生(雌性減數(shù)分裂)、胚囊形成、卵和中央細(xì)胞形成和成熟、受精、胚形成和胚乳形成的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間而言具有適當(dāng)遺傳變異性的植物或一組植物；植物育種方法產(chǎn)生許多不同的、早至晚世代的、遺傳重組后代，從而使得胚囊形成優(yōu)先于大孢子發(fā)生、胚胎形成優(yōu)先于受精；和植物細(xì)胞胚胎學(xué)或后代檢驗(yàn)法選擇表達(dá)增加頻率的一種或多種無融合生殖元素的分離后代。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1984557SQ200480031102
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月22日
發(fā)明者J·G·卡曼 申請(qǐng)人:猶他州大學(xué)