專利名稱：一種或多種氨基酸的水平增加的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明要求以2003年5月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/468,727作為優(yōu)先權(quán)，在此通過(guò)引用的方式將該申請(qǐng)包括于本文內(nèi)。
本發(fā)明的領(lǐng)域是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)。更具體地，本發(fā)明涉及增加植物內(nèi)氨基酸水平的生物技術(shù)方法。
很多種重要的作物，包括大豆和玉米，都沒(méi)有含有足夠數(shù)量或達(dá)到正確平衡的使得營(yíng)養(yǎng)完善的若干種氨基酸。對(duì)于帶支鏈的氨基酸(Branched Chained amino acids，BCAA)亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸來(lái)說(shuō)尤其如是。BCAA是必要的氨基酸，因?yàn)槿祟?lèi)不能合成這些分子，因此必須從膳食中獲取。異亮氨酸是合成自蘇氨酸的帶支鏈氨基酸。蘇氨酸自身又是從天冬氨酸合成來(lái)的。天冬氨酸和BCAA之間的合成路徑涉及到若干種酶，所述的酶受到若干種氨基酸的變構(gòu)抑制。在對(duì)BCAA的合成中使用的酶包括天冬氨酸激酶(AK)、雙功能天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶(AK-HSDH)、異丙基蘋(píng)果酸合酶、蘇氨酸脫氨酶(TD)以及乙酰羥酸合酶(AHAS)。具體而言，蘇氨酸脫氨酶(EC 4.2.1.16)(TD，蘇氨酸脫水酶；L-蘇氨酸水解酶(脫氨基))和乙酰羥酸合酶(AHAS；乙酰乳酸合酶(EC 4.1.3.18))是BCAA生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。
在E.coli中，蘇氨酸脫氨酶以單獨(dú)的生物合成形式和生物降解形式存在。蘇氨酸脫氨酶的生物合成形式是基因ilvA編碼的，其催化植物和微生物中帶支鏈氨基酸生物合成過(guò)程的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。該步驟使L-蘇氨酸脫水脫氨，利用吡哆醛5′-磷酸(PryP)產(chǎn)生2-氧丁酸。生物合成形式的蘇氨酸脫氨酶受到通過(guò)L-異亮氨酸進(jìn)行的變構(gòu)調(diào)節(jié)(Umbarger，Science，123848(1956)；Umbarger，Protein Science，11392(1992)；Changeux，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，26313(1961)；Monod et al.，J.Mol.Biol.，6306(1963))。若干種被去調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫氨酶在植物和細(xì)菌中都存在。見(jiàn)，F(xiàn)eldberg et al.，Eur.J.Biochem.，21438-446(1971)；Mourad et al.，Plant Phys.，10743-52(1995)；Fisher et al.，J.Bact.，1756605-6613(1993)；Taillonet al.，Gene，63245-252(1988)；Mckel et al.，Mol.Microbiol.，13833-842(1994)；Guillouet et al.，Appl Environ Microbiol.，653100-3107(1999)；Slater et al.，Nature Biotechnology，71011-1016(1999)。
與生物合成形式相反，蘇氨酸脫氨酶的生物降解形式會(huì)被AMP激活，其對(duì)L-異亮氨酸的反饋調(diào)控不敏感，其在含有高濃度氨基酸并且不含葡萄糖的培養(yǎng)基中以無(wú)氧方式產(chǎn)生。此外，在E.coli中，蘇氨酸脫氨酶的生物降解形式由單獨(dú)的基因(tdcB)編碼。
AHAS酶在大量生物中都是保守的，例如，細(xì)菌、酵母和植物(Singhet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，884572-4576(1991))。在E.coli和其它腸細(xì)菌中，AHAS是由分別被稱為ilvG和ilvM的兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成的異源四聚體蛋白質(zhì)(Weinstock et al.，J.Bacteriol.，1745560-6(1992))。該四聚體的全部酶活性都由大亞基提供。小亞基是酶的穩(wěn)定性和調(diào)控目的所需要的。在植物中，不同物種間的聚集情況是不同的。在一些植物中，例如Arabidopsis thaliana，AHAS酶是由單一結(jié)構(gòu)基因編碼的(Andersson et al.，Plant Cell Reports，22261-267(2003))，而在其它植物種中，例如煙草中，可能就有不止一個(gè)功能基因。和細(xì)菌一樣，植物的AHAS酶也是受到反饋抑制的。植物的AHAS酶是一些商業(yè)除草劑的目標(biāo)(U.S.專利6,727,414)。
在對(duì)作為一方面的亮氨酸和纈氨酸以及作為另一方面的異亮氨酸的水平進(jìn)行平衡的方面，AHAS發(fā)揮著重要的作用。AHAS對(duì)于驅(qū)動(dòng)丙酮酸向乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化是很重要的，乙酰乳酸是亮氨酸和纈氨酸的前體。AHAS還驅(qū)動(dòng)2-氧丁酸向乙酰羥基丁酸的轉(zhuǎn)化，后者是異亮氨酸的前體。因?yàn)锳HAS對(duì)于2-氧丁酸的底物優(yōu)先性高于丙酮酸，故而酶反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行異亮氨酸的生產(chǎn)。異亮氨酸的水平會(huì)受到異亮氨酸對(duì)TD的反饋抑制的控制，而AHAS受纈氨酸和亮氨酸的反饋抑制。亮氨酸的生產(chǎn)還受異丙基蘋(píng)果酸合成酶的反饋抑制。
BCAA的商業(yè)化生產(chǎn)可以通過(guò)直接從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中提取氨基酸來(lái)進(jìn)行。例如，異亮氨酸現(xiàn)在的生產(chǎn)水平小于每年400公噸，而對(duì)于異亮氨酸的需求卻在持續(xù)增長(zhǎng)。因此，為彌補(bǔ)經(jīng)過(guò)分離的BCAA的短缺，以及提供其更為經(jīng)濟(jì)的來(lái)源，人們需要對(duì)植物進(jìn)行工程改造，以使氨基酸合成水平提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括一種DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼對(duì)反饋不敏感的蘇氨酸脫氨酶的外源多核苷酸可操作地連接，第二個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼AHAS的外源多核苷酸可操作地連接。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼對(duì)反饋不敏感的蘇氨酸脫氨酶的外源多核苷酸可操作地連接，第二個(gè)表達(dá)盒包含AHAS的大亞基，第三個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼AHAS小亞基的外源多核苷酸可操作地連接。在一種實(shí)施方式中，啟動(dòng)子中的每個(gè)都是種子增強(qiáng)型(seedenhanced)啟動(dòng)子。在另一種實(shí)施方式中，啟動(dòng)子中的每個(gè)都選自以下所構(gòu)成的組napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP 88、增強(qiáng)的USP 88、Arcelin 5和Oleosin。在一種實(shí)施方式中，至少有兩種不同的種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，第一個(gè)盒包含編碼對(duì)反饋不敏感的蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸，其包含SEQ ID NO22。在一種實(shí)施方式中，該多核苷酸是SEQ ID NO22。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，第一個(gè)盒包含編碼蘇氨酸脫氨酶變異等位基因(variant allele)或其亞基的外源多核苷酸，所述變異等位基因或其亞基包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，編碼蘇氨酸脫氨酶變異等位基因的多核苷酸包含SEQ ID NO2。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，該多核苷酸是SEQ ID NO2。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，第一個(gè)盒還包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸，其與編碼蘇氨酸脫氨酶、蘇氨酸脫氨酶變異等位基因或其亞基的多核苷酸可操作地連接。
在另一種實(shí)施方式中，第二個(gè)表達(dá)盒包含編碼AHAS大亞基的多核苷酸。在一種實(shí)施方式中，編碼AHAS大亞基的多核苷酸包含SEQ IDNO16。在一種實(shí)施方式中，該多核苷酸是SEQ ID NO16。在又一種實(shí)施方式中，編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸與編碼AHAS大亞基的多核苷酸可操作地連接。在一種實(shí)施方式中，第三個(gè)表達(dá)盒包含編碼AHAS小亞基的多核苷酸。在另一種實(shí)施方式中，編碼AHAS小亞基的多核苷酸包含SEQ ID NO17。在一種實(shí)施方式中，該多核苷酸是SEQ ID NO17。在又一種實(shí)施方式中，編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸與編碼AHAS小亞基的多核苷酸可操作地連接。
在一個(gè)方面，DNA構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼對(duì)反饋不敏感的蘇氨酸脫氨酶的外源多核苷酸可操作地連接，第二個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼AHAS大亞基的外源多核苷酸可操作地連接。在另一個(gè)方面，啟動(dòng)子中的每個(gè)都是種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。在又一個(gè)方面，啟動(dòng)子中的每個(gè)都選自以下所構(gòu)成的組napin、7Salpha、7S alpha’、7S beta、USP 88、增強(qiáng)的USP 88、Arcelin 5和Oleosin。在另一個(gè)方面，構(gòu)建體中至少有兩種不同的種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。
在一種實(shí)施方式中，第一個(gè)盒包含編碼對(duì)反饋不敏感的蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸，其包含SEQ ID NO22。在一種實(shí)施方式中，該多核苷酸是SEQ ID NO22。在另一種實(shí)施方式中，第一個(gè)盒包含蘇氨酸脫氨酶變異等位基因，其包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。在另一種實(shí)施方式中，編碼蘇氨酸脫氨酶變異等位基因的多核苷酸包含SEQ ID NO2，其包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。在一種實(shí)施方式中，該多核苷酸是SEQ ID NO22。在本發(fā)明的一個(gè)方面，第一個(gè)盒包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸，其與編碼蘇氨酸脫氨酶的所述多核苷酸可操作地連接。在另一個(gè)方面，第二個(gè)表達(dá)盒包含編碼AHAS大亞基的多核苷酸。在又一個(gè)方面，編碼AHAS大亞基的多核苷酸包含SEQ ID NO16。在一種實(shí)施方式中，該多核苷酸是SEQ ID NO16。在再一個(gè)方面，編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸與編碼所述AHAS大亞基的所述多核苷酸可操作地連接。
在一種實(shí)施方式中，DNA構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼單體AHAS的外源多核苷酸可操作地連接。在另一種實(shí)施方式中，DNA構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼AHAS大亞基的外源多核苷酸可操作地連接，第二個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼AHAS小亞基的外源多核苷酸可操作地連接。在又一種實(shí)施方式中，啟動(dòng)子中的每個(gè)都是種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。在再一種實(shí)施方式中，啟動(dòng)子中的每個(gè)都選自如下所構(gòu)成的組napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP 88、增強(qiáng)的USP 88、Arcelin 5和Oleosin。在另一種實(shí)施方式中，至少有兩種不同的種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。在一種實(shí)施方式中，第一個(gè)盒包含AHAS的大亞基，其包含SEQ ID NO16。在一種實(shí)施方式中，該多核苷酸是SEQ ID NO16。在另一種實(shí)施方式中，第一個(gè)盒包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸，其與編碼所述AHAS的大亞基的所述多核苷酸可操作地連接。在另一種實(shí)施方式中，第二個(gè)盒包含編碼AHAS小亞基的多核苷酸。在另一種實(shí)施方式中，第二個(gè)盒包含編碼AHAS小亞基的多核苷酸，其包含SEQ ID NO17。在一種實(shí)施方式中，該多核苷酸是SEQ ID NO17。在另一種實(shí)施方式中，第二個(gè)盒包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸，其與編碼所述AHAS小亞基的所述多核苷酸可操作地連接。
本發(fā)明還提供了一種方法，用于制備種子中氨基酸水平增加的轉(zhuǎn)基因雙子葉植物，所述水平增加是相對(duì)來(lái)自相同植物物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子而言的，所述方法包括下述步驟a)向雙子葉植物的可再生(regenerable)細(xì)胞引入包含構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因，所述構(gòu)建體包含編碼對(duì)反饋不敏感的蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸；b)令所述可再生的細(xì)胞再生為雙子葉植物；c)從所述植物獲取種子；d)選出具有增加的氨基酸水平的一?；蚨嗔７N子，所述水平是相對(duì)來(lái)自相同植物物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子而言的；以及e)種植所述種子，其中，如果異亮氨酸以增加的水平存在，那么至少一種額外的氨基酸水平也被增加了。在一種實(shí)施方式中，所述雙子葉植物是大豆植物(soybeanplant)。在一種實(shí)施方式中，氨基酸的水平增加包含下述氨基酸的濃度增加a)Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種和Ile；或b)Arg、Asn、Asp、His、Met、Leu、Val、Gln、Tyr、Thr、Lys、Ala、Ser和Phe中的一種或多種。本發(fā)明包括由本方法制造的轉(zhuǎn)基因大豆植物。
本發(fā)明包括制備氨基酸含量增加的轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的方法，包括如下步驟a)向雙子葉植物的可再生細(xì)胞引入包含構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因，所述構(gòu)建體包含編碼單體AHAS的多核苷酸，或者所述構(gòu)建體包含編碼AHAS大亞基的多核苷酸和編碼AHAS小亞基的多核苷酸；b)令所述可再生的細(xì)胞再生為雙子葉植物；c)從所述植物獲取種子；d)選出具有增加的氨基酸水平的一粒或多粒種子，所述水平是相對(duì)來(lái)自相同植物物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子而言的；以及e)種植所述種子。在一種實(shí)施方式中，所述雙子葉植物是大豆植物或油菜(canola)植物。在一種實(shí)施方式中，氨基酸的水平增加包含Ser或Val的濃度增加。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包括由本方法制造的轉(zhuǎn)基因大豆植物。
本發(fā)明還包括從轉(zhuǎn)基因大豆制造的粗磨粉(meal)。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明種子的容器。本發(fā)明的植物的種子可被放置于容器中，例如，袋子中。本文中使用的容器是任何可以裝納上述種子的物體。優(yōu)選地，容器中含有超過(guò)大約1,000、大約5,000或者大約25,000粒種子，其中，所述種子中的至少大約10％、大約25％、大約50％、大約75％或者大約100％是本發(fā)明的種子。優(yōu)選地，當(dāng)本發(fā)明的種子是大豆的時(shí)候，所述容器優(yōu)選地是袋子，其中含有大約60磅或大約130,000粒豆子。
本發(fā)明還涉及從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或植物的部分(例如，種子)來(lái)生產(chǎn)的動(dòng)物或人類(lèi)的食物產(chǎn)品。此類(lèi)食物產(chǎn)品可以從，例如，谷粒、谷物粗粉(meal)、面粉、種子、谷物等來(lái)制備，包括從此類(lèi)物質(zhì)制備的中間產(chǎn)物。


圖1是質(zhì)粒pMON53905的限制性圖譜。
圖2是質(zhì)粒pMON25666的限制性圖譜。
圖3是質(zhì)粒pMON53910的限制性圖譜。
圖4是質(zhì)粒pMON53911的限制性圖譜。
圖5是質(zhì)粒pMON53912的限制性圖譜。
圖6通過(guò)提供野生型酶對(duì)蘇氨酸濃度的初始速度圖，展示了Arabidopsis的蘇氨酸脫氨酶(菱形符號(hào))和E.coli蘇氨酸脫氨酶(圓形符號(hào))的動(dòng)力學(xué)特性。
圖7提供了E.coli L481等位基因相對(duì)異亮氨酸濃度的酶活百分比圖。
圖8是質(zhì)粒pMON69657的限制性圖譜。
圖9是質(zhì)粒pMON69659的限制性圖譜。
圖10是質(zhì)粒pMON69660的限制性圖譜。
圖11是質(zhì)粒pMON69663的限制性圖譜。
圖12是質(zhì)粒pMON69664的限制性圖譜。
圖13是質(zhì)粒pMON58143的限制性圖譜。
圖14是質(zhì)粒pMON58138的限制性圖譜。
圖15是質(zhì)粒pMON58159的限制性圖譜。
圖16是質(zhì)粒pMON58162的限制性圖譜。
對(duì)核酸和肽序列的說(shuō)明SEQ ID NO1展示了野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO2展示了野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO3展示了在447位Phe取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列(Ilv219)。
SEQ ID NO4展示了在481位Phe取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列(Ilv466)。
SEQ ID NO5展示了在481位Tyr取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO6展示了在481位Pro取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO7展示了在481位Glu取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO8展示了在481位Thr取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO9展示了在481位Gln取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO10展示了在481位Ile取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO11展示了在481位Val取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO12展示了在481位Met取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO13展示了在481位Lys取代Leu的野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO14展示了在447位Phe取代Leu的L447F E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO15展示了在481位Phe取代Leu的L481F E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO16展示了ilvG AHAS大亞基的多核苷酸序列。
SEQ ID NO17展示了ilvM AHAS小亞基的多核苷酸序列。
SEQ ID NO18展示了ilvG 5’-片段的多核苷酸序列。
SEQ ID NO19展示了Arabidopsis SSUlA質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO20展示了ilvG 3’-片段的多核苷酸序列。
SEQ ID NO21展示了野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列變異體。
SEQ ID NO22展示了Arabidopsis OMR1蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，其基因組具有下述經(jīng)過(guò)分離的核酸，所述核酸編碼蘇氨酸脫氨酶(TD)或其亞基，包括具有酶功能的突變體和亞基。優(yōu)選地，此類(lèi)蘇氨酸脫氨酶或蘇氨酸脫氨酶亞基對(duì)游離L-異亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物造成的抑制具有抗性?；蛘?，另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了一種編碼蘇氨酸脫氨酶或其亞基的核酸，其表達(dá)方式使得植物中Ile含量和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的含量增加，不管天然和外源的蘇氨酸脫氨酶或其亞基的動(dòng)力學(xué)或抑制特性的不同或相同之處。例如，用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可使外源蘇氨酸脫氨酶在不同于天然酶所在之處的細(xì)胞區(qū)室內(nèi)優(yōu)勢(shì)表達(dá)。蘇氨酸脫氨酶或其亞基的表達(dá)可以將植物中Ile的水平以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的水平提高至超過(guò)不存在此類(lèi)表達(dá)時(shí)的水平。所述核酸還可以編碼異亮氨酸生物合成涉及到的其它酶，例如，天冬氨酸激酶、雙功能天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶或乙酰羥酸合酶。
本發(fā)明還涉及一種獲得植物的方法，所述植物能生產(chǎn)水平被提高的游離Ile以及水平被提高的Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種。此類(lèi)過(guò)量生產(chǎn)是經(jīng)過(guò)分離的編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸的引入和表達(dá)的結(jié)果。此外，天然的大豆蘇氨酸脫氨酶對(duì)L-異亮氨酸的反饋抑制是敏感的，并構(gòu)成了對(duì)生物合成途徑的調(diào)控位點(diǎn)。本發(fā)明提供的方法還可被用于通過(guò)將編碼對(duì)此類(lèi)反饋抑制具有抗性的蘇氨酸脫氨酶的核酸引入，在植物中生產(chǎn)水平被提高的游離Ile以及水平被提高的Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種。此類(lèi)編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸可被引入到一系列植物中，包括雙子葉植物(例如豆類(lèi))和單子葉植物(例如谷物)。
定義在本文上下文中，將使用大量的術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“經(jīng)過(guò)分離的核酸片段”在本文中都可互換使用。上述術(shù)語(yǔ)包括了核苷酸序列等。多核苷酸可以是雙鏈或單鏈的RNA或DNA聚合體，可選地，其含有合成的、非天然的或經(jīng)過(guò)改變的核苷酸堿基。以DNA聚合體形式出現(xiàn)的多核苷酸可以包含cDNA、基因組DNA、合成DNA或其混合物中的一種或多種片斷。
本文中使用的在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物、植物組織、植物部分或植物細(xì)胞中Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的“經(jīng)過(guò)改變的”水平是指比在相應(yīng)的未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物、植物組織、植物部分或植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的水平更高或更低。通常，Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的“經(jīng)過(guò)改變的”水平要高于在相應(yīng)的未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物、植物組織、植物部分或植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的水平。
術(shù)語(yǔ)“與……互補(bǔ)”在本文中被用于表示核酸鏈的序列可以與作為參照的多核苷酸序列的全部或一部分雜交。為解釋的目的舉個(gè)例子，核苷酸序列“TATAC”與參照序列5’-TATAC-3’具有100％的相同性(identity)，但其與參照序列5’-GTATA-3’100％互補(bǔ)。
術(shù)語(yǔ)“相應(yīng)”在本文中用于表示多核苷酸序列，例如核酸至少部分地與作為參照的多核苷酸序列的全部或一部分相同(不必要嚴(yán)格進(jìn)化相關(guān))。
本文中使用的“被去調(diào)節(jié)的酶”指已被修飾的酶，例如通過(guò)誘變、截短等進(jìn)行的，使得代謝物對(duì)該酶催化活性的反饋抑制程度被降低，從而在代謝物存在的情況下該酶能展示出比未經(jīng)修飾的酶更高的活性。
本文中與蘇氨酸脫氨酶相關(guān)的部分所用到的短語(yǔ)“其結(jié)構(gòu)域”包括了全長(zhǎng)蘇氨酸脫氨酶的結(jié)構(gòu)性或功能性片斷。結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域包括蘇氨酸脫氨酶內(nèi)部可被確認(rèn)的(identifiable)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域的例子包括alpha螺旋、beta片狀結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、底物或抑制劑結(jié)合位點(diǎn)等。功能性結(jié)構(gòu)域包括展現(xiàn)出可被確認(rèn)的功能的蘇氨酸脫氨酶片斷，例如異亮氨酸結(jié)合口袋、活性位點(diǎn)或底物或抑制劑結(jié)合位點(diǎn)。蘇氨酸脫氨酶的功能性結(jié)構(gòu)域包括蘇氨酸脫氨酶的能催化異亮氨酸生物合成途徑中一個(gè)步驟的部分。因此，功能性結(jié)構(gòu)域包括蘇氨酸脫氨酶的具有酶活性的片段和結(jié)構(gòu)域。蘇氨酸脫氨酶的突變體結(jié)構(gòu)域也被包括進(jìn)來(lái)。用于制造突變體結(jié)構(gòu)域的野生型蘇氨酸脫氨酶核酸包括，例如，任何編碼來(lái)自大腸桿菌(Escherichia coli)、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌(Salmonella typhimurium)或擬南芥(Arabidopsis thaliana)的蘇氨酸脫氨酶結(jié)構(gòu)域的核酸。
本文中使用的“外源”蘇氨酸脫氨酶是由已經(jīng)被引入到宿主細(xì)胞中的經(jīng)過(guò)分離的核酸編碼的蘇氨酸脫氨酶。此類(lèi)“外源”蘇氨酸脫氨酶通常與天然的、未經(jīng)轉(zhuǎn)化狀態(tài)的該細(xì)胞中存在的任何DNA序列都不相同。“內(nèi)源”或“天然”蘇氨酸脫氨酶是天然存在于宿主細(xì)胞或生物中的蘇氨酸脫氨酶。
在本文中，植物細(xì)胞、植物組織、植物部分或植物中游離Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的“增加的”或“被提高的”水平是未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物部分或植物(即，其基因組未被外源蘇氨酸脫氨酶核酸或其結(jié)構(gòu)域的存在而改造)中發(fā)現(xiàn)的水平的大約2至100倍的水平，優(yōu)選為大約5至50倍，更優(yōu)選為大約10-30倍。例如，用經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物種子中游離Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的水平與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的親本植物種子或與嵌合(chimeric)植物未經(jīng)轉(zhuǎn)化的種子中它們的水平相比。在植物中發(fā)現(xiàn)并在本發(fā)明中有所描述的若干種氨基酸的名稱、三字母和單字母縮寫(xiě)以及對(duì)其進(jìn)行編碼的DNA密碼子都列于表1中。
表1.在植物中發(fā)現(xiàn)的若干種氨基酸的名稱、三字母和單字母縮寫(xiě)以及對(duì)其進(jìn)行編碼的DNA密碼子

編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸以及編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽(transit peptide)或標(biāo)記/報(bào)道基因的核酸是“經(jīng)過(guò)分離的”，因?yàn)樗鼈儊?lái)自其天然來(lái)源，已不再處于它們通常存在的細(xì)胞中。此類(lèi)經(jīng)過(guò)分離的核酸可以經(jīng)過(guò)了至少部分在體外的制備或操作，例如，從它們通常被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞中將其分離出來(lái)，對(duì)其進(jìn)行純化和擴(kuò)增。當(dāng)與外源核酸組合起來(lái)的情況下，此類(lèi)經(jīng)過(guò)分離的核酸還可以是“重組的”。例如，重組DNA可以是與外源啟動(dòng)子或?qū)τ谶x用的宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是內(nèi)源的啟動(dòng)子可操作地連接的經(jīng)過(guò)分離的DNA。
本文中使用的“天然(native)”基因或核酸表示該基因或核酸沒(méi)有經(jīng)過(guò)體外的改變或操作，即，其是沒(méi)有經(jīng)過(guò)過(guò)體外分離、純化、擴(kuò)增或突變的“野生型”基因或核酸。
術(shù)語(yǔ)“質(zhì)體”指一類(lèi)植物細(xì)胞的細(xì)胞器，其包括造粉體、葉綠體、有色體、造油體、eoplast、白色質(zhì)體(etioplast)、白色體和前質(zhì)體。上述細(xì)胞器是自主復(fù)制的，并含有通常被稱為“質(zhì)體基因組”的環(huán)狀DNA分子，其大小在大約120至大約217kb的范圍內(nèi)，具體取決于植物的種類(lèi)，并且，其通常含有反向重復(fù)區(qū)域。
本文中使用的“多肽”指全部通過(guò)肽鍵連接到一起的氨基酸的連續(xù)的鏈，只除了分別具有氨基和羧基的N-末端和C-末端氨基酸之外，它們并不以肽鍵相連。多肽可以是任何長(zhǎng)度的，并可被轉(zhuǎn)錄后修飾，例如，通過(guò)糖基化或磷酸化進(jìn)行的修飾。
本文中使用的“對(duì)異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物的抑制具有抗性或耐受性的”植物細(xì)胞、植物組織或植物是下述植物細(xì)胞、植物組織或植物其中，L-異亮氨酸或L-異亮氨酸的類(lèi)似物存在的情況下，保留的蘇氨酸脫氨酶活性比相應(yīng)的野生型蘇氨酸脫氨酶要多至少大約10％。通常，“對(duì)異亮氨酸的抑制具有抗性或耐受性的”植物細(xì)胞、植物組織或植物可在存在一定量異亮氨酸氨基酸類(lèi)似物的環(huán)境下生長(zhǎng)，所述異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物的量通常會(huì)抑制未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織或植物的生長(zhǎng)，這是通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定的。例如，用編碼對(duì)異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物具有充分的抗性或耐受性的蘇氨酸脫氨酶的DNA分子去轉(zhuǎn)化純合回交轉(zhuǎn)化過(guò)的近交植物，得到的植物能在會(huì)對(duì)相應(yīng)的(即高度同基因的)再生的近交植物生長(zhǎng)造成抑制的量的異亮氨酸氨基酸類(lèi)似物的環(huán)境下生長(zhǎng)。
本文中使用的“對(duì)異亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物的抑制具有抗性或耐受性的”蘇氨酸脫氨酶是下述蘇氨酸脫氨酶當(dāng)所述具有耐受性/抗性的蘇氨酸脫氨酶和野生型蘇氨酸脫氨酶暴露給同等量的異亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物時(shí)，所述具有耐受性/抗性的蘇氨酸脫氨酶保留的活性要比相應(yīng)的“野生型”或天然的敏感型蘇氨酸脫氨酶多大約10％以上。優(yōu)選地，所述具有抗性或耐受性的蘇氨酸脫氨酶保留的活性比比相應(yīng)的“野生型”或天然的敏感型蘇氨酸脫氨酶多大約20％以上。
一般性概念預(yù)先選出來(lái)的蘇氨酸脫氨酶核酸必須首先經(jīng)過(guò)分離，并且，如果不是植物來(lái)源的話，在體外被修飾，以包括進(jìn)在植物細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)所需要的調(diào)控信號(hào)。該外源基因可被修飾，以加入編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的序列，以將基因產(chǎn)物引導(dǎo)到上述細(xì)胞器中。
為改變Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的生物合成，編碼具有抗性的蘇氨酸脫氨酶的核酸(“基因”)必須被直接或間接引入到植物細(xì)胞中，并對(duì)上述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。該基因可被穩(wěn)定地包括進(jìn)植物細(xì)胞的基因組中?；虻霓D(zhuǎn)錄信號(hào)應(yīng)能被植物細(xì)胞識(shí)別，并可在植物細(xì)胞中具有功能。這意味著，該基因必須被轉(zhuǎn)錄為信使RNA，mRNA在植物細(xì)胞核中必須是穩(wěn)定的，可被完整地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯。該基因可以具有合適的翻譯信號(hào)以被植物細(xì)胞核糖體識(shí)別并對(duì)其進(jìn)行正確的翻譯。多肽基因產(chǎn)物必須避開(kāi)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯著的蛋白水解攻擊，并能具有賦予酶活性的三維構(gòu)象。蘇氨酸脫氨酶還可以進(jìn)一步地作用于異亮氨酸及其衍生物的生物合成過(guò)程中；這意味著，其可定位于催化生物合成(假設(shè)在質(zhì)體中)側(cè)翼步驟的天然植物酶附近，以獲得需要的底物，以及傳遞適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物。
即使上述所有條件都能達(dá)到，對(duì)Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種成功地過(guò)量生產(chǎn)也并非可以預(yù)見(jiàn)的事情。這需要沒(méi)有能對(duì)蘇氨酸脫氨酶步驟調(diào)控的減少進(jìn)行補(bǔ)償?shù)钠渌刂茩C(jī)制存在。這意味著不僅不存在其它對(duì)生物合成的抑制，也不存在能使積累的氨基酸被破壞的速率增加的機(jī)制。Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種必須以不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒性的水平被過(guò)量生產(chǎn)。最后，被引入的特性應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的、可遺傳的，以允許進(jìn)行商業(yè)發(fā)展和應(yīng)用。
對(duì)編碼蘇氨酸脫氨酶的多核酸分子的分離和鑒定可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸進(jìn)行鑒定和分離，如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，NY(2001)所述。編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸可來(lái)自任何原核或真核物種。例如，可通過(guò)對(duì)來(lái)自任何物種的基因組DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，或通過(guò)對(duì)由來(lái)自特定細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞系、原代細(xì)胞(primarycell)或組織的核酸制得的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，來(lái)鑒定出編碼蘇氨酸脫氨酶或其亞基的核酸。可用于鑒定和分離蘇氨酸脫氨酶的文庫(kù)的例子包括但不限于，來(lái)自A.tumefaciens菌株A348、玉米近交系B73的cDNA文庫(kù)(Stratagene，La Jolla，California，Cat.#937005，Clontech，Palo Alto，California，Cat.#FL1032a，#FL1032b和FL1032n)，來(lái)自玉米近交系Mo17的基因組文庫(kù)(Stratagene，Cat.#946102)，來(lái)自玉米近交系B73的基因組文庫(kù)(Clontech，Cat.#FL1032d)，或來(lái)自Escherichia coli或Salmonella typhimurium的便利菌株的基因組文庫(kù)。
可用于實(shí)施本發(fā)明的蘇氨酸脫氨酶多核苷酸或多肽分子的例子被描述于表2中。E.coli野生型蘇氨酸脫氨酶基因(ilvA)(SEQ ID NO1；gi146450，號(hào)碼K03503，版本K03503.1)及其相應(yīng)的多肽序列(SEQ ID NO2)或編碼SEQ ID NO21的變異等位基因是獲得下表2所述的所有其它突變等位基因的基礎(chǔ)基因。
具有與上述蘇氨酸脫氨酶核酸分子相關(guān)的序列的核酸可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法獲得，包括克隆或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，所述PCR中使用與本文提供的蘇氨酸脫氨酶序列區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸引物。經(jīng)過(guò)分離的蘇氨酸脫氨酶核酸的序列可通過(guò)雜交、部分序列分析或通過(guò)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)來(lái)驗(yàn)證。
表2.突變等位基因中E.coli ilv蘇氨酸脫氨酶的氨基酸取代情況

對(duì)編碼蘇氨酸脫氨酶序列的全部或部分的DNA片段的篩選可以通過(guò)PCR來(lái)進(jìn)行，或者通過(guò)雜交手段對(duì)來(lái)自基因組或cDNA文庫(kù)的噬菌斑進(jìn)行篩選來(lái)進(jìn)行。探針可來(lái)自從本文提供的核酸獲得的蘇氨酸脫氨酶基因，或者來(lái)自其它生物?；蛘?，可針對(duì)其與能與蘇氨酸脫氨酶特異性結(jié)合的抗體的結(jié)合，對(duì)來(lái)自cDNA表達(dá)文庫(kù)的噬菌斑進(jìn)行篩選。能與來(lái)自其它生物的蘇氨酸脫氨酶探針雜交的DNA片段和/或攜帶與蘇氨酸脫氨酶抗體具有免疫反應(yīng)的DNA片段的噬菌斑，可被亞克隆進(jìn)載體并被測(cè)序，和/或用作探針，對(duì)編碼目標(biāo)蘇氨酸脫氨酶基因的全部或部分的其它c(diǎn)DNA或基因組序列進(jìn)行鑒定。
cDNA文庫(kù)可通過(guò)下述方法來(lái)制備分離mRNA，產(chǎn)生cDNA，將cDNA插入到合適的載體中?？捎脤?duì)蘇氨酸脫氨酶具有特異性的抗體或探針對(duì)含有cDNA片段的文庫(kù)進(jìn)行篩選。編碼蘇氨酸脫氨酶基因的一部分的DNA片段可被亞克隆，并被測(cè)序，以及用作為探針，以對(duì)基因組蘇氨酸脫氨酶核酸進(jìn)行鑒定。通過(guò)測(cè)定與其它已知蘇氨酸脫氨酶基因的同源性，或通過(guò)與蘇氨酸脫氨酶特異性信使RNA雜交，可對(duì)編碼原核或真核蘇氨酸脫氨酶的一部分的DNA片段進(jìn)行驗(yàn)證。一旦獲得了編碼蘇氨酸脫氨酶5’末端部分、中間部分和3’末端部分的cDNA片段，就可將它們用作為探針，以從基因組文庫(kù)鑒定和克隆出蘇氨酸脫氨酶基因的完整基因組拷貝。
可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或通過(guò)對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選，分離出蘇氨酸脫氨酶基因的單個(gè)或多個(gè)基因組拷貝的部分。陽(yáng)性克隆可被測(cè)序，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)基因的5’末端進(jìn)行鑒定，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括對(duì)其它蘇氨酸脫氨酶基因的核酸同源性或通過(guò)RNAase保護(hù)分析來(lái)進(jìn)行，如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989和2001)所述。對(duì)目標(biāo)基因的3’和5’末端的定位還可用已知的蘇氨酸脫氨酶編碼區(qū)域，通過(guò)對(duì)基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索來(lái)進(jìn)行。一旦鑒定出了基因的部分，就可用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得蘇氨酸脫氨酶基因的完整拷貝，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括克隆或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成，其中使用與該基因的5’或3’末端核酸互補(bǔ)的寡核苷酸引物?？梢酝ㄟ^(guò)雜交、部分序列分析或通過(guò)蘇氨酸脫氨酶表達(dá)，來(lái)驗(yàn)證蘇氨酸脫氨酶基因的經(jīng)過(guò)分離的全長(zhǎng)拷貝的存在。
下述突變體是想要的，所述突變體蘇氨酸脫氨酶活性增加，對(duì)異亮氨酸或其類(lèi)似物導(dǎo)致的反饋抑制的敏感性降低，和/或能夠在植物中生產(chǎn)出數(shù)量增加的Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種以及Ile。上述突變體可以具有其所展示的活性的類(lèi)型或水平上的功能性變化，一些時(shí)候被稱為野生型蘇氨酸脫氨酶核酸和多肽的“衍生物”。
然而，本發(fā)明還涉及帶有“沉默”突變的蘇氨酸脫氨酶核酸以及蘇氨酸脫氨酶變異體。本文中使用的沉默突變是指改變了蘇氨酸脫氨酶的核苷酸序列但不會(huì)導(dǎo)致所編碼的蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列有所改變的突變。變異體蘇氨酸脫氨酶是由突變核酸編碼的，所述變異體較之相應(yīng)的野生型蘇氨酸脫氨酶，具有一種或多種不會(huì)對(duì)蘇氨酸脫氨酶活性造成顯著改變的氨基酸改變。本發(fā)明涉及所有此類(lèi)衍生物、變異體和帶有沉默突變的蘇氨酸脫氨酶核酸。
可以通過(guò)多種方法來(lái)獲得編碼經(jīng)過(guò)突變的蘇氨酸脫氨酶的DNA，所述蘇氨酸脫氨酶對(duì)L-異亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物具有抗性和/或耐受性。所述方法包括但不限于1.自發(fā)變異以及在培養(yǎng)物中進(jìn)行直接的突變體篩選；
2.對(duì)植物或組織、種子或任何細(xì)胞類(lèi)型的組織培養(yǎng)物進(jìn)行直接或間接誘變的方法；3.對(duì)克隆得到的蘇氨酸脫氨酶基因進(jìn)行突變，其中使用的方法例如，化學(xué)誘變；位點(diǎn)特異性或定點(diǎn)誘變(Sambrook et al.，如前所述)；轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的誘變(Berg et al.，Biotechnology，1417(1983))以及缺失突變(Mitra et al.，Molec.Gen.Genetic.，215294(1989))。
4.對(duì)關(guān)鍵殘基的突變進(jìn)行合理設(shè)計(jì)；以及5.DNA改組(DNA shuffling)，以將感興趣的突變包含進(jìn)若干種蘇氨酸脫氨酶核酸。
例如，來(lái)自可獲得的蘇氨酸脫氨酶蛋白質(zhì)的遺傳和/或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息可被用于對(duì)蘇氨酸脫氨酶突變體進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)，所述突變體具有增加的活性或者減少的對(duì)異亮氨酸或異亮氨酸類(lèi)似物的敏感性的可能性很高。此類(lèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息是可獲得的，例如，對(duì)E.coli蘇氨酸脫氨酶的(Gallagher et al.，Structure，6465-475(1998))。對(duì)突變的合理設(shè)計(jì)可通過(guò)將選出的蘇氨酸脫氨酶氨基酸序列與來(lái)自已知結(jié)構(gòu)的(例如，E.coli)蘇氨酸脫氨酶的蘇氨酸脫氨酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)來(lái)進(jìn)行。結(jié)合對(duì)結(jié)構(gòu)信息和序列同源性的了解，可對(duì)蘇氨酸脫氨酶蛋白質(zhì)的異亮氨酸結(jié)合和催化區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。例如，異亮氨酸結(jié)合口袋中的殘基可被確定為下述突變的可能候選者，所述突變是用于改變酶對(duì)異亮氨酸反饋抑制抗性的。使用此類(lèi)結(jié)構(gòu)信息，可在異亮氨酸結(jié)合所涉及到的位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域中，合理設(shè)計(jì)出若干種E.coli蘇氨酸脫氨酶突變體。更具體地，對(duì)于用于制造對(duì)異亮氨酸反饋抑制具有更少敏感性的活性蘇氨酸脫氨酶的突變而言，與E.coli蘇氨酸脫氨酶中L481類(lèi)似的氨基酸可能是有用的殘基。本發(fā)明涉及在任何上述位置的任何氨基酸取代或插入?；蛘?，上述任何位置的氨基酸可被缺失以及被取代。
定點(diǎn)誘變可被用于制造一系列位點(diǎn)上的氨基酸取代、缺失以及插入。在Escherichia coli蘇氨酸脫氨酶編碼區(qū)域中制造的特定突變的例子包括如下突變?cè)?47位附近用Phe替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO3)；在481位附近用Phe替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO4)；在481位附近用Tyr替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO5)；
在481位附近用Pro替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO6)；在481位附近用Glu替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO7)；在481位附近用Thr替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO8)；在481位附近用Gln替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO9)；在481位附近用Ile替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO10)；在481位附近用Val替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO11)；在481位附近用Met替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO12)；或在481位附近用Lys替換Leu(見(jiàn)，例如SEQ ID NO13)；通過(guò)對(duì)將被突變的蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列與E.coli蘇氨酸脫氨酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，可在任何蘇氨酸脫氨酶的類(lèi)似位置進(jìn)行相似的突變。可用于進(jìn)行比對(duì)的E.coli蘇氨酸脫氨酶氨基酸序列的例子是SEQ ID NO1。
還可以通過(guò)經(jīng)典的誘變和遺傳選擇來(lái)鑒定出有用的突變體?？赏ㄟ^(guò)將酶暴露給游離L-異亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物，對(duì)基因編碼的酶的活性進(jìn)行探測(cè)，或者通過(guò)使用限制性酶圖譜或DNA序列分析對(duì)DNA分子的變化進(jìn)行探測(cè)，來(lái)探測(cè)功能性改變。
例如，可從對(duì)異亮氨酸類(lèi)似物耐受的細(xì)胞系中分離出編碼對(duì)異亮氨酸充分耐受的蘇氨酸脫氨酶的基因。簡(jiǎn)言之，在連續(xù)暴露給低水平異亮氨酸類(lèi)似物的情況下，對(duì)部分分化的植物細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行生長(zhǎng)和傳代培養(yǎng)。然后在若干傳代培養(yǎng)間隔上逐漸增加異亮氨酸類(lèi)似物的濃度。存在類(lèi)似物的情況下，對(duì)在存在通常為毒性的水平的類(lèi)似物的情況下生長(zhǎng)的細(xì)胞或組織進(jìn)行重復(fù)傳代培養(yǎng)，并對(duì)其特征進(jìn)行分析。通過(guò)如下方法來(lái)分析被培養(yǎng)的細(xì)胞的耐受特性的穩(wěn)定性在不存在類(lèi)似物的情況下，對(duì)選出的細(xì)胞系進(jìn)行不同時(shí)間段的培養(yǎng)，然后分析將組織暴露給類(lèi)似物后的生長(zhǎng)情況。通過(guò)對(duì)在存在通常為毒性的(即，生長(zhǎng)抑制劑)水平的異亮氨酸類(lèi)似物的情況下具有酶活性的細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，選出依靠具有改變的蘇氨酸脫氨酶這一優(yōu)點(diǎn)從而具有耐受性的細(xì)胞系。
可用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如U.S.專利4581847中所述(通過(guò)引用將該文獻(xiàn)包括進(jìn)本文)，對(duì)從對(duì)異亮氨酸類(lèi)似物具有抗性的細(xì)胞系中克隆得到的蘇氨酸脫氨酶基因，進(jìn)行關(guān)于對(duì)同樣的或其它的氨基酸類(lèi)似物的耐受性的檢測(cè)。
具有對(duì)異亮氨酸類(lèi)似物敏感性降低的蘇氨酸脫氨酶的細(xì)胞系可被用于分離具有反饋抗性的蘇氨酸脫氨酶?？梢灾圃斐鰜?lái)自對(duì)異亮氨酸類(lèi)似物具有耐受性的細(xì)胞系的DNA文庫(kù)，通過(guò)與編碼蘇氨酸脫氨酶基因一部分的cDNA探針進(jìn)行雜交，可以鑒定出編碼蘇氨酸脫氨酶基因一部分或全部的DNA片段。通過(guò)克隆方法，或通過(guò)使用合適的引物進(jìn)行的PCR合成，可以獲得被改變的基因的完整拷貝。對(duì)編碼蘇氨酸脫氨酶的被改變的基因的分離可在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中被驗(yàn)證，這是通過(guò)如下方法進(jìn)行的測(cè)定正在表達(dá)的蘇氨酸脫氨酶在被暴露給通常為毒性的水平的異亮氨酸類(lèi)似物時(shí)是否保留有酶活性。例如，見(jiàn)，Anderson et al.，U.S.專利6,118,047。
為在選定的生物，例如選定的植物或其它類(lèi)型的宿主細(xì)胞中表達(dá)，本文提供的任何DNA分子的編碼區(qū)域可被最優(yōu)化。
在Gruys et al.的U.S專利5,492,660和5,958,745、Asrar et al.，U.S.專利6,091,002和6,228,623以及Slater et al.，Nature Biotechnology，171011(1999)中，也有對(duì)制造異亮氨酸去調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫氨酶變異體的描述。
轉(zhuǎn)基因(transgene)和載體一旦獲得及擴(kuò)增出編碼(例如)蘇氨酸脫氨酶或其結(jié)構(gòu)域的核酸，可將其可操作地連接到啟動(dòng)子上，以及，任選地，與其它元件相連，以形成轉(zhuǎn)基因。
大多數(shù)基因具有已知是啟動(dòng)子并會(huì)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的區(qū)域。典型地，在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中，啟動(dòng)子區(qū)域被發(fā)現(xiàn)于編碼序列的上游。啟動(dòng)子序列提供了對(duì)下游基因序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，并且，典型地，包括從大約50個(gè)至大約2000個(gè)核苷酸堿基對(duì)。啟動(dòng)子序列還含有調(diào)控序列，例如增強(qiáng)子序列，其可影響基因表達(dá)的水平。一些經(jīng)過(guò)分離的啟動(dòng)子序列可提供異源基因(即，與天然或同源基因不同的基因)的基因表達(dá)。還已知，啟動(dòng)子序列可以是強(qiáng)的或弱的或誘導(dǎo)型的。強(qiáng)啟動(dòng)子能提供高水平的基因表達(dá)，而弱啟動(dòng)子僅提供非常低水平的基因表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是下述類(lèi)型的啟動(dòng)子其應(yīng)答于外源加入的試劑或應(yīng)答于環(huán)境或發(fā)育刺激，允許開(kāi)啟或關(guān)閉基因表達(dá)。啟動(dòng)子還可提供組織特異性或發(fā)育調(diào)控。能提供足夠水平的基因表達(dá)，并能使得經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞易于被檢測(cè)到和被選擇的強(qiáng)啟動(dòng)子可能是有好處的。此外，如果需要的話，此類(lèi)強(qiáng)啟動(dòng)子可以提供高水平的基因表達(dá)。
在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因中的啟動(dòng)子可提供對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)，例如，由編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸表達(dá)蘇氨酸脫氨酶。優(yōu)選地，編碼序列被表達(dá)，使得植物細(xì)胞對(duì)游離L-異亮氨酸的反饋抑制的耐受性增加，從而使得細(xì)胞中Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種以及Ile的總含量增加。啟動(dòng)子還可以是誘導(dǎo)型的，從而可以通過(guò)外源加入的試劑來(lái)開(kāi)啟或關(guān)閉基因表達(dá)。將編碼區(qū)域與能在植物中提供組織特異性表達(dá)或發(fā)育調(diào)控基因表達(dá)的啟動(dòng)子組合起來(lái)，也有可能是令人期望的。
可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于病毒、質(zhì)體、細(xì)菌、細(xì)菌噬菌體或植物的啟動(dòng)子。有用的啟動(dòng)子包括CaMV 35S啟動(dòng)子(Odellet al.，Nature，313810(1985))，CaMV 19S(Lawton et al.，Plant Mol.Biol.，931F(1987))，nos(Ebert et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A.)，845745(1987))，Adh(Walker et al.，Proc.Nat.Acad.Sci(U.S.A.)，846624(1987))，蔗糖合酶(Yang et al.，Proc.Nat.Acad.Sci(U.S.A.)，874144(1990))、α-微管蛋白、napin、肌動(dòng)蛋白(Wang et al.，Mol.Cell.Biol.，123399(1992))、cab(Sullivan et al.，Mol.Gen.Genet.，215431(1989))PEPCase啟動(dòng)子(Hudspeth et al.，Plant Mol Biol.，12579(1989))，7Sα’球聚蛋白(conglycinin)啟動(dòng)子(Beachy et al.，EMBOJ.，43047(1985))，或者與R基因復(fù)合體相關(guān)的那些(Chandler et al.，The Plant Cell，11175(1989))。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子，例如大豆的7sα’、7sα、lea9、Arabidopsis perl和Brassica napusnapin。已考慮到，在本發(fā)明的實(shí)施中有用的其它啟動(dòng)子也是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的。
還可以使用質(zhì)體啟動(dòng)子。大多數(shù)質(zhì)體基因含有用于多亞基的質(zhì)體編碼的RNA聚合酶(PEP)以及單亞基的核編碼的RNA聚合酶的啟動(dòng)子。核編碼的聚合酶(NEP)啟動(dòng)子的共有序列和用于若干種天然質(zhì)體基因的特定啟動(dòng)子序列的列表可在Hajdukiewicz et al.，EMBO J.，164041-4048(1997)中找到，該文獻(xiàn)通過(guò)引用被全部包括進(jìn)本文。
可使用的質(zhì)體啟動(dòng)子的例子包括Zea mays質(zhì)體RRN(ZMRRN)啟動(dòng)子。當(dāng)存在有Arabidopsis thaliana質(zhì)體RNA聚合酶時(shí)，ZMRRN啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。類(lèi)似的可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子是Glycinemax質(zhì)體RRN(SOYRRN)和Nicotiana tabacum質(zhì)體RRN(NTRRN)啟動(dòng)子。上述全部三種啟動(dòng)子可被Arabidopsis質(zhì)體RNA聚合酶識(shí)別。RRN啟動(dòng)子的一般特征在U.S.專利6218145中有所描述。
此外，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或增強(qiáng)子的重復(fù)可被用于增加來(lái)自特定啟動(dòng)子的表達(dá)。此類(lèi)增強(qiáng)子的例子包括但不限于，來(lái)自CaMV 35S啟動(dòng)子和章魚(yú)堿合酶基因的元件(Last et al.，U.S.專利5290924)。例如，已想到，可對(duì)根據(jù)本發(fā)明來(lái)使用的載體進(jìn)行構(gòu)建，以包括進(jìn)ocs增強(qiáng)子元件。該元件最初是作為來(lái)自Agrobacterium的章魚(yú)堿合酶(ocs)基因的16bp的回文(palindromic)增強(qiáng)子被鑒定出來(lái)的(Ellis et al.，EMBOJ.，63203(1987))，其存在于至少10種其它的啟動(dòng)子中(Bouchez etal.，EMBO J.，84197(1989))。已提出，當(dāng)用于單子葉植物轉(zhuǎn)化時(shí)，使用增強(qiáng)子元件，例如ocs元件，特別是該元件的多個(gè)拷貝，能提高來(lái)自鄰近啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。包括但不限于根細(xì)胞啟動(dòng)子的組織特異性啟動(dòng)子(Conkling et al.，Plant Physiol.，931203(1990))和組織特異性增強(qiáng)子(Fromm et al.，The Plant Cell，1977(1989))，也被認(rèn)為是特別有用的，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如ABA-和膨脹-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等也是如此。
鑒于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列起點(diǎn)之間的DNA序列(即未被翻譯的引導(dǎo)序列)會(huì)影響基因表達(dá)，人們也可能希望使用特定的引導(dǎo)序列。優(yōu)選的引導(dǎo)序列被認(rèn)為會(huì)包括以下這些包括預(yù)計(jì)能引導(dǎo)所附基因的最佳表達(dá)的序列的那些，即包括可以增加或保持mRNA穩(wěn)定性并能防止翻譯被不恰當(dāng)起始的優(yōu)選的共有(consensus)引導(dǎo)序列(Joshi，Nucl.Acid Res.，156643(1987))。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地進(jìn)行對(duì)此類(lèi)序列的選擇。從在雙子葉植物特別是大豆中高度表達(dá)的基因獲得的序列是優(yōu)選的。
編碼目標(biāo)基因(即蘇氨酸脫氨酶)的核酸，還可包括質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，以協(xié)助將蘇氨酸脫氨酶多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體中，例如，葉綠體中。編碼選定的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸通常與蘇氨酸脫氨酶的編碼序列以框內(nèi)方式(in-frame)連接。但是，質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可置于蘇氨酸脫氨酶的N-末端或C-末端。
構(gòu)建體還將包括目標(biāo)核酸和位于3’末端的核酸，后者發(fā)揮信號(hào)作用，終止轉(zhuǎn)錄，并允許得到的mRNA發(fā)生聚腺苷化。3’元件的例子包括來(lái)自Agrobacterium tumefaciens章魚(yú)堿合酶基因的那些(Bevan etal.，Nucl.Acid Res.，11369(1983))、來(lái)自Agrobacterium tumefaciens章魚(yú)堿合酶基因的T7轉(zhuǎn)錄體的終止子以及來(lái)自馬鈴薯或西紅柿的蛋白酶抑制子I或抑制子II基因的3’端，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它3’元件也是可以考慮的。如果需要的話，還可以包括調(diào)控元件，例如Adh內(nèi)含子1(Callis et al.，Genes Develop.，11183(1987))、蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil et al.，Plant Physiol，915175(1989))或TMV omega元件(Galli et al.，The Plant Cell，1301(1989))?？梢园凑誂n，Methodsin Enzymology，153292(1987)所述，來(lái)獲得這些3’非翻譯調(diào)控序列，或者，上述序列已存在于可從商業(yè)來(lái)源獲得的質(zhì)粒中，例如從Clontech，Palo Alto，California獲得?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，將3’非翻譯調(diào)控序列與蘇氨酸脫氨酶基因的3’-末端可操作地連接。可用于本發(fā)明實(shí)施的其它此類(lèi)調(diào)控元件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可獲得可使用的。
選擇性標(biāo)志基因或報(bào)道基因也可用于本發(fā)明。此類(lèi)基因向表達(dá)該標(biāo)志基因的細(xì)胞賦予獨(dú)特的表型，因此使得此類(lèi)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能與不含有該標(biāo)志的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。選擇性標(biāo)志基因賦予了這樣一種特性人們可以通過(guò)化學(xué)方法，即通過(guò)使用選擇性試劑(例如，除草劑、抗生素等)來(lái)進(jìn)行“選擇”。報(bào)道基因或可篩選的基因則賦予一種特性，使得人們可以通過(guò)試驗(yàn)或觀察，即通過(guò)“篩選”來(lái)進(jìn)行鑒定(例如R-基因座特性)。當(dāng)然，合適的標(biāo)志基因的很多例子都是本領(lǐng)域已知的，并可被用于本發(fā)明的實(shí)施。
可能用于本發(fā)明的選擇性標(biāo)志包括但不限于，neo基因(Potrykus etal.，Mol.Gen.Genet.，199183(1985))，其編碼新霉素抗性，可使用新霉素、卡納霉素、G418等來(lái)進(jìn)行選擇；bar基因，其編碼雙丙胺膦(bialaphos)抗性；編碼經(jīng)過(guò)改變的EPSP合酶蛋白質(zhì)(Hinchee et al.，Biotech.，6915(1988))的基因，從而能帶來(lái)草甘膦抗性；腈水解酶基因，例如來(lái)自Klebsiella ozaenae的bxn，其能帶來(lái)對(duì)溴苯腈的抗性(Stalker et al.，Science，242419(1988))；突變體乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其能帶來(lái)對(duì)咪唑啉酮、磺酰脲類(lèi)或其它ALS抑制性化學(xué)物質(zhì)的抗性(EP 0154204)；甲氨喋呤抗性DHFR基因(Thillet et al.，J.Biol.Chem.，26312500(1988))；茅草枯脫鹵酶基因，其能帶來(lái)對(duì)殺蟲(chóng)劑茅草枯的抗性；或經(jīng)過(guò)突變的蘇氨酸脫氨酶基因，其能帶來(lái)對(duì)5-甲基異亮氨酸的抗性。當(dāng)使用突變體EPSP合酶基因時(shí)，合適的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽或葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)應(yīng)與EPSPS編碼區(qū)域融合。
在一種實(shí)施方式中，選擇性標(biāo)志對(duì)通常被稱為草甘膦的N-膦酰甲基-甘氨酸具有抗性。草甘膦能抑制可導(dǎo)致對(duì)芳香族化合物(包括氨基酸和維生素)進(jìn)行生物合成的莽草酸途徑。具體而言，草甘膦通過(guò)抑制5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP合酶或EPSPS)，抑制磷酸烯醇式丙酮酸和3-磷酸莽草酸向5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸的轉(zhuǎn)化。已經(jīng)顯示，可通過(guò)將生產(chǎn)更高水平的EPSP合酶(該酶優(yōu)選是耐草甘膦的)的能力引入到植物基因組中，來(lái)生產(chǎn)耐草甘膦的植物(Shah et al.，Science，233478-481(1986))。已分離出了對(duì)草甘膦具有耐受性的野生型EPSPS酶的變異體，所述耐受性是EPSPS氨基酸編碼序列被改變的結(jié)果。見(jiàn)Kishore et al.，Ann.Rev.Biochem.，57627-663(1988)；Schulz et al.，Arch.Microbiol.，137121-123(1984)；Sost et al.，F(xiàn)EBS Lett.，173238-241(1984)；Kishore et al.，F(xiàn)ed.Proc.，451506(1986)。
將編碼耐草甘膦EPSP合酶或草甘膦降解酶的核酸引入到植物中可使植物對(duì)草甘膦具有耐受性。制造耐草甘膦植物的方法是可獲得的，例如，在U.S.專利5776760和5627061以及WO 92/00377中，這幾篇文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用被包括進(jìn)本文中。
能用于對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行選擇的系統(tǒng)中的選擇性標(biāo)志基因的另一種闡述性的實(shí)施方式是編碼草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，例如來(lái)自Streptomyces hygroscopicus的bar基因或來(lái)自Streptomycesviridochromogenes的pat基因(U.S.專利5550318)。草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)能使除草劑雙丙胺膦、草銨膦(phosphinothricin，PPT)中的活性成分失活。PPT抑制谷氨酰胺合成酶(Murakami et al.，Mol.Gen.Genet.，20542(1986)；Twell et al.，Plant Physiol.，911270(1989))，導(dǎo)致氨的迅速積累，和細(xì)胞死亡。
可使用的可篩選標(biāo)志包括但不限于，β-葡萄糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，該基因編碼的酶已知有多種不同的顯色底物；R-座基因，其編碼對(duì)植物組織中花青素色素(紅色)的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)節(jié)的產(chǎn)物(Dellaporta et al.，in Chromosome Structure and Function，pp.263-282(1988))；β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe，Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A.)，753737(1978))，其編碼已知有多種不同顯色底物的酶(例如，PADAC，顯色頭孢霉素)；xylE基因(Zukowsky et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A.)，801101(1983))，其編碼兒茶酚脫氧酶，該酶可以轉(zhuǎn)化顯色兒茶酚；α-淀粉酶基因(Ikuta et al.，Biotech.，8241(1990))；酪氨酸酶基因(Katz et al.，J.Gen.Microbiol.，1292703(1983))，其編碼能將酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的酶，其接著再縮合，形成容易探測(cè)到的化合物黑色素；β-半乳糖苷酶基因，其編碼存在顯色底物的酶；熒光素酶(lux)基因(Ow et al.，Science，234856(1986))，其使得生物發(fā)光探測(cè)得以進(jìn)行；或者甚至是水母發(fā)光蛋白基因(Prasher et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1261259(1985))，其可被用于對(duì)鈣敏感的生物發(fā)光檢測(cè)，或者是綠色熒光蛋白基因(Niedz et al.，Plant Cell Reports，14403(1995))。使用，例如，X-射線膠片、閃爍計(jì)數(shù)、熒光光譜分析、低照度攝像機(jī)、光子計(jì)數(shù)攝影機(jī)或者多孔發(fā)光檢測(cè)，可探測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中l(wèi)ux基因的存在。還可以預(yù)見(jiàn)到，可對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)展，將其用于生物發(fā)光的種群篩選(population screening)，例如在組織培養(yǎng)板上，或者甚至用于整個(gè)植物的篩選。
此外，轉(zhuǎn)基因還可被構(gòu)建和被用于將基因產(chǎn)物靶向到植物細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)間隔，或者引導(dǎo)蛋白質(zhì)到細(xì)胞外環(huán)境。這通?？梢酝ㄟ^(guò)將編碼轉(zhuǎn)運(yùn)或信號(hào)肽序列的核酸與特定基因的編碼序列接合來(lái)得到。得到的轉(zhuǎn)運(yùn)或信號(hào)肽會(huì)將蛋白質(zhì)分別轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外目的地。在很多情況下，在協(xié)助蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞區(qū)室后，要去除轉(zhuǎn)運(yùn)或信號(hào)肽。轉(zhuǎn)運(yùn)或信號(hào)肽是通過(guò)協(xié)助蛋白質(zhì)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的膜來(lái)發(fā)揮作用的，例如，液泡、泡囊、質(zhì)體和線粒體膜，而信號(hào)肽引導(dǎo)蛋白質(zhì)通過(guò)細(xì)胞外的膜。通過(guò)協(xié)助蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)或外的區(qū)室中，上述序列可以增加基因的積累。
此類(lèi)用途的一個(gè)特定的例子涉及，將感興趣的基因，例如蘇氨酸脫氨酶引導(dǎo)到特定的細(xì)胞器中，例如質(zhì)體而非細(xì)胞質(zhì)。這可以通過(guò)對(duì)Arabidopsis SSU1A轉(zhuǎn)運(yùn)肽的使用來(lái)進(jìn)行例示，其使得蛋白質(zhì)能特異性地靶向到質(zhì)體。或者，轉(zhuǎn)基因可以包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸，或者編碼rbcS(RuBISCO)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸，其可操作地連接于啟動(dòng)子和編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸之間(參見(jiàn)，Heijne et al.，Eur.J.Biochem.，180535(1989)；Keegstra et al.，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，40471(1989))。如果轉(zhuǎn)基因要被引入到植物細(xì)胞中，該轉(zhuǎn)基因還可以含有植物的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號(hào)，以及翻譯信號(hào)，所述信號(hào)與植物蘇氨酸脫氨酶基因的3’-末端連接在一起。
外源質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以使用，其并非被編碼于天然植物蘇氨酸脫氨酶基因內(nèi)的。典型地，質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽為40至70個(gè)氨基酸長(zhǎng)，在翻譯后發(fā)揮作用，引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入質(zhì)體。可在進(jìn)入質(zhì)體以產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)的期間或緊接著進(jìn)入質(zhì)體之后，將轉(zhuǎn)運(yùn)肽切下來(lái)。編碼植物蘇氨酸脫氨酶的基因的完整拷貝可以含有質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。在這種情況下，就不必須將外源獲得的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列組合到轉(zhuǎn)基因中了。
外源質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列可從多種不同的植物核基因中獲得，只要基因產(chǎn)物作為包含氨基末端轉(zhuǎn)運(yùn)肽的前蛋白質(zhì)表達(dá)，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到選定的質(zhì)體中去。已知包括此類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的植物基因產(chǎn)物的例子包括但不限于，核糖體二磷酸羧化酶的小亞基、鐵氧還蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、核基因編碼的葉綠體核糖體蛋白、某些熱休克蛋白、氨基酸生物合成酶(例如，乙酰乳酸合酶、3-烯醇式丙酮酸磷酸莽草酸合酶、二氫二吡啶合酶(dihydrodipicolinate)等)?；蛘?，可以從轉(zhuǎn)運(yùn)肽的已知序列，例如，上文所列出的那些，整個(gè)或部分地對(duì)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA片段進(jìn)行化學(xué)合成。
不考慮編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA片段的來(lái)源，其應(yīng)當(dāng)包括翻譯起始密碼子，并能表達(dá)為可被宿主植物的質(zhì)體識(shí)別并能在其中正確發(fā)揮作用的氨基酸序列。還應(yīng)當(dāng)注意到轉(zhuǎn)運(yùn)肽和蘇氨酸脫氨酶之間連接處的氨基酸序列，在此進(jìn)行切割，以產(chǎn)生成熟的酶。某些保守的氨基酸序列已被鑒定出來(lái)，可用作為指導(dǎo)。編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列與蘇氨酸脫氨酶編碼區(qū)域的精確融合可能要求對(duì)其中一條或全部?jī)蓷l核酸進(jìn)行操作，以引入例如方便的限制性位點(diǎn)。這可以通過(guò)下述方法來(lái)完成，所述方法包括定點(diǎn)誘變、插入化學(xué)合成的寡核苷酸接頭等。
一旦獲得了質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，將其適當(dāng)?shù)剡B接到轉(zhuǎn)基因中的啟動(dòng)子和蘇氨酸脫氨酶編碼區(qū)域上。可構(gòu)建出或從商業(yè)來(lái)源獲得含有在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子并具有下游多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。用限制性酶，可將質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列插入到啟動(dòng)子的下游。然后，可將編碼蘇氨酸脫氨酶的區(qū)域插入到質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列3’-末端的緊鄰下游，并在其讀碼框內(nèi)，使得質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以翻譯的方式被融合到蘇氨酸脫氨酶的氨基末端。轉(zhuǎn)基因一旦形成，就可將其亞克隆到其它質(zhì)粒或載體中。
已考慮到，將基因產(chǎn)物靶向到植物細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室還可通過(guò)將基因直接運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室來(lái)獲得。例如，P.Maliga(CurrentOpinion in Plant Biology，5164-172(2002)；Heifetz(Biochimie，82655-666(2000))；Bock(J.Mol.Biol.，312425-438(2001))；andDaniell et al.，(Trends in Plant Science，784-91(2002))描述了植物的質(zhì)體轉(zhuǎn)化。
含有蘇氨酸脫氨酶基因和/或其它感興趣的基因的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建完成后，然后可將該盒引入到植物細(xì)胞中。將編碼蘇氨酸脫氨酶的DNA引入到植物細(xì)胞中，可以賦予其對(duì)異亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物的耐受性，并且改變植物細(xì)胞中的異亮氨酸含量，這取決于植物細(xì)胞的種類(lèi)、基因表達(dá)的水平以及該基因編碼的酶的活性。
表3中描述了被包括到本發(fā)明中的若干種構(gòu)建體。
表3.包括在本發(fā)明中的構(gòu)建體


使用核酸的組合本發(fā)明的一種實(shí)施方式涉及編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸與編碼AHAS(乙酰羥酸合酶)的E.Coli的ilvG和/或ilvM基因的組合。此類(lèi)乙酰羥酸合酶基因不受氨基酸反饋抑制，并且對(duì)作為底物的2-酮丁酸具有優(yōu)先性。在一種實(shí)施方式中，該活性被限制到單條融合多肽上。另一種實(shí)施方式涉及，對(duì)氨基酸不敏感的天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶(AK-HSDH)與蘇氨酸脫氨酶以及可能的與AHASII的組合。在一種實(shí)施方式中，來(lái)自S.marcescens的thrA1基因的突變體(Omori andKomatubara，J.Bact.，175959(1993))是AK-HSDH等位基因。上述核酸可以翻譯方式融合到質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽上。
AHAS酶已知存在于所有高等植物中，并且被發(fā)現(xiàn)于多種不同的微生物中，例如酵母Saccharomyces cerevisiae，以及腸細(xì)菌E.coli和Salmonella typhimurium(U.S.專利5731180)中。用于在大量上述物種中生產(chǎn)普通AHAS的遺傳基礎(chǔ)也已得到了很好的分析。例如，在E.coli和Salmonella typhimurium中，存在有AHAS的三種同工酶；其中兩種對(duì)除草劑敏感，而第三種不敏感。上述同工酶均具有一個(gè)大的和一個(gè)小的蛋白質(zhì)亞基；在圖譜上定位于IlvIH、IlvGM和IlvBN操縱子上。酵母中，已將單個(gè)AHAS同工酶定位到ILV2基因座上。在每種情況中，已鑒定出了敏感的和具有抗性的形式，若干等位基因的序列也已得到了測(cè)定(Friden et al.，Nucl. AcidRes.，133979-3998(1985)；Lawther etal.，PNAS USA，78922-928(1982)；Squires et al.，Nucl.Acids Res.，8115299-5313(1983)；Wek et al.，Nucl.Acids Res.，134011-4027(1985)；Falco and Dumas，Genetics，10921-35(1985)；Falco et al.，Nucl.Acids Res.，134011-4027(1985))。
在煙草中，AHAS的功能是由兩個(gè)不連鎖的基因，SuRA和SuRB編碼的。這兩個(gè)基因之間有高度相同性，表現(xiàn)在核苷酸水平和成熟蛋白質(zhì)的氨基酸水平上，雖然N-末端，推定的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的變化更大(Leeet al.，EMBO J.，71241-1248(1988))。另一方面，擬南芥具有單條AHAS基因，其已被完全測(cè)序(Mazur et al.，Plant Physiol.851110-1117(1987))。對(duì)高等植物中AHAS基因序列的比較顯示出該序列某些區(qū)域具有高水平的保守性；具體而言，至少有10個(gè)具有序列保守性的區(qū)域。以前已假設(shè)，這些保守區(qū)域?qū)γ傅墓δ軄?lái)說(shuō)是關(guān)鍵的，并且，功能的保留取決于充分的序列保守性。因此，本發(fā)明涉及AHAS在植物中的過(guò)量表達(dá)，以增加其中的Ile水平和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的水平。
天冬氨酸激酶(AK)是催化蘇氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸生物合成第一個(gè)步驟的酶。植物中，天冬氨酸家族的氨基酸的生物合成發(fā)生于質(zhì)體中(見(jiàn)，Bryan(1980)InThe Biochemistry ofPlants，Vol.5，B.Miflin(Ed.)Acedamic Press，NY，p.403)。以前已顯示，去調(diào)節(jié)的蘇氨酸過(guò)量表達(dá)能使游離L-蘇氨酸的細(xì)胞內(nèi)水平在葉片中增加55％(Shaul and Galili，Plant Physiol.，1001157(1992))，在種子中增加15倍(karchi et al.，Plant J.，3721(1993))。
野生型或被去調(diào)節(jié)的天冬氨酸激酶的過(guò)量表達(dá)將增加質(zhì)體中可用的游離蘇氨酸庫(kù)的量。當(dāng)組合有野生型、突變體或被去調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫氨酶時(shí)，被轉(zhuǎn)化成異亮氨酸的蘇氨酸的量會(huì)被增加。除天冬氨酸激酶(AK)之外，高絲氨酸脫氫酶(HSD)和蘇氨酸合酶也可被用于進(jìn)一步增加游離蘇氨酸的水平。
可用于本發(fā)明的被去調(diào)節(jié)的天冬氨酸激酶可以具有一定水平的蘇氨酸不敏感性，使得在存在0.1mM蘇氨酸時(shí)的天冬氨酸的Km濃度下，展示出的天冬氨酸激酶活性要比不存在蘇氨酸的試驗(yàn)條件下高10％?？捎糜诒景l(fā)明的被去調(diào)節(jié)的高絲氨酸脫氫酶優(yōu)選具有一定水平的蘇氨酸不敏感性，使得在0.1mM蘇氨酸和天冬氨酸半醛的Km濃度下，該酶展示出的活性要比不存在蘇氨酸的試驗(yàn)條件下高10％。天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的Vmax值可以在其相應(yīng)的野生型酶的0.1-100倍之間。天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的Km值可以在其相應(yīng)的野生型酶的0.01-10倍之間。
蘇氨酸合酶是參與磷酸高絲氨酸向蘇氨酸轉(zhuǎn)化的酶，其已顯示出在Methylobacillus glycogenes中過(guò)量表達(dá)時(shí)，能將蘇氨酸的水平相對(duì)內(nèi)源水平增加大約10倍(Motoyama et al.，Appl.Microbiol.Biotech.，4267(1994))。此外，在煙草細(xì)胞培養(yǎng)物中過(guò)量表達(dá)的E.coli蘇氨酸合酶使得從蘇氨酸合酶總活性的6倍增長(zhǎng)得到了蘇氨酸水平的10倍增長(zhǎng)(Muhitch，Plant Physiol.，108(2Suppl.)71(1995))。因此，本發(fā)明涉及蘇氨酸合酶在植物中的過(guò)量表達(dá)，以增加其中的蘇氨酸水平。這可以用于本發(fā)明，以確保蘇氨酸的供應(yīng)增加，用于蘇氨酸脫氨酶進(jìn)行的對(duì)Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的生產(chǎn)。
宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化包含目標(biāo)基因，例如蘇氨酸脫氨酶基因的轉(zhuǎn)基因可被亞克隆到已知的表達(dá)載體中，可對(duì)蘇氨酸脫氨酶的表達(dá)進(jìn)行探測(cè)和/或定量。該篩選方法可用于鑒定蘇氨酸脫氨酶基因的表達(dá)，以及蘇氨酸脫氨酶在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞質(zhì)體中的表達(dá)。
質(zhì)粒載體包括能提供如下功能的額外核酸，所述功能包括容易的篩選、擴(kuò)增以及將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化到原核和真核細(xì)胞中，所述載體例如pUC衍生載體，例如pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pUC23、pUC119和pUC120，pSK衍生載體、pGEM衍生載體，pSP衍生載體或pBS衍生載體。額外的核酸包括用于載體在細(xì)菌宿主中進(jìn)行自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、優(yōu)選編碼抗生素或除草劑抗性的選擇性標(biāo)志基因、提供用于插入轉(zhuǎn)基因中編碼的核酸或基因的多個(gè)位點(diǎn)的獨(dú)特的多克隆位點(diǎn)以及增強(qiáng)原核和真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的序列。
可用于在植物和原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的另一種載體是二元Ti質(zhì)粒(binary Ti plasmid)，如Schilperoort et al.，U.S.專利4940838所公開(kāi)的，載體pGA582是其例子。該二元Ti質(zhì)粒載體以前已由前文引用過(guò)的An進(jìn)行過(guò)表征。該二元Ti載體可在原核細(xì)菌，例如E.coli或Agrobacterium中進(jìn)行復(fù)制。Agrobacterium質(zhì)粒載體也可被用于將轉(zhuǎn)基因體轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞。二元Ti載體優(yōu)選包括胭脂堿T DNA右邊界和左邊界以提供有效的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化、選擇性標(biāo)志基因、T邊界區(qū)域的獨(dú)特的多克隆位點(diǎn)、colE1復(fù)制起點(diǎn)和廣宿主范圍的復(fù)制子。攜帶有本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的二元Ti載體可被用于轉(zhuǎn)化原核和真核細(xì)胞，但優(yōu)選用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，例如，見(jiàn)Glassman et al.，U.S.專利5258300。
然后可通過(guò)可獲得的方法將表達(dá)載體引入到原核或真核細(xì)胞中。對(duì)雙子葉植物特別有效的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于對(duì)未成熟胚的微粒轟擊(U.S.專利5990390)或II型胚胎發(fā)生愈傷組織細(xì)胞，如W.J.Gordon-Kamm et al.，Plant Cell，2603(1990)；M.E.Fromm et al.，Bio/Technology，8833(1990)；and D.A.Walters et al.，Plant MolecularBiology，18189(1992)所述；或者通過(guò)對(duì)I型胚胎發(fā)生愈傷組織的電穿孔，如D’Halluin et al.，The Plant Cell，41495(1992)所述，或如Krzyzek，U.S.專利5384253所述。通過(guò)與包裹有DNA的鎢晶須震蕩混合對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Coffee et al.，U.S.專利5302523)以及通過(guò)將細(xì)胞暴露給含有DNA的脂質(zhì)體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化也是可以使用的。
篩選過(guò)量生產(chǎn)異亮氨酸的細(xì)胞系的策略用組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)想要的對(duì)異亮氨酸類(lèi)似物具有抗性的過(guò)量生產(chǎn)異亮氨酸的變異體的有效篩選需要仔細(xì)確定篩選條件。上述條件被最優(yōu)化，以使得對(duì)異亮氨酸或異亮氨酸類(lèi)似物具有抗性的過(guò)量生產(chǎn)異亮氨酸的細(xì)胞能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和積累，而細(xì)胞群體大部分(bulk ofthe cell population)的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。群體中單個(gè)細(xì)胞的生存力高度依賴于鄰近細(xì)胞的生存力，這一事實(shí)將這種狀態(tài)變得復(fù)雜化。
將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露給異亮氨酸或異亮氨酸類(lèi)似物的條件是由化合物與組織之間的相互作用的特點(diǎn)來(lái)決定的。此類(lèi)因素，例如毒性程度以及抑制率應(yīng)當(dāng)被考慮。培養(yǎng)物中細(xì)胞對(duì)化合物的積累以及化合物在培養(yǎng)基和細(xì)胞中的持續(xù)性和穩(wěn)定性也需要被考慮。
對(duì)異亮氨酸或異亮氨酸類(lèi)似物對(duì)培養(yǎng)物生存力和形態(tài)的影響進(jìn)行仔細(xì)的評(píng)估。尤其重要的是，要選擇對(duì)培養(yǎng)物的植物再生能力沒(méi)有影響的類(lèi)似物暴露條件。對(duì)類(lèi)似物暴露條件的選擇還會(huì)受到類(lèi)似物會(huì)殺死細(xì)胞還是僅對(duì)細(xì)胞分裂加以抑制的影響。
對(duì)篩選方案的選擇取決于上述考慮。下文中簡(jiǎn)單描述的方案可被用于篩選過(guò)程。例如，為選出對(duì)異亮氨酸或其類(lèi)似物造成的生長(zhǎng)抑制具有抗性的細(xì)胞，將在液體懸浮培養(yǎng)物中被精細(xì)分開(kāi)的細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)暴露給高水平的異亮氨酸或其類(lèi)似物。然后回收或收集存活的細(xì)胞，隨后再將其暴露更長(zhǎng)的時(shí)間?；蛘撸谶B續(xù)暴露給最初為低水平的游離L-異亮氨酸或其類(lèi)似物的情況下，對(duì)有組織的部分分化的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行生長(zhǎng)和傳代培養(yǎng)。然后在若干傳代培養(yǎng)間隔上逐漸增加濃度。雖然上述方案可被用于篩選過(guò)程，但本發(fā)明并不局限于這些過(guò)程。
對(duì)具有抗性的細(xì)胞系的篩選和分析進(jìn)行篩選，直到回收到下述細(xì)胞或組織，所述細(xì)胞或組織能被觀察到在存在有通常會(huì)造成抑制的異亮氨酸類(lèi)似物水平的情況下，能生長(zhǎng)良好。在存在有一種或多種異亮氨酸類(lèi)似物的情況下，對(duì)上述細(xì)胞“系”進(jìn)行額外的若干次傳代培養(yǎng)，以除去沒(méi)有抗性的細(xì)胞，然后再進(jìn)行表征。通過(guò)在存在多種類(lèi)似物濃度的情況下，比較上述細(xì)胞系與未經(jīng)篩選的細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)情況，可以測(cè)定出已獲得的抗性的量。被培養(yǎng)的細(xì)胞的抗性特征的穩(wěn)定性可通過(guò)如下方式來(lái)評(píng)估在不存在類(lèi)似物的情況下，對(duì)選出的細(xì)胞系簡(jiǎn)單地進(jìn)行不同時(shí)間的培養(yǎng)，然后再將組織暴露給類(lèi)似物來(lái)分析生長(zhǎng)情況。還可以使用體外化學(xué)研究來(lái)評(píng)估具有抗性的細(xì)胞系，以驗(yàn)證類(lèi)似物反應(yīng)位點(diǎn)在蘇氨酸脫氨酶內(nèi)，和/或是否有突變形成以及形成了什么樣的突變來(lái)使得對(duì)異亮氨酸類(lèi)似物造成的抑制敏感度較低。
可在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中對(duì)蘇氨酸脫氨酶基因的瞬間(transient)表達(dá)進(jìn)行探測(cè)和定量?？梢酝ㄟ^(guò)反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析、定量Western印記分析(使用對(duì)被克隆的蘇氨酸脫氨酶具有特異性的抗體)或通過(guò)在存在異亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物的情況下對(duì)酶活進(jìn)行探測(cè)，來(lái)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量?？梢酝ㄟ^(guò)免疫化學(xué)染色方法(其中使用對(duì)被克隆的蘇氨酸脫氨酶具有特異性的抗體)或亞細(xì)胞分級(jí)分離，以及隨后的生化和/或免疫分析，來(lái)確定被克隆的蘇氨酸脫氨酶的組織和亞細(xì)胞定位。被克隆的蘇氨酸脫氨酶對(duì)試劑的敏感性也可被測(cè)定。然后，可以使用提供蘇氨酸脫氨酶或?qū)τ坞xL-異亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物造成的抑制具有耐受性的蘇氨酸脫氨酶的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因來(lái)轉(zhuǎn)化單子葉和/或雙子葉植物組織細(xì)胞并使轉(zhuǎn)化的植物和種子再生?？舍槍?duì)選擇性標(biāo)志基因或報(bào)道基因的存在來(lái)對(duì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行篩選，例如通過(guò)除草劑抗性來(lái)進(jìn)行?？梢允褂脤?duì)被克隆的蘇氨酸脫氨酶具有特異性的抗體，或者通過(guò)RT-PCR分析，在轉(zhuǎn)基因胚胎產(chǎn)生愈傷組織中對(duì)蘇氨酸脫氨酶基因的瞬間表達(dá)進(jìn)行探測(cè)。
用于植物修飾的基因如前文所述，作為選擇性標(biāo)志基因和報(bào)道基因發(fā)揮作用的基因在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因、載體和植物中，可與編碼蘇氨酸脫氨酶或其結(jié)構(gòu)域的核酸可操作地組合。此外，還可向本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因、載體和植物加入其它農(nóng)藝學(xué)特性。此類(lèi)特性包括但不限于，昆蟲(chóng)抗性或耐受性；疾病抗性或耐受性(病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲(chóng))；脅迫抗性或耐受性，其例子包括對(duì)干旱、熱、寒冷、冰凍、過(guò)于潮濕、鹽脅迫、氧化脅迫的抗性或耐受性；增加的產(chǎn)量；食物含量和組成；物理外觀；雄性不育；干化(drydown)；可站立性(standability)；豐產(chǎn)性；淀粉性質(zhì)；油的數(shù)量和質(zhì)量等?？蓪⒁环N或多種帶有上述特性的基因插入到本發(fā)明的植物中。
對(duì)環(huán)境或脅迫的抗性或耐受性可通過(guò)基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)植物對(duì)多種環(huán)境脅迫耐受能力的提高。例如，可通過(guò)引入“抗凍”蛋白，例如Winter Flounder所述(Cutler et al.，J Plant Physiol.，135351(1989))，或者其合成基因衍生物，來(lái)增加對(duì)冰凍溫度的抗性。增強(qiáng)的對(duì)寒冷的耐受性可通過(guò)在質(zhì)體中增加甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)來(lái)獲得(Wolter et al.，EMBO J.，114685(1992))。對(duì)氧化脅迫的抗性可通過(guò)超氧化物歧化酶的表達(dá)來(lái)獲得(Gupta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，901629(1993))，并可被谷胱甘肽還原酶提高(Bowler et al.，Ann Rev.Plant Physiol.，4383(1992))。
已考慮到，對(duì)植物的水含量、總水勢(shì)、滲透勢(shì)以及膨脹有有利影響的基因的表達(dá)將能增強(qiáng)植物對(duì)干旱的耐受能力，因此將會(huì)是有用的。例如，已提出，編碼具有滲透活性的溶質(zhì)的生物合成的基因的表達(dá)，可能賦予針對(duì)干旱的保護(hù)。此類(lèi)基因包括編碼甘露醇脫氫酶(Leeand Saier，J.Bacteriol.，25810761(1982))和海藻糖-6-磷酸合酶(Kaasen et al.，J.Bacteriol.，174889(1992))的基因。
類(lèi)似地，其它代謝物可能保護(hù)酶的功能或膜的完整性(Loomis etal.，J.Expt.Zoology，2529(1989))，因此編碼這些化合物的生物合成的基因的表達(dá)可能會(huì)以與甘露醇類(lèi)似或互補(bǔ)的方式提供對(duì)干旱的抗性。具有滲透活性和/或能在干旱和/或干燥期間提供某些直接保護(hù)作用的天然存在的代謝物的其他例子包括果糖、赤蘚醇、山梨糖醇、半乳糖醇、甘油葡萄糖、蔗糖、水蘇糖、蜜三糖、脯氨酸、甘氨酸、甜菜堿、芒柄醇(ononitol)和松醇。例如，見(jiàn)，U.S.專利6281411。
基于結(jié)構(gòu)相似性，已發(fā)現(xiàn)了三類(lèi)胚胎發(fā)生晚期蛋白質(zhì)(參見(jiàn)，Dureet al.，Plant Molecular Biology，12475(1989))。來(lái)自全部三組LEA的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)都可以帶來(lái)對(duì)干旱的耐受性?？赡苡杏玫脑谒{迫期間被誘導(dǎo)的其它類(lèi)型的蛋白質(zhì)包括硫醇蛋白酶、醛縮酶、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在干旱脅迫期間它們可以帶來(lái)多種不同的保護(hù)性和/或修復(fù)性的功能。例如，見(jiàn)，PCT/CA99/00219(Na+/H+交換多肽基因)。實(shí)現(xiàn)脂類(lèi)生物合成的基因在帶來(lái)干旱抗性的方面也可能是有用的。
涉及到能夠增加從干旱土壤中吸取水的特定形態(tài)特性的基因的表達(dá)也可能是有用的。在脅迫期間增強(qiáng)繁殖適合度(reproductivefitness)的基因也可能是有用的。還提出，在脅迫期間使種子敗育最小化的基因的表達(dá)能增加將要收獲的谷物的量并因此有價(jià)值。
通過(guò)基因的引入和表達(dá)，使植物能更為有效地利用水，在土壤水分的可獲得程度并非限制因素之時(shí)，可以提高植物的整體表現(xiàn)。通過(guò)引入能提高植物下述能力的基因，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量穩(wěn)定性或產(chǎn)量表現(xiàn)的一致性，所述能力為在所有與水可獲得性相關(guān)的脅迫中對(duì)水的利用程度最大化的能力。
植物組分或質(zhì)量植物的組分可被改變，例如，以提高氨基酸的平衡，這可以通過(guò)多種方法來(lái)進(jìn)行，其中包括增加天然蛋白質(zhì)的表達(dá)、降低組成不好的蛋白質(zhì)的表達(dá)、改變天然蛋白質(zhì)的組分或者引入編碼具有較好組分的全新蛋白質(zhì)的基因。見(jiàn)，例如，U.S.專利6160208(對(duì)種子貯藏蛋白質(zhì)表達(dá)的改變)。引入能改變植物中油的含量的基因也是有價(jià)值的。例如，見(jiàn)，U.S.專利6069289和6268550(ACCase基因)?？梢砸朐黾又参锏矸鄢煞譅I(yíng)養(yǎng)價(jià)值的基因，例如，通過(guò)增加分支度來(lái)進(jìn)行，從而通過(guò)延緩代謝使得淀粉在牛中的利用性提高。
植物農(nóng)藝學(xué)特征確定植物能生長(zhǎng)于何處的因素中的兩個(gè)是生長(zhǎng)季節(jié)期間的平均日常溫度和霜凍之間的時(shí)間長(zhǎng)度。對(duì)植物發(fā)育進(jìn)行的調(diào)節(jié)中涉及到的基因的表達(dá)可能是有用的，例如已在玉米中被鑒定出的無(wú)葉舌(liguleless)和粗糙鞘的基因。
能提高可站立性(standability)和其它植物生長(zhǎng)特性的基因可被引入到玉米中。能使得莖更強(qiáng)壯、根系統(tǒng)被改善或能預(yù)防或減少穗損失的基因的表達(dá)對(duì)于農(nóng)民來(lái)說(shuō)將是有價(jià)值的。
營(yíng)養(yǎng)利用對(duì)可獲得的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的能力對(duì)于植物生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)可能是限制性因素。通過(guò)引入基因來(lái)改變營(yíng)養(yǎng)物吸收，對(duì)pH極限的耐受，植物中的流動(dòng)，貯藏庫(kù)(storage pools)以及代謝活性的可獲得性是可能的。上述修飾會(huì)使植物能更有效地利用可獲得的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。例如，通常存在于植物中并涉及到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用的酶的活性增加，可以增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可獲得性。此類(lèi)酶的一個(gè)例子是植酸酶。
雄性不育雄性不育對(duì)于生產(chǎn)雜交種子來(lái)說(shuō)是有用的，可以通過(guò)基因表達(dá)來(lái)獲得雄性不育。通過(guò)轉(zhuǎn)化引入TUFR-13，以將雄性不育與疾病敏感性分開(kāi)是可能的。見(jiàn)，Levings，(Science，250942-947，(1990))。因?yàn)榭赡鼙仨氁獮榱朔庇康暮凸任锷a(chǎn)使雄性恢復(fù)生育力，因此還可以引入編碼使雄性生育力復(fù)原的基因。
植物再生和對(duì)種子的生產(chǎn)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的胚胎發(fā)生愈傷組織、分生組織(meristemate tissue)、胚、葉盤(pán)等，可被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，所述植物能展示出對(duì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的蘇氨酸脫氨酶基因的穩(wěn)定的遺傳性。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，對(duì)能展示出對(duì)異亮氨酸的氨基酸類(lèi)似物或游離L-異亮氨酸具有滿意耐受性水平的植物細(xì)胞系使用植物再生方案，以獲得表達(dá)出耐受性特征的成熟植物和種子(例如，見(jiàn)U.S.專利5990390和5489520；以及Laursen etal.，Plant Mol.Biol.，2451(1994))。植物再生方案允許體胚(somaticembryo)發(fā)育，以及隨后長(zhǎng)出根和芽。
為確認(rèn)耐受性特征表達(dá)于經(jīng)過(guò)分化的植物器官中，而非僅限于未經(jīng)分化的細(xì)胞培養(yǎng)物中，對(duì)被再生的植物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)針對(duì)植物多個(gè)部分中存在的Ile水平以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的水平進(jìn)行，所述水平是相對(duì)于再生的未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物而言的。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，可從下述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和組織中獲得轉(zhuǎn)基因植物和種子，所述細(xì)胞和組織展示出Ile含量以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的含量的變化，或者對(duì)異亮氨酸類(lèi)似物的抗性。葉片或種子中，Ile含量以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種含量的增加是特別優(yōu)選的。存在抑制量的異亮氨酸或其類(lèi)似物的情況下，酶的比活性的改變可通過(guò)對(duì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的酶活性進(jìn)行測(cè)量來(lái)測(cè)定，如Widholm，Biochimica et Biophysica Acta，27948(1972)所述。Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的總含量的改變還可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，例如，如Jones et al.，Analyst，106968(1981)所述。
然后可從已知能表達(dá)上述特性的細(xì)胞系來(lái)獲得成熟的植物。如果可能的話，被再生的植物是自授粉的。此外，從被再生的植物獲得的花粉可被雜交給農(nóng)藝學(xué)上重要的近交系的由種子長(zhǎng)出的植物。在一些情況下，來(lái)自上述近交系的植物的花粉可用于向被再生的植物授粉。通過(guò)對(duì)第一代和后代植物中該特性的分離情況進(jìn)行評(píng)估，可從遺傳學(xué)角度來(lái)對(duì)該特性進(jìn)行表征。如果所述特性是可用于商業(yè)用途的話，那么，從組織培養(yǎng)物中選出的特性在植物中的遺傳性和表達(dá)是特別重要的。
如果可獲得很多種不同的雜交組合用于銷(xiāo)售的話，在大豆、其它豆類(lèi)、谷物和其它植物中，對(duì)Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種進(jìn)行過(guò)量生產(chǎn)的商業(yè)價(jià)值會(huì)達(dá)到最大。典型地，農(nóng)民種植不止一種的雜交植物，基于成熟期、可站立性或其它農(nóng)藝學(xué)特性。此外，適用于一部分農(nóng)村的雜交植物不適用于另一部分，因?yàn)樯鲜鎏匦?，例如成熟期、?duì)疾病和昆蟲(chóng)的抗性會(huì)有不同。因此，必須要將對(duì)Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的過(guò)量生產(chǎn)引入大量的親本近交系，從而獲得多種雜交組合。
通過(guò)將最初的過(guò)量生產(chǎn)系與普通的原種品系(elite line)雜交，然后再將后代與普通親本回交，來(lái)進(jìn)行一種轉(zhuǎn)變過(guò)程(回交)。來(lái)自這種雜交的后代將會(huì)分離，從而一些植物帶有用于過(guò)量生產(chǎn)的基因，而一些不帶。帶有上述基因的植物將再次與普通親本雜交，再一次得到按照過(guò)量生產(chǎn)和普通生產(chǎn)進(jìn)行分離的后代。對(duì)此進(jìn)行重復(fù)，直到最初的普通親本轉(zhuǎn)變?yōu)槟苓^(guò)量生產(chǎn)的品系，并擁有最初在普通親本中發(fā)現(xiàn)的其它所有重要品質(zhì)。對(duì)將被轉(zhuǎn)化為對(duì)Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種進(jìn)行過(guò)量生產(chǎn)的品系的所有原種品系進(jìn)行單獨(dú)的回交程序。
回交之后，對(duì)新的過(guò)量生產(chǎn)系和能產(chǎn)生好的商業(yè)雜交植物的品系的適當(dāng)組合進(jìn)行關(guān)于過(guò)量生產(chǎn)以及一組重要農(nóng)藝學(xué)特性的評(píng)估。生產(chǎn)出對(duì)最初的普通系和雜交植物的類(lèi)型來(lái)說(shuō)是正確的過(guò)量生產(chǎn)系和雜交植物。這需要在一系列環(huán)境條件(其中，所述的系和雜交植物通常被商業(yè)化生長(zhǎng))下來(lái)進(jìn)行評(píng)估。為生產(chǎn)具有高含量的Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的大豆，以下條件可能是必需的雜交植物種子的兩個(gè)親本在高含量Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種的特性方面是純合的。使用標(biāo)準(zhǔn)的雜交種子生產(chǎn)方法，增加表現(xiàn)令人滿意的雜交植物的親本系，將其用于雜交植物的生產(chǎn)。
我們期待本文中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物能用于多種商業(yè)和研究用途?？蔀橹趥鹘y(tǒng)農(nóng)業(yè)中應(yīng)用的目的來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，所述植物具有下述特性，所述特性對(duì)于從植物中收獲的谷物的消費(fèi)者來(lái)說(shuō)是有好處的(例如，人類(lèi)食物或動(dòng)物飼料中增加的營(yíng)養(yǎng)物的含量)。在此類(lèi)用途中，通常是為其谷物在人類(lèi)或動(dòng)物食品中的用途來(lái)對(duì)植物進(jìn)行生長(zhǎng)的。但是，所述植物的其它部分，包括莖、殼、根、塊莖、花、營(yíng)養(yǎng)部分等可能也有用途，包括用作為動(dòng)物青貯飼料、發(fā)酵給料、生物催化的一部分，或者用于觀賞用途。
轉(zhuǎn)基因植物還可用于對(duì)蛋白質(zhì)或其它分子進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)，其中感興趣的分子提取或純化自植物的部分、種子等。還可對(duì)來(lái)自植物的細(xì)胞或組織進(jìn)行培養(yǎng)、體外培育或發(fā)酵以生產(chǎn)此類(lèi)分子。
轉(zhuǎn)基因植物還可用于商業(yè)繁育計(jì)劃，或可與相關(guān)作物物種的植物進(jìn)行雜交或繁育。由重組DNA編碼的改進(jìn)可被轉(zhuǎn)移，例如從大豆細(xì)胞到其它物中的細(xì)胞，例如通過(guò)原生質(zhì)體融合。
下述實(shí)施例被用于進(jìn)一步的闡述本發(fā)明的某些方面。
實(shí)施例1本實(shí)施例涉及對(duì)下述植物表達(dá)載體的構(gòu)建，所述載體含有編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸等位變異體。
具體而言，選用氨基酸L481對(duì)被去調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫氨酶進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。產(chǎn)生若干突變等位基因，其中每個(gè)都具有較之ilvA L481F突變等位基因更高或更低的IC50Ile值。上述等位基因被用于測(cè)定蘇氨酸脫氨酶的反饋不敏感性范圍，用于轉(zhuǎn)基因植物。表2(上文中)列出了在ilvA的第481位氨基酸進(jìn)行的氨基酸取代。
在本文所述的實(shí)施例中，DNA修飾酶，包括限制性酶，都購(gòu)自NewEngland Biolabs(Beverly，MA)。寡核苷酸引物是由Invitrogen LifeTechnologies(Carlsbad，California)合成的。所有其它的化學(xué)物質(zhì)都購(gòu)自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。蛋白質(zhì)測(cè)定是按照(Bradford，Anal.Biochem.，72248-254(1976))所述進(jìn)行的。
使用的ilvA等位基因來(lái)源于野生型的E.coli ilv蘇氨酸脫氨酶基因(SEQ ID NO1)，其編碼可從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的SEQ ID NO2(編號(hào)K03503；Lawther et al.，Nucleic Acids Res.，152137(1987))。通過(guò)對(duì)E.coli進(jìn)行誘變并分離來(lái)產(chǎn)生異亮氨酸去調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫氨酶變異體，按照(Gruys et al.，U.S.專利5942660；Asrar et al.，U.S.專利6091002和6228623；和Slater et al.，Nature Biotechnology，71011-1016(1999))所述。含有ilvA219(L447F)突變的經(jīng)誘變的E.coli蘇氨酸脫氨酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO14，其對(duì)應(yīng)的經(jīng)翻譯的多肽序列是SEQ ID NO3。含有ilvA466(L481F)突變的經(jīng)誘變的E.coli蘇氨酸脫氨酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO15。所有突變都是通過(guò)DNA序列分析加以驗(yàn)證的。
用限制性內(nèi)切酶BamHI對(duì)質(zhì)粒pMON53905(圖1)進(jìn)行消化，產(chǎn)生5.9Kbp主鏈片段。該片段作為下文所述的構(gòu)建體的通用主鏈片段。
用BamHI對(duì)質(zhì)粒pMON25666(圖2)進(jìn)行消化，以產(chǎn)生分別為3.8和2.8Kbp的兩條片段。將2.8Kbp的片段連接到來(lái)自pMON53905的5.9Kbp的主鏈片段上，產(chǎn)生名為pMON53910的質(zhì)粒(圖3)。該質(zhì)粒含有野生型ilvA基因(SEQ ID NO1)，被用作為對(duì)照。
用BamHI對(duì)質(zhì)粒pMON25694進(jìn)行消化，以產(chǎn)生分別為3.8和2.8Kbp的兩條片段。將2.8Kbp的片段連接到(來(lái)自pMON53905的)5.9Kbp的主鏈片段上，產(chǎn)生名為pMON53911的質(zhì)粒(圖4)。該質(zhì)粒含有經(jīng)過(guò)誘變的E.coli蘇氨酸脫氨酶基因，ilvA219(L447F)(SEQ IDNO14)。
用BamHI對(duì)質(zhì)粒pMON25695進(jìn)行消化，以產(chǎn)生分別為3.8和2.8Kbp的兩條片段。將2.8Kbp的片段連接到5.9Kbp的主鏈片段上，產(chǎn)生名為pMON53912的質(zhì)粒(圖5)。該質(zhì)粒含有經(jīng)過(guò)誘變的E.coli生物合成蘇氨酸脫氨酶基因，ilvA466(L481F)(SEQ ID NO15)。
實(shí)施例2在用轉(zhuǎn)基因植物中經(jīng)過(guò)分離的ilvA等位基因進(jìn)行進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)之前，將每個(gè)等位基因都在E.coli中過(guò)量表達(dá)，以測(cè)定其動(dòng)力學(xué)參數(shù)。表4展示了含有多種突變的蘇氨酸脫氨酶的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，以及與可從來(lái)自Arabidopsis的蘇氨酸脫氨酶獲得的數(shù)據(jù)的比較。將E.coliilvA481變異體亞克隆進(jìn)pSE380(invitrogen，Carlsbad，California)，用0.2mM IPTG在37℃處理3小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)。如SDS-PAGE所示，E.coli等位基因的表達(dá)很高，而且相當(dāng)一致。每種變異體蘇氨酸脫氨酶占到了E.coli中可溶蛋白總量的50％以上。唯一的例外是L481K變異體蘇氨酸脫氨酶，其表達(dá)很少，酶活也很低。
通過(guò)在存在和不存在L-異亮氨酸的情況下進(jìn)行穩(wěn)定態(tài)動(dòng)力分析，對(duì)ilvA中Leu481上的氨基酸取代的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。用于在體外動(dòng)力學(xué)研究中使用的蘇氨酸脫氨酶多肽提取自E.coli細(xì)胞，提取在試驗(yàn)緩沖液中進(jìn)行，所述緩沖液含有50mM磷酸鉀(pH7.5)、1mM二硫蘇糖醇(DTT)和0.5mM的乙二胺四乙酸。使用連續(xù)試驗(yàn)的方法在230nm處對(duì)α-酮丁酸的形成進(jìn)行直接監(jiān)測(cè)(ε230(pH7.5)＝540M-1cm-1，而蘇氨酸吸收可以忽略不計(jì)(～1％))。通過(guò)向含有L-蘇氨酸(2.5mM至50mM)的試驗(yàn)容器中加入20μl經(jīng)過(guò)120v/v稀釋的粗提取物，來(lái)起動(dòng)試驗(yàn)，終體積為1mL。為造成L-異亮氨酸抑制，加入0mM至20mM之間的L-異亮氨酸。使用GraFit 4.0軟件(Erithacus Software，Surrey，UK)，將數(shù)據(jù)點(diǎn)代入公式，對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。為進(jìn)行比較，將L481等位基因的kcat值歸一化為野生型IlvA酶的kcat值。上述分析的結(jié)果展示于圖6和7中。圖7中列出的酶是野生型E.coli蘇氨酸脫氨酶(圓圈)、L481Y TD酶(菱形)、L481F TD酶(三角形)和L481T TD酶(方形)。表4也對(duì)多種E.coli ilvA等位基因生產(chǎn)的變異體蘇氨酸脫氨酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了概括。
表4.某些表達(dá)于E.coli中的蘇氨酸脫氨酶的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)

所有L481等位基因都展示出與底物結(jié)合成正協(xié)同性(S型曲線)，而Arabidopsis的蘇氨酸脫氨酶卻顯示出沒(méi)有依賴性的活性(典型的雙曲線)(圖6)。突變體協(xié)同性的程度(Hill系數(shù))在1.1(pMON25868，L481Y)至1.6(pMON25865，L481Q；pMON25861，L481I)之間(表4)。有趣的是，通過(guò)F-檢測(cè)(JMP統(tǒng)計(jì)軟件(SAS Institute，Cary，NC)，可將關(guān)于L481Y的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)曲線(n＝1.1)歸為雙曲線，置信度為99％。存在異亮氨酸時(shí)，L481突變體酶的活性會(huì)受到抑制，IC50值從97μM(pMON25867，L481V)至1600μM(pMON25868，L481Y)(圖7和表4)。L481突變體中沒(méi)有一種會(huì)在更高的IC50值下，對(duì)底物結(jié)合親和度(Km)產(chǎn)生不良影響(表4)。因此，比較起來(lái)，底物結(jié)合親和度(Km)并未受到殘基481位上異亮氨酸結(jié)合口袋突變的影響。與L481突變體不同，L447F ilvA219突變體顯示出了負(fù)協(xié)同性(n＝0.5)，雖然該突變體僅受異亮氨酸的輕微抑制(IC50＞20,000μM)。
基于上述動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，IC50Ile在100μM(L481M)至1600μM(L481Y)范圍內(nèi)的四種L481等位基因被選用于Arabidopsis轉(zhuǎn)化。
然后將每種L481等位基因從上表4中所述的E.coli表達(dá)質(zhì)粒中亞克隆到種子特異性的植物表達(dá)質(zhì)粒中，用于向Arabidopsis植物中轉(zhuǎn)化。將E.coli ilvA481等位基因從表4所列的E.coli表達(dá)質(zhì)粒上切下，克隆到作為盒的中間載體中，所述中間載體含有種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子(7Sα’；Doyle et al.，J.Biol.Chem.，2619228-9238(1986))；編碼ArabidopsisSSUIA轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Stark et al.，Science，258287(1992))的開(kāi)放閱讀框，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽與含有五種ilvA481等位基因之一的開(kāi)放閱讀框融合；以及3’非翻譯區(qū)域(NOS；Depicker et al.，J.Mol.Appl.Genet.，1(4)361-370(1982))。通過(guò)Agrobacterium介導(dǎo)的侵入反應(yīng)(infiltration)，將得到的二元植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pMON69657(L481P)(圖8)、pMON69659(L481Y)(圖9)、pMON69660(L481F)(圖10)、pMON69663(L481I)(圖11)和pMON69664(L481M)(圖12)轉(zhuǎn)化到Arabidopsis中(Beachtold et al.，C.R.Acad.Sci.Ser.111，3161194-1199(1993))。在50μM草甘膦存在的情況下對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。
用比色終點(diǎn)試驗(yàn)(Szamosi et al.，Plant Phys.，101999-1004(1993))，對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的提取物進(jìn)行關(guān)于蘇氨酸脫氨酶活性的篩選。終點(diǎn)試驗(yàn)在含有100mM Tris-HCl(pH9.0)、100mM KCl、12.5mM L-蘇氨酸的反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行。通過(guò)加入50μl酶提取液至終體積為333μl，來(lái)起始反應(yīng)。反應(yīng)在37℃下溫育30分鐘，用333μl處于1N HCl中的0.05％DNPH(二硝基苯肼)來(lái)終止。在室溫下溫育10分鐘，之后用333μl 4N的NaOH來(lái)進(jìn)行中和。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到一次性的小管(Sarstedt)中，用HP8453二極管陣列分光光度計(jì)在540nm處進(jìn)行讀取。若干獨(dú)立事件(event)產(chǎn)生，其中含有各種L481等位基因。用pMON69657(L481P)(圖8)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化具有異乎尋常低的轉(zhuǎn)化頻率。較低的轉(zhuǎn)化效率被歸因于轉(zhuǎn)化篩選條件，而非所用的特定的蘇氨酸脫氨酶等位基因(數(shù)據(jù)未顯示)。所有存活的經(jīng)過(guò)各種L481等位基因轉(zhuǎn)化過(guò)的植物在表型上與對(duì)照無(wú)法區(qū)分，它們都具有正常的結(jié)籽率(seed set)，這顯示，蘇氨酸脫氨酶等位基因的表達(dá)不會(huì)對(duì)植物的健康產(chǎn)生有害影響。
為測(cè)定經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中異亮氨酸的濃度，收集變干的成熟的Arabidopsis種子和其它營(yíng)養(yǎng)組織，對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸分析。簡(jiǎn)言之，通過(guò)在室溫振蕩混合15分鐘，在100μl5％三氯乙酸中對(duì)5mg非種子的植物組織進(jìn)行提取。在16,000g對(duì)提取液進(jìn)行15分鐘的離心，將上清液轉(zhuǎn)到HPLC管中，用于根據(jù)Agilent進(jìn)行的分析(TechnicalPublication，2000年4月)。通過(guò)熒光光譜，在激發(fā)波長(zhǎng)為340nm和發(fā)射為450nm處，對(duì)氨基酸濃度進(jìn)行測(cè)量。
為測(cè)定種子中的氨基酸濃度，將20mg成熟的Arabidopsis種子、500μl 0.5mm的鋯/二氧化硅珠粒(Boise Products，Inc.)和400μL提取緩沖液(100mM磷酸鉀(pH7.4)、5mM氯化鎂、1mM EGTA、2mMDTT、2mM 4-2-氨基乙基苯磺酰氟(AEBSF)、100μM亮抑酶肽、10％甘油)分裝到2mL帶螺旋蓋的管中。在4℃，珠磨式組織研磨器(Biospec Products，Inc.)中，最高設(shè)置下，對(duì)種子進(jìn)行兩次45秒的研磨。在4℃，16000g下，對(duì)細(xì)胞勻漿進(jìn)行10分鐘的離心，通過(guò)熒光光譜，在激發(fā)波長(zhǎng)為340nm和發(fā)射為450nm處，對(duì)上清液進(jìn)行分析。
表5A-5B顯示了pMON69659(L481Y)(圖9)、pMON69660(L481F)(圖10)、pMON69663(L481I)(圖11)和pMON69664(L481M)(圖12)事件的R2代種子中的異亮氨酸積累情況(ppm)。和預(yù)期的一樣，來(lái)自不同事件的轉(zhuǎn)基因植物中異亮氨酸的積累情況呈現(xiàn)廣泛的分布。用pMON69659(L481Y)轉(zhuǎn)化的事件產(chǎn)生的Ile平均為85.9±37.4ppm，范圍為38.1至153.9ppm。用pMON69660(L481F)轉(zhuǎn)化的事件產(chǎn)生的Ile平均為319.6±397.4ppm，范圍為41.4至2592ppm。用pMON69663(L481I)轉(zhuǎn)化的事件產(chǎn)生的Ile平均為204.3±159.1ppm，范圍為55.4至728.2ppm。用pMON69664(L481M)轉(zhuǎn)化的事件產(chǎn)生的Ile平均為168.1±232.0ppm，范圍為42.3至1308.6ppm。未經(jīng)過(guò)編碼蘇氨酸脫氨酶的基因轉(zhuǎn)化過(guò)的對(duì)照事件產(chǎn)生平均為73.75±2.5ppm的Ile。一種事件，其基于L481F(ilvA466)等位基因，能產(chǎn)生增加23倍的Ile，這是觀察到的最大增加。
大部分轉(zhuǎn)化體都無(wú)法積累異亮氨酸，以相對(duì)于對(duì)照增加水平。此外，IC50ILe和轉(zhuǎn)基因植物中積累的異亮氨酸的量之間沒(méi)有顯示出任何關(guān)聯(lián)。例如，用pMON69659(L481Y)轉(zhuǎn)化過(guò)的品系具有最高的IC50ILe，但卻沒(méi)有出現(xiàn)任何異亮氨酸水平顯著增加的事件。
表5A.用四種不同的蘇氨酸脫氨酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過(guò)的Arabidopsis植物中Ile的濃度(ppm)


表5B.用四種不同的蘇氨酸脫氨酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過(guò)的Arabidopsis植物中Ile的濃度(ppm)


為確定產(chǎn)生的異亮氨酸的水平和蘇氨酸脫氨酶的相對(duì)表達(dá)水平之間是否有任何關(guān)聯(lián)，對(duì)若干種具有高異亮氨酸積累和低異亮氨酸積累的品系進(jìn)行Western印記和酶活性分析。簡(jiǎn)言之，將大約10μg可溶的粗制提取物上樣至4％-20％梯度的SDS-PAGE凝膠(Zaxis)上。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Biorad)上。用TBST(Tris緩沖鹽水，具有0.05％Tween 20)中5％的牛奶對(duì)印記進(jìn)行1小時(shí)的封閉。用含有針對(duì)純化的酶的多克隆抗體的1∶3000稀釋過(guò)的(用含有0.5％BSA的TBST)兔血清(MR324)，對(duì)印記進(jìn)行1小時(shí)的探測(cè)(probe)。用抗兔堿性磷酸酶綴抗體進(jìn)行探測(cè)之后，用Sigma Fast BCIP/NBT片劑(Sigma，St.Louis，MO)對(duì)膜進(jìn)行顯色。
結(jié)果顯示，表達(dá)、活性和異亮氨酸積累之間沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)(數(shù)據(jù)未顯示)。僅在含有最高水平蘇氨酸脫氨酶積累的品系中能探測(cè)到活性，雖然所有的L481等位基因都顯示能積累Western陽(yáng)性信號(hào)。為探測(cè)更低表達(dá)的品系中的活性，可以使用更為敏感的試驗(yàn)方法(Gruyset al.，1999)。
實(shí)施例3本實(shí)施例展示了一種在Arabidopsis植株中增加異亮氨酸和纈氨酸濃度的方法，所述方法是通過(guò)將異亮氨酸去調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫氨酶(TD)(ilvA466，SEQ ID NO15)與纈氨酸和異亮氨酸生物合成途徑中涉及到的另外的酶組合起來(lái)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述另外的酶即，編碼E.coli ilvG乙酰乳酸合酶大亞基(EC2.2.1.6；SEQ ID NO16)和ilvM乙酰乳酸合酶II小亞基(EC2.2.1.6；SEQ ID NO17)的多核苷酸分子。
用SmaI和PvuII限制性酶，從pMON53912中切下蘇氨酸脫氨酶E.coli IlvA466等位基因(SEQ ID NO15)，將其連接到基礎(chǔ)載體pMON38207上的SamI和PmeI限制性位點(diǎn)上，產(chǎn)生pMON58143。將載體pMON58143(圖13)用于由Agrobacterium介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，所述轉(zhuǎn)化在卡納霉素篩選下進(jìn)行。
通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，分離出編碼ilvG和ilvM的基因，其中使用基于其分別的一級(jí)序列的引物對(duì)。pMON58131含有ilvG基因(SEQ ID NO16)。將SEQ ID NO16連接到pGEM-Teasy載體(Promega Corporation，USA)上，得到載體TTFAGA018992。用BspHI和KpnI限制性酶，從TTFAGA018992上切下ilvG基因的5’多核苷酸片段(SEQ ID NO18)，將其連接到含有Arabidops SSU1A轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQID NO9；Stark et al.，Science，258287(1992))的中間載體上，產(chǎn)生pMON58145。然后用KpnI和NcoI限制性酶，切下可操作地連接的SSU1A轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID NO19)和ilvG基因片段(SEQ ID NO18)，將其連接到pMON58132中。然后用BglII和KpnI限制性酶，從pMON58132中切下可操作地連接的SEQ ID NO18和19，將其連接到穿梭載體pMON36220中，用SamI和KpnI限制性酶進(jìn)行切割，連接到pMON58146中。用KpnI和EcoRI限制性酶，從TTFAGA018992上切下剩余的3’ilvG多核苷酸片段(SEQ ID NO20)，將其連接到與SEQ ID NO18和19可操作地連接的pMON58146中，產(chǎn)生pMON58147。然后用NotI和EcoRI限制性酶，從pMON58147上切下SSU1A轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID NO19)和完整的ilvG編碼區(qū)域(SEQ ID NO16)，將其連接到pMON64205中。接著用PmeI和BglII，從pMON64205上切下SSU1A轉(zhuǎn)運(yùn)肽/ilvG盒，然后將其可操作地連接到7s-alpha啟動(dòng)子(U.S.Publication No.2003/0093828)和arcelin53’非翻譯區(qū)域(WO02/50295-A2)上，產(chǎn)生pMON58136。用NotI和BspHI從pMON58136上切下完整的盒，將其連接到轉(zhuǎn)化載體pMON38207上，產(chǎn)生pMON58138。
pMON58133含有ilvM多核苷酸序列(SEQ ID NO17)。將SEQID NO17連接到pGEM-Teasy(Promega，見(jiàn)上文)中，產(chǎn)生pMON58137。然后用BspHI和NotI限制性酶，從pMON58137上切下SEQ ID NO17，將其連接到pMON58129(先用PmeI和NcoI消化過(guò))。這會(huì)使SEQ ID NO17可操作地連接到Napin啟動(dòng)子(U.S.專利5420034)、Arabidopsis SSU1A轉(zhuǎn)運(yùn)肽和ADR123’-非翻譯區(qū)域(U.S.專利5981841)上。該質(zhì)粒被稱為pMON58140。用BspHI和NotI限制性酶，切下表達(dá)盒，將其連接到植物轉(zhuǎn)化載體pMON38207(先用限制性酶NotI消化過(guò))中，產(chǎn)生pMON58151。
用NotI和BspHI限制性酶從中間載體pMON58140上切下ilvM盒，將其連接到含有ilvG盒和植物轉(zhuǎn)化主鏈的pMON58138中，產(chǎn)生pMON58159。此外，用PvuII和SmaI限制性酶從pMON53912上切下ilvA466，將其可操作地連接到來(lái)自pMON58159的ilvG和ilvM盒上，產(chǎn)生pMON58162(圖16)。
通過(guò)Agrobacterium介導(dǎo)的侵入反應(yīng)，將得到的二元植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pMON58143(ilvA466)(圖13)、pMON58159(ilvG+ilvM)(圖14)和pMON58162(ilvA466+ilvG+ilvM)(圖15)轉(zhuǎn)化到Arabidopsis中(Beachtold et al.，C.R.Acad.Sci.Ser.111，3161194-1199(1993))。在存在卡納霉素的情況下對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。
為測(cè)量種子中氨基酸的濃度，將5mg成熟的種子組織研磨成細(xì)粉，通過(guò)振蕩混合，在室溫，于100μl 5％的三氯乙酸中，對(duì)所述的粉進(jìn)行15分鐘的提取。在16,000g下對(duì)提取液進(jìn)行15分鐘的離心，將上清液轉(zhuǎn)移到HPLC管中，按照廠商所述進(jìn)行分析(AgilentTechnologies，USA)。通過(guò)熒光光譜，在激發(fā)波長(zhǎng)為340nm和發(fā)射為450nm處，對(duì)氨基酸濃度進(jìn)行測(cè)量。
對(duì)于每種構(gòu)建體而言，產(chǎn)生了若干種獨(dú)立的事件。對(duì)于每種事件，收集變干的成熟的分散開(kāi)的Arabidopsis種子作為庫(kù)，將其用于氨基酸分析。用ilvA466(pMON58143)轉(zhuǎn)化過(guò)的植物的種子具有增加的異亮氨酸水平，其較之未用ilvA466轉(zhuǎn)化的植物的種子中發(fā)現(xiàn)的平均異亮氨酸水平，有大約69倍的增長(zhǎng)(表6A)。還觀察到了，與其它游離氨基酸(包括精氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸)濃度的正關(guān)聯(lián)，其定義為Pearson’s關(guān)聯(lián)系數(shù)(r)為0.60或更高(Snedecor and Cochran，InStatistical Methods，1980)。
來(lái)自用ilvG、ilvM(pMON58159)轉(zhuǎn)化過(guò)的植物的種子含有升高的纈氨酸水平，其大約比不含ilvG和ilvM的對(duì)照種子高大約15倍，并與色氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和酪氨酸具有正關(guān)聯(lián)(r＞0.60)(表6B)。
來(lái)自用ilvG、ilvM和ilvA466(pMON58162)轉(zhuǎn)化過(guò)的植物的種子含有升高的異亮氨酸(增加了15倍)和纈氨酸(增加了19倍)水平，并且，相對(duì)異亮氨酸與賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸具有正關(guān)聯(lián)(r＞0.60)，相對(duì)纈氨酸，與丙氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸和酪氨酸具有正關(guān)聯(lián)(r＞0.60)(表6C)。
表6A表達(dá)E.coli ilvA466等位基因的Arabidopsis植物中的氨基酸濃度以及與Ile濃度的關(guān)聯(lián)性

表6B表達(dá)ilvG和ilvM的Arabidopsis植物中的氨基酸濃度以及與Ile和Val濃度的關(guān)聯(lián)性


表6C表達(dá)ilvA466、ilvG和ilvM的Arabidopsis植物中的氨基酸濃度以及與Ile和Val濃度的關(guān)聯(lián)性

實(shí)施例4本實(shí)施例展示了用含有蘇氨酸脫氨酶突變等位基因的表達(dá)載體對(duì)大豆植物進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，其中使用顆粒轟擊和農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的方法。
對(duì)商業(yè)可獲得的大豆種子(Asgrow A3244、A4922)進(jìn)行過(guò)夜發(fā)芽處理(大約16-24小時(shí))，切下分生組織外植體。將初生葉移下，以暴露分生組織，外植體被置于靶向培養(yǎng)基中，其中分生組織被放置于與顆粒運(yùn)送的方向垂直的方向上。含有不同的ilvA等位基因的編碼區(qū)域的轉(zhuǎn)化載體pMON53190、pMON53900和pMON53912被用CaCl2和亞精胺沉淀到細(xì)微金顆粒上，隨后重新懸浮于乙醇中。懸浮液被涂布到Mylar片層上，然后將其放置到放電裝置上。通過(guò)在大約60％電容條件下放電，將顆粒加速到植物組織中。
轟擊之后，將外植體置于加有75mM草甘膦的Woody PlantMedium(WPM)(McCown & Lloyd，Proc.International PlantPropagation Soc.，30421(1981))中，放置5-7周，使得轉(zhuǎn)基因的芽可被篩選和培育。轟擊之后大約5-7周，收獲草甘膦陽(yáng)性的芽，將其置于加有25mM草甘膦的選擇性豆類(lèi)生根培養(yǎng)基(Bean Rooting Media，BRM)中，放置2-3周。BRM的組分顯示于表7中。將能長(zhǎng)出根的芽轉(zhuǎn)移到溫室中，種植于土壤中。將在篩選過(guò)程中保持健康但卻不能產(chǎn)生根的芽轉(zhuǎn)移到非選擇性的生根培養(yǎng)基(沒(méi)有草甘膦的豆類(lèi)生根培養(yǎng)基(“BRM”))中，再放置2周。對(duì)來(lái)自在篩選中(off the selection)能產(chǎn)生根的任何芽的根進(jìn)行關(guān)于草甘膦選擇性標(biāo)志表達(dá)的測(cè)試，之后將其轉(zhuǎn)移到溫室，種植于土壤中。植物被保持于標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下，直到收獲種子，該種子被定義為R1種子。
表7.豆類(lèi)生根培養(yǎng)基(BRM)的組分及制備

將該培養(yǎng)基在加或不加草甘膦(典型地，0.025mM或0.040mM)的條件下使用。所有成分一次溶解一種。用滅菌蒸餾水對(duì)混合物進(jìn)行定容，將其貯藏于錫紙包住的瓶中，于4℃，不超過(guò)一個(gè)月。
用Agrobacterium介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法(如Martinell et al.，U.S.專利6384301所述)，還用pMON58028、pMON58029和pMON58031對(duì)大豆植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對(duì)此方法而言，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，將含有包括目標(biāo)基因的質(zhì)粒的Agrobacterium tumefaciens的過(guò)夜培養(yǎng)物培養(yǎng)至對(duì)數(shù)階段，然后稀釋至最終光密度為0.3至0.6。上述培養(yǎng)物被用于向制備的大豆胚外植體進(jìn)行接種，如下文所述。
簡(jiǎn)言之，該方法是向切下的大豆胚分生組織中的個(gè)體大豆細(xì)胞中直接進(jìn)行種系的轉(zhuǎn)化。表面滅菌和種子出芽之后，將大豆胚移開(kāi)。然后將外植體置于OR培養(yǎng)基上，這是按照Barwal et al.，Plants，167473-481(1986)所述改良過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基，其中加有3mg/LBAP、200mg/L的羧芐青霉素、62.5mg/L的頭孢氨噻肟和60mg/L的苯菌靈(Benomyl)，在黑暗中于15℃下貯藏過(guò)夜。第二天，用解剖刀片將外植體劃傷，用按照上文所述制備的Agrobacterium培養(yǎng)物對(duì)其進(jìn)行接種。然后將經(jīng)過(guò)接種的外植體在室溫下培養(yǎng)3天。
轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)之后，接著將分生組織區(qū)域置于標(biāo)準(zhǔn)植物組織培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，其中存在有除草劑草甘膦(Monsato Company，St.Louis，MO)，草甘膦作為選擇性試劑和誘導(dǎo)芽的激素發(fā)揮雙重作用。在Martinell et al.，U.S.專利6384301中有對(duì)培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)長(zhǎng)度的詳細(xì)描述。5至6周后，將具有陽(yáng)性表型的存活的外植體轉(zhuǎn)移到土壤中，在溫室條件下對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，直到成熟。
對(duì)5種個(gè)別的分離的R1種子的異亮氨酸濃度(如實(shí)施例2所示)進(jìn)行測(cè)定，將具有高濃度的那些事件生長(zhǎng)成R1植物。對(duì)每種事件而言，種植24粒種子。收獲得到的R2種子，對(duì)異亮氨酸濃度進(jìn)行測(cè)量，對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在情況進(jìn)行分析。對(duì)R2種子、R2植物和R3種子進(jìn)行同樣的分析。
實(shí)施例5本實(shí)施例展示了對(duì)用蘇氨酸脫氨酶基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過(guò)的大豆植物的鑒定。為測(cè)定蘇氨酸脫氨酶活性，在100μL 1X碾磨緩沖液(表8)中對(duì)單粒(～100mg)種子進(jìn)行碾磨。然后對(duì)混合物在最高速度下進(jìn)行2-3分鐘的離心。通過(guò)施加到Bio-Rad Bio-Gel P-30脫鹽柱對(duì)得到的上清液脫鹽。
經(jīng)過(guò)脫鹽的蛋白質(zhì)提取物(25-50μL)被加入到5X試驗(yàn)混合物(表8)中，至終體積為100μL。在37℃下對(duì)混合物進(jìn)行30分鐘的培養(yǎng)。通過(guò)加入100μL 1N HCl中的0.05％二硝基苯肼來(lái)終止反應(yīng)，接著在室溫再培育10分鐘。然后加入100μL的4N NaOH的等分試樣，通過(guò)分光光度計(jì)在540nm處測(cè)量吸收值。
表8.用于蘇氨酸脫氨酶試驗(yàn)的緩沖液


種子中游離異亮氨酸的濃度通過(guò)如下方法來(lái)測(cè)量碾碎大約50mg的種子，將碾碎的材料置于離心管中，然后稱重。向每只樣品管中加入1mL 5％的三氯乙酸。用振蕩混合儀，在室溫對(duì)樣品進(jìn)行15分鐘的混合。然后在14000rpm下于微離心管中對(duì)樣品進(jìn)行15分鐘的旋轉(zhuǎn)離心。取出上清液中的一些，置于HPLC管中，并密封上。分析之前，樣品被放置于4℃。
對(duì)所有的R1大豆種子進(jìn)行一次樣品分析，每種事件5粒種子，每粒種子一次注射。對(duì)于代表R2和R3種子的后代而言，使用較大規(guī)模的試驗(yàn)，每種事件10粒種子，每種事件一次注射。
用Agilent Technologies 1100系列的HPLC系統(tǒng)，對(duì)樣品進(jìn)行分析。用2.5μL的OPA試劑(硼酸緩沖液中的鄰苯二醛和3-巰基丙酸，Hewlett-Packard PN 5061-3335)，在10μL的pH10.2的0.4N硼酸緩沖液(Hewlett-Packard PN 5061-3339)中，對(duì)樣品的0.5μL的等分試樣進(jìn)行衍生化。將衍生物注射到Agilent Technologies EclipseXDB-C183.5μm，4.6×75mm，流速為2mL/min。
表9.HPLC實(shí)驗(yàn)條件

HPLC緩沖液A95％40mM Na2HPO4，pH＝7.8+5％緩沖液B+0.01％NaN3HPLC緩沖液B45％∶45％∶10％甲醇∶乙腈∶水用熒光探測(cè)來(lái)測(cè)量異亮氨酸濃度(340nm處激發(fā)，450nm處發(fā)射)，通過(guò)在10至800μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)值進(jìn)行計(jì)算。
對(duì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的大豆植物中游離異亮氨酸濃度的評(píng)估結(jié)果顯示，空對(duì)照中游離異亮氨酸濃度為種子中大約100μg/g，而用ilvA219和ilvA466等位基因轉(zhuǎn)化過(guò)的植物分別具有超過(guò)大約600和1300μg/g。上述數(shù)據(jù)顯示，較之未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物，用去調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)化過(guò)的植物中游離異亮氨酸水平顯著更高。
為確定經(jīng)過(guò)蘇氨酸脫氨酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆植物中是否存在蘇氨酸脫氨酶蛋白質(zhì)，從野生型和異亮氨酸去調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫氨酶突變體等位基因產(chǎn)生的品系獲得成熟的大豆種子，對(duì)其進(jìn)行Western印記分析。將大豆種子干燥，碾碎成粉。向20mg的粉中加入200μl的1XSDS-PAGE樣品緩沖液，在旋轉(zhuǎn)下，于4℃對(duì)混合物進(jìn)行4小時(shí)的培養(yǎng)。通過(guò)煮沸5-10分鐘，來(lái)終止反應(yīng)。然后在14000rpm下對(duì)混合物進(jìn)行10分鐘的離心。得到的上清液置于一旁，重復(fù)進(jìn)行離心。將上清液部分合并，用Bio-Rad蛋白質(zhì)試驗(yàn)試劑盒(Bio-Rad)對(duì)其進(jìn)行關(guān)于蛋白質(zhì)的試驗(yàn)。
然后使用10％的Tris-HCl緩沖液，通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分離上清液部分。加入樣品染色劑(10％v/v)后，向每個(gè)樣品孔上樣1mL制備的樣品。在Tris-甘氨酸-SDS緩沖液中，140伏下，跑膠1小時(shí)。然后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到預(yù)先用甲醇和轉(zhuǎn)移緩沖液潤(rùn)濕過(guò)的PVDF膜上。向軟片(cartridge)上樣后，在冷的Tris-甘氨酸-甲醇緩沖液中，100伏下進(jìn)行1小時(shí)的轉(zhuǎn)移。用10％牛奶溶液(5g脫脂奶粉，在總體積為50mL的含有0.1％Tween 20的TBS緩沖液(20mM Tris，pH7.5和150mM NaCl)中)來(lái)進(jìn)行封閉步驟。
一級(jí)抗體是多克隆兔抗蘇氨酸脫氨酶抗體，用含有1％Tween 20和1％牛奶溶液的TBS緩沖液對(duì)其進(jìn)行1∶1000的稀釋。在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)或者4℃下培養(yǎng)過(guò)夜。次級(jí)抗體是從Sigma Chemical Co.獲得的多克隆抗兔抗體。然后進(jìn)行顯色步驟用含有1％Tween 20的TBS洗3次，每次10分鐘，接著用TBS洗10分鐘，然后進(jìn)行染色。
對(duì)來(lái)自經(jīng)轉(zhuǎn)化的大豆植物的R3種子提取物進(jìn)行Western印記分析，其中取三種不同階段的種子成熟度，對(duì)雜合品系和空品系(nullline)進(jìn)行，結(jié)果顯示，突變體蛋白質(zhì)的濃度隨種子成熟而增加。在得到的凝膠中，相應(yīng)于突變體蘇氨酸脫氨酶蛋白質(zhì)的條帶位置是可見(jiàn)的，該條帶出現(xiàn)于經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物對(duì)應(yīng)的孔道，而在空品系對(duì)應(yīng)的孔道中則不存在。此外，條帶的強(qiáng)度隨著成熟由早期到晚期明顯增加。
實(shí)施例6本實(shí)施例展示了對(duì)經(jīng)過(guò)編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的R3大豆種子的氨基酸分析的結(jié)果。表10A-10R提供了使用JMP統(tǒng)計(jì)軟件(SAS Institute，Cary，NC，USA)得到的結(jié)果，所述結(jié)果是在用蘇氨酸脫氨酶轉(zhuǎn)化過(guò)的R3大豆事件中測(cè)得的氨基酸濃度的統(tǒng)計(jì)平均值和誤差。
表10A.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Ile水平

表10B.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Asp水平

表10C.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Glu水平

表10D.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Asn水平

表10E.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Ser水平

表10F.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Gln水平

表10G.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的His水平

表10H.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Gly水平

表10I.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Thr水平

表10J.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Arg水平

表10K.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Ala水平

表10L.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Tyr水平

表10M.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Val水平

表10N.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Met水平

表10O.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Trp水平

表10P.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Phe水平

表10Q.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Leu水平

表10R.表達(dá)蘇氨酸脫氨酶的大豆植物中的Lys水平

表10A至10R中列出的對(duì)氨基酸的分析結(jié)果顯示，在用編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化過(guò)的大豆植物中，大量氨基酸的濃度都有所增加。接合性使得數(shù)據(jù)分離。還提供了一種經(jīng)過(guò)綜合的評(píng)估，其中除去了接合性的影響。用Pearson的方法(Snedecor and Cochran，InStatistical Methods，1982；JMP統(tǒng)計(jì)軟件(SAS Institute，Cary，NC，USA))，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。數(shù)字的值代表著Pearson’s關(guān)聯(lián)系數(shù)(r)。0.60或更高的正值顯示氨基酸濃度與Ile濃度正關(guān)聯(lián)。在雜合條件下，氨基酸Asn、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Val、Met、Phe、Leu和Lys都和Ile水平正關(guān)聯(lián)。在純合條件下，Phe和Lys和Ile濃度正關(guān)聯(lián)。
表11.Ile濃度與其它氨基酸的關(guān)聯(lián)情況

所有公開(kāi)物和專利都通過(guò)引用的方式被包括進(jìn)本文，這和通過(guò)引用單獨(dú)包括進(jìn)本文的一樣。本發(fā)明不限于所示的和所述的具體細(xì)節(jié)，而應(yīng)當(dāng)這樣理解，在由聲明所限定的本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)，可以進(jìn)行很多種變化和改良。
序列表<110>Weaver，Lisa MMitsky，Timothy ARapp，William DGruys，Kenneth JLiang，Jihong<120>一種或多種氨基酸的水平增加的植物<130>REN-00-095<140>US 60/468,727<141>2003-05-07<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1714<212>DNA<213>大腸桿菌<400>1ctcgaggtga caaagcctgg acgccgaaaa atcgtgaacg tcaggtctcc tttgccctgc60gtgcttatgc cagcctggca accagcgccg acaaaggcgc ggtgcgcgat aaatcgaaac120tggggggtta ataatggctg actcgcaacc cctgtccggt gctccggaag gtgccgaata180tttaagagca gtgctgcgcg cgccggttta cgaggcggcg caggttacgc cgctacaaaa240aatggaaaaa ctgtcgtcgc gtcttgataa cgtcattctg gtgaagcgcg aagatcgcca300gccagtgcac agctttaagc tgcgcggcgc atacgccatg atggcgggcc tgacggaaga360acagaaagcg cacggcgtga tcactgcttc tgcgggtaac cacgcgcagg gcgtcgcgtt420ttcttctgcg cggttaggcg tgaaggccct gatcgttatg ccaaccgcca ccgccgacat480caaagtcgac cggctgcgcg gcttcggcgg cgaagtgctg ctccacggcg cgaactttga540tgaagcgaaa cgcaaagcga tcgaactgtc acagcagcag gggttcacct gggtgccgcc600gttcgaccat ccgatggtga ttgccgggca aggcacgctg gcgctggaac tgctccagca660ggacgcccat ctcgaccgcg tatttgtgcc agtcggcggc ggcggtctgg ctgcttgcgt720ggcggtgctg atcaaacaac tgatgccgca aatcaaagtg atcgccgtag aagcggaaga780ctccgcctgc ctgaaagcag cgctggatgc gggtcatccg gttgatctgc cgcgcgtagg840gctatttgct gaaggcgtag cggtaaaacg catcggtgac gaaaccttcc gtttatgcca900
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Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe85 90 95Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala100 105 110Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Arg Leu Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val115 120 125Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile Glu130 135 140Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro145 150 155 160Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln165 170 175Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu180 185 190Ala Ala Cys Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys195 200 205Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu210 215 220Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu225 230 235 240Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln245 250 255Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala260 265 270Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser275 280 285Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn290 295 300Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn
305 310 315 320Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Val Glu Gln325 330 335Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe340 345 350Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn355 360 365Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg370 375 380Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn385 390 395 400Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys405 410 415Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln420 425 430Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu435 440 445Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His450 455 460Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu465 470 475 480Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly485 490 495Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu500 505 510Ala Gly<210>3<211>514
<212>PRI<213>大腸桿菌<400>3Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr1 5 10 15Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr20 25 30Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile35 40 45Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg50 55 60Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His65 70 75 80Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe85 90 95Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala100 105 110Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Arg Leu Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val115 120 125Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile Glu130 135 140Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro145 150 155 160Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln165 170 175Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu180 185 190Ala Ala Cys Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys195 200 205
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115 120 125Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu130 135 140Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro145 150 155 160Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln165 170 175Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu180 185 190Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys195 200 205Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu210 215 220Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu225 230 235 240Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln245 250 255Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala260 265 270Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser275 280 285Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn290 295 300Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn305 310 315 320Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln325 330 335Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe340 345 350
Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn355 360 365Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg370 375 380Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn385 390 395 400Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys405 410 415Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln420 425 430Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu435 440 445Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His450 455 460Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu465 470 475 480Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly485 490 495Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu500 505 510Ala Gly<210>22<211>592<212>PRT<213>擬南芥<400>22Met Asn Ser Val Gln Leu Pro Thr Ala Gln Ser Ser Leu Arg Ser His1 5 10 15
Ile His Arg Pro Ser Lys Pro Val Val Gly Phe Thr His Phe Ser Ser20 25 30Arg Ser Arg Ile Ala Val Ala Val Leu Ser Arg Asp Glu Thr Ser Met35 40 45Thr Pro Pro Pro Pro Lys Leu Pro Leu Pro Arg Leu Lys Val Ser Pro50 55 60Asn Ser Leu Gln Tyr Pro Ala Gly Tyr Leu Gly Ala Val Pro Glu Arg65 70 75 80Thr Asn Glu Ala Glu Asn Gly Ser Ile Ala Glu Ala Met Glu Tyr Leu85 90 95Thr Asn Ile Leu Ser Thr Lys Val Tyr Asp Ile Ala Ile Glu Ser Pro100 105 110Leu Gln Leu Ala Lys Lys Leu Ser Lys Arg Leu Gly Val Arg Met Tyr115 120 125Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln Pro Val Phe Ser Phe Lys Leu Arg Gly130 135 140Ala Tyr Asn Met Met Val Lys Leu Pro Ala Asp Gln Leu Ala Lys Gly145 150 155 160Val Ile Cys Ser Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Leu Ser165 170 175Ala Ser Lys Leu Gly Cys Thr Ala Val Ile Val Met Pro Val Thr Thr180 185 190Pro Glu Ile Lys Trp Gln Ala Val Glu Asn Leu Gly Ala Thr Val Val195 200 205Leu Phe Gly Asp Ser Tyr Asp Gln Ala Gln Ala His Ala Lys Ile Arg210 215 220Ala Glu Glu Glu Gly Leu Thr Phe Ile Pro Pro Phe Asp His Pro Asp225 230 235 240
Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Val Gly Met Glu Ile Thr Arg Gln Ala245 250 255Lys Gly Pro Leu His Ala Ile Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu260 265 270Ile Ala Gly Ile Ala Ala Tyr Val Lys Arg Val Ser Pro Glu Val Lys275 280 285Ile Ile Gly Val Glu Pro Ala Asp Ala Asn Ala Met Ala Leu Ser Leu290 295 300His His Gly Glu Arg Val Ile Leu Asp Gln Val Gly Gly Phe Ala Asp305 310 315 320Gly Val Ala Val Lys Glu Val Gly Glu Glu Thr Phe Arg Ile Ser Arg325 330 335Asn Leu Met Asp Gly Val Val Leu Val Thr Arg Asp Ala Ile Cys Ala340 345 350Ser Ile Lys Asp Met Phe Glu Glu Lys Arg Asn Ile Leu Glu Pro Ala355 360 365Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Ala Glu Ala Tyr Cys Lys Tyr Tyr Gly370 375 380Leu Lys Asp Val Asn Val Val Ala Ile Thr Ser Gly Ala Asn Met Asn385 390 395 400Phe Asp Lys Leu Arg Ile Val Thr Glu Leu Ala Asn Val Gly Arg Gln405 410 415Gln Glu Ala Val Leu Ala Thr Leu Met Pro Glu Lys Pro Gly Ser Phe420 425 430Lys Gln Phe Cys Glu Leu Val Gly Pro Met Asn Ile Ser Glu Phe Lys435 440 445Tyr Arg Cys Ser Ser Glu Lys Glu Ala Val Val Leu Tyr Ser Val Gly450 455 460Val His Thr Ala Gly Glu Leu Lys Ala Leu Gln Lys Arg Met Glu Ser
465 470 475 480Ser Gln Leu Lys Thr Val Asn Leu Thr Thr Ser Asp Leu Val Lys Asp485 490 495His Leu Arg Tyr Leu Met Gly Gly Arg Ser Thr Val Gly Asp Glu Val500 505 510Leu Cys Arg Phe Thr Phe Pro Glu Arg Pro Gly Ala Leu Met Asn Phe515 520 525Leu Asp Ser Phe Ser Pro Arg Trp Asn Ile Thr Leu Phe His Tyr Arg530 535 540Gly Gln Gly Glu Thr Gly Ala Asn Val Leu Val Gly Ile Gln Val Pro545 550 555 560Glu Gln Glu Met Glu Glu Phe Lys Asn Arg Ala Lys Ala Leu Gly Tyr565 570 575Asp Tyr Phe Leu Val Ser Asp Asp Asp Tyr Phe Lys Leu Leu Met His580 585 590
權(quán)利要求
1.一種DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼對(duì)反饋不敏感的蘇氨酸脫氨酶的外源多核苷酸可操作地連接，第二個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼AHAS的外源多核苷酸可操作地連接。
2.一種DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼對(duì)反饋不敏感的蘇氨酸脫氨酶的外源多核苷酸可操作地連接，第二個(gè)表達(dá)盒包含AHAS的大亞基，第三個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼AHAS小亞基的外源多核苷酸可操作地連接。
3.如權(quán)利要求1或2所述的DNA構(gòu)建體，其中所述的啟動(dòng)子中的每一種都是種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。
4.如權(quán)利要求1或2所述的DNA構(gòu)建體，其中所述的啟動(dòng)子中的每一種都選自由napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP 88、增強(qiáng)的USP 88、Arcelin 5和Oleosin所構(gòu)成的組。
5.如權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體，其中存在至少兩種不同的種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。
6.如權(quán)利要求1或2所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第一個(gè)盒包含編碼對(duì)反饋不敏感的包含SEQ ID NO22的蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸。
7.如權(quán)利要求1或2所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第一個(gè)盒包含編碼蘇氨酸脫氨酶變異等位基因或其亞基的外源多核苷酸，所述變異等位基因或其亞基包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。
8.如權(quán)利要求1或2所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述編碼蘇氨酸脫氨酶變異等位基因的多核苷酸是SEQ ID NO2，其中包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。
9.如權(quán)利要求1或2所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第一個(gè)盒還包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸，所述多核苷酸與編碼所述蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸可操作地連接。
10.如權(quán)利要求2所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第二個(gè)表達(dá)盒包含編碼AHAS大亞基的多核苷酸。
11.如權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述編碼AHAS大亞基的多核苷酸包含SEQ ID NO16。
12.如權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)建體，其中，編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸與編碼所述AHAS大亞基的所述多核苷酸可操作地連接。
13.如權(quán)利要求2所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第三個(gè)表達(dá)盒包含編碼AHAS小亞基的多核苷酸。
14.如權(quán)利要求13所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述編碼AHAS小亞基的多核苷酸包含SEQ ID NO17。
15.如權(quán)利要求13所述的DNA構(gòu)建體，其中，編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸與編碼所述AHAS小亞基的所述多核苷酸可操作地連接。
16.一種DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼對(duì)反饋不敏感的蘇氨酸脫氨酶的外源多核苷酸可操作地連接，第二個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼AHAS大亞基的外源多核苷酸可操作地連接。
17.如權(quán)利要求16所述的DNA建體，其中所述的啟動(dòng)子中的每一種都是種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。
18.如權(quán)利要求17所述的DNA構(gòu)建體，其中所述的種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子中的每一種都選自由napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP88、增強(qiáng)的USP 88、Arcelin 5和Oleosin所構(gòu)成的組。
19.如權(quán)利要求16或17所述的DNA構(gòu)建體，其中存在至少兩種不同的種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。
20.如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第一個(gè)盒包含編碼對(duì)反饋不敏感的包含SEQ ID NO22的蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸。
21.如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第一個(gè)盒包含蘇氨酸脫氨酶變異等位基因，所述變異等位基因包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。
22.如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述編碼蘇氨酸脫氨酶變異等位基因的多核苷酸是SEQ ID NO2，其中包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。
23.如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第一個(gè)盒包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸，所述多核苷酸與所述編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸可操作地連接。
24.如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第二個(gè)表達(dá)盒包含編碼AHAS大亞基的多核苷酸。
25.如權(quán)利要求24所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述編碼AHAS大亞基的多核苷酸包含SEQ ID NO16。
26.如權(quán)利要求25所述的DNA構(gòu)建體，其中，編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸與編碼所述AHAS大亞基的所述多核苷酸可操作地連接。
27.一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼單體AHAS的外源多核苷酸可操作地連接。
28.一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含多個(gè)植物表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼AHAS大亞基的外源多核苷酸可操作地連接，第二個(gè)表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，其與編碼AHAS小亞基的外源多核苷酸可操作地連接。
29.如權(quán)利要求28所述的DNA建體，其中所述的啟動(dòng)子中的每一種都是種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。
30.如權(quán)利要求28所述的DNA構(gòu)建體，其中所述的種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子中的每一種都選自由napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP88、增強(qiáng)的USP 88、Arcelin 5和Oleosin所構(gòu)成的組。
31.如權(quán)利要求28所述的DNA構(gòu)建體，其中存在至少兩種不同的種子增強(qiáng)型啟動(dòng)子。
32.如權(quán)利要求28所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第一個(gè)盒包含AHAS的大亞基，其由SEQ ID NO16構(gòu)成。
33.如權(quán)利要求29所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第一個(gè)盒包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸，其與編碼AHAS的所述大亞基的所述多核苷酸可操作地連接。
34.如權(quán)利要求28所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第二個(gè)盒包含編碼AHAS小亞基的多核苷酸。
35.如權(quán)利要求28所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第二個(gè)盒包含編碼AHAS小亞基的多核苷酸，其由SEQ ID NO17構(gòu)成。
36.如權(quán)利要求35所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述第二個(gè)盒包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸，其與編碼所述AHAS小亞基的所述多核苷酸可操作地連接。
37.一種方法，用于制備種子中氨基酸水平增加的轉(zhuǎn)基因雙子葉植物，所述水平增加是相對(duì)來(lái)自相同植物物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子而言的，所述方法包括下述步驟a)向雙子葉植物的可再生細(xì)胞中引入包含如權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因；b)令所述可再生的細(xì)胞再生為雙子葉植物；c)從所述植物獲取種子；d)選出具有增加的氨基酸水平的一?；蚨嗔７N子，所述水平是相對(duì)來(lái)自相同植物物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子而言的；以及e)種植所述種子，其中，如果異亮氨酸以增加的水平存在，那么至少一種額外的氨基酸水平也被增加了。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述雙子葉植物是大豆植物。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，氨基酸的水平增加包含下述氨基酸的濃度增加a)Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種和Ile；或b)Arg、Asn、Asp、His、Met、Leu、Val、Gln、Tyr、Thr、Lys、Ala、Ser和Phe中的一種或多種。
40.由如權(quán)利要求37所述的方法制造的轉(zhuǎn)基因大豆植物。
41.一種用于制備種子中氨基酸含量增加的轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的方法，所述增加是相對(duì)來(lái)自同樣的植物物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子而言的，所述方法包括下述步驟a)向雙子葉植物的可再生細(xì)胞引入包含如權(quán)利要求16所述的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因；b)令所述可再生的細(xì)胞再生為雙子葉植物；c)從所述植物獲取種子；d)選出具有增加的氨基酸水平的一?；蚨嗔７N子，所述水平是相對(duì)來(lái)自相同植物物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子而言的；以及e)種植所述種子，其中，如果異亮氨酸以增加的水平存在，那么至少一種額外的氨基酸水平也被增加了。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述雙子葉植物是大豆植物或油菜植物。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，氨基酸的水平增加包含下述氨基酸的濃度增加a)Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一種或多種和Ile；或b)Arg、Asn、Asp、His、Met、Leu、Val、Gln、Tyr、Thr、Lys、Ala、Ser和Phe中的一種或多種。
44.由權(quán)利要求41所述的方法制造的轉(zhuǎn)基因大豆植物。
45.一種用于制備種子中氨基酸含量增加的轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的方法，所述增加是相對(duì)來(lái)自同樣的植物物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子而言的，所述方法包括下述步驟a)向雙子葉植物的可再生細(xì)胞引入包含如權(quán)利要求27或28所述的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因；b)令所述可再生的細(xì)胞再生為雙子葉植物；c)從所述植物獲取種子；d)選出具有增加的氨基酸水平的一?；蚨嗔７N子，所述水平是相對(duì)來(lái)自相同植物物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子而言的；以及e)種植所述種子。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中，所述雙子葉植物是大豆植物或油菜植物。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中，氨基酸的水平增加包含Ser或Val的濃度增加。
48.由如權(quán)利要求45所述的方法制造的轉(zhuǎn)基因大豆植物。
49.從如權(quán)利要求40、44或48所述的大豆生產(chǎn)出的粗磨粉。
全文摘要
本發(fā)明提供了如下DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含編碼蘇氨酸脫氨酶和/或AHAS的外源多核苷酸。本發(fā)明還提供了用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過(guò)的轉(zhuǎn)基因植物，以及從上述植物獲得的種子和后代。所述轉(zhuǎn)基因植物較之同樣物種的非轉(zhuǎn)基因植物，一種或多種氨基酸的水平有所增加。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1820073SQ200480019478
公開(kāi)日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2004年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月7日
發(fā)明者L·M·韋弗, T·A·米特斯基, W·D·拉普, K·J·格魯伊斯, J·梁, G·瓦杜瓦 申請(qǐng)人:雷尼森有限責(zé)任公司