專利名稱：一種猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種以孢子為外植體的猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方與快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
猴腿蹄蓋蕨(Athyrium multidentatum)別名猴腿兒，猴腿菜，紫莖菜，屬蕨類，蹄蓋蕨科，蹄蓋蕨屬低等植物。生于海拔300～400m的針闊混交林中較潮濕的林下、林緣及草地上。我國(guó)東北、華北等地廣有分布。拳狀嫩葉可食，5～6月間采集沒(méi)有展開(kāi)的葉和幼莖，其營(yíng)養(yǎng)成分十分豐富，且具有保健功能，產(chǎn)品可加工成鹽漬、干制品等，是深受人們喜愛(ài)的綠色保健食品，同時(shí)也是出口創(chuàng)匯的主要野生蔬菜之一。近年來(lái)由于過(guò)度采集，資源遭到破壞，產(chǎn)量銳減，因此，探索人工培養(yǎng)蕨苗的方法及快速繁育技術(shù)，以解決人工栽培中蕨苗供應(yīng)困難的問(wèn)題，無(wú)論對(duì)滿足人們需要及保護(hù)蕨菜資源和生態(tài)環(huán)境都具有重要意義。
人工繁殖一般采用無(wú)性繁殖的方法，即在早春或晚秋在野生蕨菜地挖取地下根莖，在春季或秋季進(jìn)行移栽，不但繁殖系數(shù)低，運(yùn)輸不便，且挖掘根莖既費(fèi)工費(fèi)時(shí)又對(duì)地表植被產(chǎn)生破壞，造成水土流失，使蕨菜資源和生態(tài)環(huán)境受到破壞，因此采用有性繁殖即孢子繁殖是擴(kuò)大蕨類植物繁殖有效途徑，已引起人們的重視。
孢子直播具有取材方便，成苗量大，成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是由于孢子萌發(fā)的溫、濕度與真菌孢子萌發(fā)的適宜條件類似，導(dǎo)致播種失敗。人工蕨菜孢子培養(yǎng)成苗目前只有少量報(bào)道，張金文等(1999)將孢子播種在森林土等基質(zhì)上，得到孢子體幼苗，但仍存在孢子萌發(fā)成苗率低等諸多問(wèn)題，不能適應(yīng)大量用苗的需要。近年來(lái)，通過(guò)孢子組織培養(yǎng)繁殖蕨苗越來(lái)越受到重視，但目前關(guān)于蕨類植物組織培養(yǎng)的報(bào)道并不多，而且大部分集中在觀賞蕨類和瀕危種類上。趙彥芳等(2000)以幼嫩根狀莖險(xiǎn)段為外植體，報(bào)道了山蕨菜組織培養(yǎng)的研究，但存在外植體材料質(zhì)量的審定困難，移栽成活率低等問(wèn)題，已在成活率僅在40％左右。華中農(nóng)大陳龍清等(2000)對(duì)莢果蕨孢子進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，但需要時(shí)間較長(zhǎng)，一般從孢子萌發(fā)到誘導(dǎo)出孢子體需要約1年的時(shí)間。而猴腿蹄蓋蕨的組織培養(yǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道。采用組織培養(yǎng)的方法繁殖猴腿蹄蓋蕨，既不破壞資源，又利于其大量繁殖，為保護(hù)種質(zhì)資源和大規(guī)模栽培利用提供了一條可行途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了猴腿蹄蓋蕨孢子組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方和快速繁殖方法，可在短時(shí)間內(nèi)得到大量的組培苗。
本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵是從調(diào)整培養(yǎng)基中鹽的含量及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和含量入手，經(jīng)2年多反復(fù)多次試驗(yàn)，篩選出了用于猴腿蹄蓋蕨孢子組織培養(yǎng)的系列培養(yǎng)基配方(包括播種培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基)。使猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)獲得成功，可以得到大量組培苗。
本發(fā)明所用的培養(yǎng)基的大量元素為傳統(tǒng)MS培養(yǎng)基用量的1/2，微量元素與MS培養(yǎng)基用量相同；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有GA3(赤霉素)，6-BA(6-芐基氨基嘌呤)，NAA(奈乙酸)等，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的含量如下GA35～30mg/L，6-BA0.5～2mg/L，NAA0.1～0.5mg/L。其他成分包括食用白糖，瓊脂，活性炭。
具體培養(yǎng)基配方如下a.播種培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1mg·L-1(單位下同)+NAA0.1+0～3g·L-1活性炭；b.原葉體增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；c.孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MS+GA35～20+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；d.孢子體繼代培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1+NAA0.1～1+0～3g·L-1活性炭；e.生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1～0.5。
以上培養(yǎng)基均附加3％白糖，0.65％瓊脂，PH5.5～5.8。
活性炭并非必須物質(zhì)，但實(shí)驗(yàn)證明播種在附加活性炭的1/2 MS培養(yǎng)基上的孢子比MS培養(yǎng)基提前3～4周萌發(fā)，在增殖和繼代培養(yǎng)基中添加活性炭，可使培養(yǎng)物生長(zhǎng)更旺盛。利用本發(fā)明可以在6～8個(gè)月內(nèi)，獲得具有完整根莖葉的猴腿蹄蓋蕨的組培苗，具有完整根莖葉的組培苗，移栽成活率可達(dá)到90％以上。
具體實(shí)施例方式
適宜培養(yǎng)溫度15～28℃，光照時(shí)間8～10h·d-1，光照度1500～2000lx。
1、無(wú)菌材料的獲得將成熟的孢子包在濾紙內(nèi)，用70％酒精浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3～5遍，再用0.1％升汞液消毒5～8min，無(wú)菌水沖洗3～5遍，備用。
2、孢子接種及原葉體生長(zhǎng)將無(wú)菌的孢子分散于適量無(wú)菌水中，用滴管吸取孢子水溶液，將孢子溶液滴在a培養(yǎng)基上，每次吸孢子溶液時(shí)要先將溶液混合均勻，每瓶滴3～5滴。2～3周后，在培養(yǎng)基上可見(jiàn)綠色小點(diǎn)，表明孢子已經(jīng)萌發(fā)。三周左右可見(jiàn)心形原葉體。在加入活性炭的培養(yǎng)基中，孢子萌發(fā)及原葉體生長(zhǎng)速度比不含碳的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的快，且長(zhǎng)勢(shì)好，顏色濃綠。
3、原葉體增殖與繼代培養(yǎng)孢子萌發(fā)后4～8周，可進(jìn)行繼代培養(yǎng)。將原葉體移到b培養(yǎng)基上，即可得到大量的配子體，4～6周可增殖15～20倍。
4、孢子體誘導(dǎo)與增殖原葉體葉片長(zhǎng)到3mm左右時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到c培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3周左右可見(jiàn)有孢子體形成。為了得到更多的孢子體，可將其轉(zhuǎn)移到d培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每株孢子體均可大量增殖。未分化的原葉體可繼續(xù)在c培養(yǎng)基上培養(yǎng)，一段時(shí)間后仍可形成孢子體。在孢子體誘導(dǎo)過(guò)程中，要注意經(jīng)常向培養(yǎng)基中噴水，可以促進(jìn)孢子體形成。
5、生根培養(yǎng)與移栽將分化出的孢子體轉(zhuǎn)移到e培養(yǎng)基上，3～4周左右即可見(jiàn)有根長(zhǎng)出，生根率可達(dá)90％以上。待孢子體長(zhǎng)到3cm左右，根長(zhǎng)到2cm左右時(shí)，即可將其移到栽培基質(zhì)中進(jìn)行馴化。移栽時(shí)將試管苗根部培養(yǎng)基洗凈，移植到經(jīng)高溫消毒的松針土和細(xì)砂(1∶1)混合的基質(zhì)上，覆上薄膜保濕，濕度保持在90％以上，放到蔭涼處，10天后可去掉薄膜，但仍要遮蔭保濕，不可放在強(qiáng)光下，移栽成活率可達(dá)90％左右。
本發(fā)明在中國(guó)科學(xué)院東北地里與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所組織培養(yǎng)室中進(jìn)行組織培養(yǎng)，在溫室中進(jìn)行組培苗的移栽和鍛煉。從孢子播種到誘導(dǎo)出孢子體約需6個(gè)月時(shí)間，此后，進(jìn)入孢子體分化生長(zhǎng)高峰期，每4～6周繼代培養(yǎng)一次，增殖率可達(dá)15～20倍，每個(gè)100ml三角瓶可分化出孢子體苗100～150株，經(jīng)過(guò)3～4周生根培養(yǎng)后，即可長(zhǎng)出具有完整根莖葉的組培苗，年繁殖率可達(dá)1∶10000以上，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，有利于增加農(nóng)民收入，減輕農(nóng)民負(fù)擔(dān)，市場(chǎng)前景好。
另外，本發(fā)明的應(yīng)用可有效地保護(hù)植被和野生資源，產(chǎn)生良好的生態(tài)效益。
權(quán)利要求
1.一種以孢子為外植體的猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)方法，其特征在于篩選出系列培養(yǎng)基配方，具體配方如下a.播種培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1mg·L-1(單位下同)+NAA0.1+0～3g·L-1活性炭；b.原葉體增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；c.孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MS+GA35～20+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；d.孢子體繼代培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1～1+0～3g·L-1活性炭；e.生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1～0.5；以上培養(yǎng)基均附加3％白糖，0.65％瓊脂；PH5.5～5.8。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種以孢子為外植體的猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法。本發(fā)明包含猴腿蹄蓋蕨孢子組織培養(yǎng)的系列培養(yǎng)基(包括播種培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基)配方和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和含量，以及操作方法。本發(fā)明可在6～8個(gè)月內(nèi)得到猴腿蹄蓋蕨的組培苗，生根率可達(dá)90％以上，組培苗移栽成活率在90％以上。是一種高效的猴腿蹄蓋蕨種苗生產(chǎn)技術(shù)，并可大規(guī)模生產(chǎn)，每個(gè)100ml三角瓶可生產(chǎn)100株左右的蕨苗。本發(fā)明的應(yīng)用，可有效地保護(hù)野生資源，具有良好的生態(tài)效益。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1720787SQ20041001100
公開(kāi)日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月23日
發(fā)明者王新華, 趙恒田, 沈云霞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所