專利名稱：利用轉(zhuǎn)基因番茄生產(chǎn)人胰島素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人胰島素的方法及其產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
生物反應(yīng)器是近來未許多生物技術(shù)研發(fā)部門十分關(guān)注的領(lǐng)域。諸如奶牛、奶山羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人的生長(zhǎng)因子。在植物生物反應(yīng)器研究中利用馬鈴薯塊莖生產(chǎn)乙肝疫苗的研究受到廣泛的重視。生菜和番茄做為可生食的蔬菜或果品，用它來生產(chǎn)口服的多肽類藥物具有很大的應(yīng)用潛力。人胰島素對(duì)于胰島素依賴的尿病患者的治療是十分重要的。某些糖尿病患者的代謝調(diào)節(jié)與自體免疫功能相關(guān)。
口服胰島素已被證明對(duì)某些類型的尿病治療是有效的〔Reddy S et at，Pancreas2000，20(1)55-60；Ploix C et at，Diabetes 1999，48(1)2150-6；Ramiya VK，MaclarenNK，Horm Res 1997，48 suppl 467-70〕。對(duì)于I型糖尿病的療法，現(xiàn)在普遍使用的有兩種，一種是注射胰島素，另一種是移植。然而，注射胰島素由于并非模仿胰腺β細(xì)胞分泌胰島素的一般過程，因此只能夠控制病情的發(fā)展，而不能夠使疾病的狀況有所改善，并且有可能引起視神經(jīng)萎縮、皮膚過敏和神經(jīng)痛等副作用；移植則經(jīng)常會(huì)引起較強(qiáng)的免疫排斥反應(yīng)。與此同時(shí)，現(xiàn)在所用的抑制免疫的非選擇性藥物由于它們的低效、低靶向性、毒性及一些其他的副作用如其導(dǎo)致的易感染性和傷口愈合過慢而愈發(fā)顯得不適合。所以我們一直希望可以找到一種治療方法，能夠直接靶向與疾病相關(guān)的自身免疫過程而不影響其余的免疫系統(tǒng)的功能。注射疫苗基本上繞開粘膜，通常難于觸發(fā)粘膜免疫應(yīng)答，而可食疫苗卻可以與消化道的襯里接觸，即理論上說，它們可以同時(shí)激活粘膜應(yīng)答和全身應(yīng)答。這種雙重效應(yīng)可以增強(qiáng)對(duì)許多危險(xiǎn)微生物的防御(William H.R.L.，2000)。
口服耐受性是對(duì)于口服蛋白質(zhì)抗原特異的免疫反應(yīng)，它最近被越來越多的人認(rèn)為是一種治療自身免疫疾病和防止移植排斥的好方法。作為一種達(dá)到口服耐受性的途徑，口服胰島素成為了一種新興的治療方法，并已引起人們的關(guān)注。它突破了傳統(tǒng)的治療方法，治療目的在于干擾β細(xì)胞自身免疫的損害，意圖在高血糖癥出現(xiàn)之前阻止其破壞。實(shí)驗(yàn)表明，口服胰島素可以對(duì)I型糖尿病的病情起到一定程度的改善，并且可以預(yù)防或延遲I型糖尿病的發(fā)生；同時(shí)對(duì)II型糖尿病也有一定的療效。
有許多人認(rèn)為，口服蛋白質(zhì)抗原是無效的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诎l(fā)生作用之前已在胃中被降解。實(shí)際上，這個(gè)降解過程并不會(huì)對(duì)口服耐受性產(chǎn)生很大的影響，相反，由于蛋白質(zhì)抗原被切割成為了腸道相關(guān)淋巴組織更容易吸收的小肽，該過程有利于引發(fā)口服耐受性(Zhang Z.J.et al.，1991)。盡管食物中大部分蛋白質(zhì)在被腸道上皮細(xì)胞吸收之前已被切割為無抗原性質(zhì)的氨基酸、二肽或三肽，也存在著一些較長(zhǎng)的小肽并未被完全消化而可以被GALT所吸收。這些抗原會(huì)首先穿過存在于Peyer’s區(qū)腸上皮細(xì)胞之間或頂部特化而成的微褶細(xì)胞(或M細(xì)胞)，這些細(xì)胞的頂部微絨毛可以在基底外側(cè)部陷入相鄰的淋巴細(xì)胞。特定的抗原或與免疫附件相連的可溶性蛋白質(zhì)可以橫穿M細(xì)胞并通過其細(xì)胞內(nèi)部的管道進(jìn)入Peyer’s區(qū)并繼而激活免疫系統(tǒng)(Muir A.and Ramiya V.，1996)。繼而，許多種與耐受性或免疫性相關(guān)的效應(yīng)T細(xì)胞被激活，其中就包括了分泌細(xì)胞因子TGF-β的T細(xì)胞，從而使口服耐受性受到激活。對(duì)小鼠的腸環(huán)模型電鏡觀察實(shí)驗(yàn)表明，侵入的沙門氏菌可以穿過M細(xì)胞進(jìn)入腸壁，它們抵抗了免疫清除并因此進(jìn)入基底膜而在腸道上皮組織內(nèi)散播引發(fā)腸炎。那么，稀釋以后，沙門氏菌就可以作為一種介導(dǎo)抗原進(jìn)入GALT并激活免疫反應(yīng)的途徑(McGheeJ.R.et al.，1992)。同時(shí)，散布于腸細(xì)胞內(nèi)的樹狀細(xì)胞也可將腸腔以內(nèi)的抗原攝入，并通過淋巴系統(tǒng)的循環(huán)激活免疫反應(yīng)，但這個(gè)過程是誘發(fā)產(chǎn)生耐受性還是免疫性仍不清楚。
口服耐受性的治療由于可以引起抗原特異的免疫反應(yīng)而對(duì)疾病有一定的治療作用，但是它受到了一些實(shí)際問題而受到限制，即這種療法需要不論是人還是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都需要大量的蛋白質(zhì)抗原。為了解決這個(gè)問題，包括微生物發(fā)酵和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等幾種傳統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)都被進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然而它們都存在著方法自身的限制。細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的主要問題是它們無法進(jìn)行許多哺乳動(dòng)物蛋白所必須的翻譯后加工的過程，如糖基化。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)盡管克服了這個(gè)問題，但其高費(fèi)用的培養(yǎng)裝置和其相對(duì)較低的產(chǎn)量使得其費(fèi)用昂貴而不切實(shí)際。植物生物反應(yīng)器是這種情況下一種很理想的選擇，不僅因?yàn)樗梢源罅可a(chǎn)高質(zhì)量的目的蛋白質(zhì)并費(fèi)用低廉，而且轉(zhuǎn)基因植物可以作為運(yùn)輸自身抗原的一種簡(jiǎn)單而直接的方法。相比之下轉(zhuǎn)基因植物是一個(gè)可以大規(guī)模、低成本生產(chǎn)各種醫(yī)用蛋白的合適的候選系統(tǒng)。至今，已有許多重要的醫(yī)用蛋白，如人表皮生長(zhǎng)因子、胰島素、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腦啡肽、干擾素、人血清白蛋白、水蛭素等及多種抗體與疫苗已在植物中成功表達(dá)(李育陽(yáng)等，2001)。
用植物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。許多病毒抗原和細(xì)菌抗原基因已成功轉(zhuǎn)入植物中，并表達(dá)出有免疫活性的產(chǎn)物。例如，首次進(jìn)行用植物表達(dá)的外源疫苗進(jìn)行人體臨床實(shí)驗(yàn)的馬鈴薯中表達(dá)的腸毒性大腸桿菌的熱不穩(wěn)定腸毒素的B亞基(LT-B)，在給小鼠喂飼表達(dá)LT-B的馬鈴薯塊莖后，可誘導(dǎo)起血清抗體和粘膜抗體的產(chǎn)生。通過進(jìn)一步構(gòu)建適宜于植物的表達(dá)載體，使LT-B可累積至可溶蛋白的0.15％(Mason H.S.et al.，1998)。這個(gè)表達(dá)水平使得臨床的口服免疫實(shí)驗(yàn)得以進(jìn)行。臨床實(shí)驗(yàn)中，每天分別給志愿者服食50g或100g產(chǎn)LT-B的生馬鈴薯塊莖(約含0.5mg或1mg LT-B)，結(jié)果表明兩組志愿者中都產(chǎn)生了特異的抗LT-B的粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答(Tacket C.O.et al.，1998)。
在Arakawa T.等人(1998)的實(shí)驗(yàn)中，將胰島素原與霍亂弧菌毒素的無毒B亞單位(CTB)連接融合表達(dá)，并對(duì)馬鈴薯進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。CTB可以使植物合成的胰島素直接運(yùn)輸至腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)并激活粘膜免疫應(yīng)答和全身免疫應(yīng)答。該融合蛋白的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的塊根中約為可溶蛋白的0.1％。對(duì)NOD小鼠的飼服實(shí)驗(yàn)表明這種馬鈴薯可以使胰島炎癥(insulitis)產(chǎn)生一定的減輕，并明顯推遲了糖尿病的疾病進(jìn)程。
由此可見，利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服人胰島素具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供的就是一種利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人胰島素的方法，這種轉(zhuǎn)基因番茄可以方便地成為一種口服產(chǎn)品，用于防治某些胰島素依賴的和自體免疫障礙的糖尿病，而且可以從中提純出人胰島素做成注射用的劑型。

發(fā)明內(nèi)容
上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題是人胰島素基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量不高，且容易使轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的目的在于解決上述技術(shù)問題，提高轉(zhuǎn)基因植物中人胰島素基因的表達(dá)量，且使轉(zhuǎn)基因植物不會(huì)產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)移。為此，本發(fā)明的技術(shù)方案如下人工合成人胰島素基因，形成帶有所述基因的轉(zhuǎn)基因植物，且所述植物的植株中能夠產(chǎn)生所述胰島素；所述胰島素基因中的部分堿基用植物偏愛的密碼子替代，所述胰島素具有類似天然胰島素的三維結(jié)構(gòu)。
1.設(shè)計(jì)并人工合成人胰島素基因(1)為了提高人胰島素基因的表達(dá)量，該基因全部使用植物偏愛密碼子；(2)為了利于合成人胰島素可以正確折疊成天然的構(gòu)象，在人胰島素的A鏈與B鏈之間設(shè)計(jì)了一個(gè)6個(gè)氨基酸的柔性連接短肽以代替胰島素原的C肽。其設(shè)計(jì)原因如下對(duì)天然胰島素的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，B鏈C端和A鏈N端的空間線性距離為16.12埃，而線性排列的五肽的最小空間距離為16.0埃，為了不改變?nèi)诤系亩嚯逆溨蠥鏈和B鏈的構(gòu)象，推測(cè)它們之間的連接肽的最小殘基數(shù)應(yīng)不少于5個(gè)殘基?？紤]到B鏈C端和A鏈N端在空間上的取向相反，連接肽最好能形成β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。不同氨基酸在形成二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)具有不同的傾向和能力，其中Pro和Gly很少形成α-螺旋和β-折疊，而Prp，Gly，Asn，Ser在β-轉(zhuǎn)角的構(gòu)象中最常見，推測(cè)Gly-Pro-Ser的結(jié)構(gòu)最有可能形成β-轉(zhuǎn)角。故本實(shí)驗(yàn)中選用的連接肽序列為Gly-Gly-Pro-Ser-Gly-Gly。
2.在生菜中使用植物基因工程中最常用的花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子適用于大多數(shù)植物且啟動(dòng)能力很強(qiáng)。對(duì)于其它植物如蔬菜類和瓜果類的番茄、黃瓜、西瓜、甜瓜、茄子、南瓜、其他水果類植物如香蕉、蘋果、梨、菠蘿及塊根塊莖類植物如胡蘿卜、蘿卜、甘薯、木薯、馬鈴薯等，來源于花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子均能在這些植物中驅(qū)動(dòng)胰島素基因的表達(dá)。如果需要外源基因在特定的空間和時(shí)間中表達(dá)，就會(huì)用到一些器官和組織專一性表達(dá)的或受誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。為了提高mRNA的翻譯水平，需要對(duì)其基因的5’及3’調(diào)控信號(hào)，翻譯起始點(diǎn)處序列及密碼子的使用加以優(yōu)化。為了使外源基因適合于在植物中表達(dá)，有時(shí)甚至需要重新合成外源基因。
3.在番茄中使用果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A12(1)番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A12是通過PCR技術(shù)從番茄2A11基因啟動(dòng)子正調(diào)控區(qū)內(nèi)擴(kuò)增出了868bp的片段。2A11基因的mRNA在開花前一天的子房中即可檢測(cè)到，而完全成熟時(shí)果實(shí)中2A11mRNA水平占總mRNA的1％。而在其它組織和發(fā)育階段均未檢測(cè)到2A11的mRNA，說明該基因具有嚴(yán)格的組織專一表達(dá)特性(Van Haaren etal.，1993)。將2A12啟動(dòng)子與GUS基因融合轉(zhuǎn)入番茄，并用組織化學(xué)染色法對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、花器官等進(jìn)行了GUS活性分析，結(jié)果表明在該啟動(dòng)子調(diào)控下的GUS基因在果實(shí)組織中呈均一性表達(dá)，而在根、莖、葉中檢測(cè)不到GUS活性(甄偉，2000)。證實(shí)了2A12啟動(dòng)子在番茄果實(shí)中具有高度的啟動(dòng)子特異性，和很高的啟動(dòng)子活性，估計(jì)它的啟動(dòng)子活性是CaMV35S啟動(dòng)子的5-10倍。
(2)使用果實(shí)專一性啟動(dòng)子是為了使人胰島素基因只在番茄的果實(shí)中高效表達(dá)，避免了因?yàn)橥庠椿蛟诜阎仓甑乃薪M織中組成型表達(dá)而導(dǎo)致的植物資源被大量消耗、植物的正常代謝紊亂和由于外源蛋白的大量累積而對(duì)植物細(xì)胞造成的毒性。從而保證該轉(zhuǎn)基因番茄在正常生長(zhǎng)的同時(shí)大量生產(chǎn)合成人胰島素。
4.在合成人胰島素的C端加上了KDEL(四個(gè)氨基酸殘基)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列，避免了胰島素在植物細(xì)胞中的降解。
在所設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)序列后加上KDEL的末尾，其優(yōu)點(diǎn)有以下幾點(diǎn)(1)所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而方便分離與純化；(2)往往隨著植物的生長(zhǎng)，累積在植物細(xì)胞質(zhì)中的外源蛋白會(huì)逐漸被降解，這種方法可以避免合成人胰島素的降解；(3)植物與動(dòng)物細(xì)胞間蛋白質(zhì)的糖基化的不同是一個(gè)重要的問題，因?yàn)橹参镏胁槐匾奶腔锌赡苁雇庠吹鞍自隗w內(nèi)產(chǎn)生不需要的免疫反應(yīng)。在對(duì)植物與動(dòng)物中糖基化過程的比較中發(fā)現(xiàn)，兩者在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成高甘露糖核心的過程類似，而主要區(qū)別在于其后高爾基體內(nèi)復(fù)雜多糖的合成途徑。這種方法可以使蛋白質(zhì)滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而避免復(fù)雜多糖的合成。
5.以番茄、生菜作為生物反應(yīng)器番茄和生菜是世界上普遍栽培的蔬菜，容易培養(yǎng)且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，可以周年生產(chǎn)。同時(shí)由于它可以生食，可以直接作為口服疫苗的載體將疫苗運(yùn)輸?shù)侥c道以激活免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。以植物細(xì)胞直接作為載體的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其堅(jiān)硬的細(xì)胞壁可以在穿過消化道時(shí)對(duì)其所攜帶的抗原產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，使其直到運(yùn)輸至腸道時(shí)才逐漸被釋放。
這里應(yīng)特別指出的是，雖然在本發(fā)明的下述實(shí)施例中以轉(zhuǎn)基因番茄、生菜和煙草的產(chǎn)生及檢測(cè)舉例進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明，但這絕不意味本發(fā)明制備的人工合成人胰島素基因及其所用的植物表達(dá)載體只用于轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生含人胰島素的番茄、生菜和煙草，因?yàn)楸景l(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)在于植物偏愛密碼子人胰島素基因的設(shè)計(jì)、CaMV35S啟動(dòng)子和果實(shí)專一性啟動(dòng)子p2A12的應(yīng)用、KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列的應(yīng)用和定位重組系統(tǒng)的應(yīng)用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用已知的方法將構(gòu)建好的含本發(fā)明的人胰島素基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化番茄、生菜、煙草及其它植物。因此，使用本發(fā)明所構(gòu)建的人胰島素基因及植物表達(dá)載體所獲得的含有人胰島素的植物，均在本發(fā)明的權(quán)利要求內(nèi)，這些植物包括蔬菜類和瓜果類作物如番茄、生菜、黃瓜、西瓜、甜瓜、茄子、南瓜、其他水果類植物如香蕉、蘋果、梨、菠蘿及塊根塊莖類植物如胡蘿卜、蘿卜、甘薯、木薯、馬鈴薯等。
本發(fā)明提供一種利用轉(zhuǎn)基因番茄、生菜和煙草做為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人胰島素方法。包括依據(jù)植物偏愛密碼子的原則來設(shè)計(jì)所含的密碼子，通過人工合成若干DNA片段，拼接而成一個(gè)連續(xù)的開放讀碼框(ORF)，這個(gè)開放讀碼框即為合成的人胰島素基因，該基因用6個(gè)氨基酸(GGPSGG)連接胰島素的B鏈和A鏈，并在胰島素的C端加上KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列；以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的植物常用的CaMV35S啟動(dòng)子(花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)為該基因啟動(dòng)子，以Nos polyA為終止子，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAM35S-InsK；以番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A12為該基因啟動(dòng)子，以Nos polyA為終止子，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAM2A12-InsK；將pCAM35S-InsK和pCAM2A12-InsK分別通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404菌種中；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將人胰島素基因轉(zhuǎn)入番茄、生菜和煙草的愈傷組織中，再生出轉(zhuǎn)基因植株；對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR和ELISA檢測(cè)，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因番茄、生菜和煙草，其中利用CaMV35S啟動(dòng)子所得的轉(zhuǎn)基因番茄、生菜和煙草在整株植株中均表達(dá)人胰島素，利用番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A12所得的轉(zhuǎn)基因番茄在果實(shí)中大量表達(dá)人胰島素。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)于人胰島素基因的合成，選用植物偏愛的密碼子。為此在人胰島素A鏈63個(gè)堿基中更換了13個(gè)堿基。在B鏈90個(gè)堿基中更換了18個(gè)堿基，另外在3’端加上了12個(gè)堿基編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列KDEL。在A鏈與B鏈之間我們?cè)O(shè)計(jì)了6個(gè)氨基酸的連接片段，這6個(gè)氨基酸為GGPSGG。此連接片段的氨基酸種類及順序的設(shè)計(jì)原則是保持人胰島素天然的三維結(jié)構(gòu)特征。我們將人工合成的包含人胰島素A鏈與B鏈及中間小段連接順序克隆于pGEM-11Z載體中的EcoRI和BamHI位點(diǎn)，并經(jīng)質(zhì)粒酶切圖譜的分析及序列分析加以確定，該質(zhì)粒命名為p11Z-InsK。在這一實(shí)施方案中，人胰島素基因片段可以通過PCR擴(kuò)增得到，擴(kuò)增時(shí)，使用的引物如下InsK 5’5’-GAT CCA TGT TCG TTA ACC AAC ACC-3’InsK 3’5’-CTC GTC CTT GTT GCA GTA GTT CTC-3’。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，植物偏愛密碼子的設(shè)計(jì)不僅包括胰島素A鏈中63個(gè)堿基中更換了13個(gè)堿基，在B鏈90個(gè)堿基中更換了18個(gè)堿基，也應(yīng)包括其它更換了一定數(shù)量堿基，符合植物偏愛密碼子原則。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，人工合成的胰島素基因不僅限于植物密碼子的應(yīng)用，應(yīng)擴(kuò)展到其它有利于表達(dá)量提高的基因結(jié)構(gòu)改造。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，加在人工合成胰島素基因3’端的堿基不僅包括編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列KDEL四個(gè)氨基酸的12個(gè)堿基，也應(yīng)包括其它類似的目的是為了使胰島素滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的其它多個(gè)氨基酸順序。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，在A鏈與B鏈之間的氨基酸連接不僅包括GGPSGG這6個(gè)氨基酸順序，也應(yīng)包括其它目的是為了表達(dá)的胰島素能折疊成類似天然胰島素三維結(jié)構(gòu)的多個(gè)氨基酸順序。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，胰島素結(jié)構(gòu)的改造除了胰島素的B鏈和A鏈以GGPSGG這6個(gè)氨基酸形成的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)或其它可形成轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的幾個(gè)氨基酸連接外，還包括B鏈和A鏈之間自主的斷裂結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，以及將B鏈和A鏈的編碼順序分別放在不同的轉(zhuǎn)錄單位之中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，人胰島素基因置于組成型表達(dá)啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)子的調(diào)控之下，再轉(zhuǎn)入中間載體中。再進(jìn)一步轉(zhuǎn)入雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390，完成一個(gè)植物表達(dá)載體的構(gòu)建(見


圖1、人工合成的人胰島素基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖。其中人胰島素基因處于組成型啟動(dòng)子CaMV35S的控制下)。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，驅(qū)動(dòng)人胰島素基因的啟動(dòng)子除了組成型表達(dá)啟動(dòng)子CaMV35S外，還應(yīng)包括其它目的是為了驅(qū)動(dòng)胰島素基因在植物中高效表達(dá)的啟動(dòng)子如泛素Ubiqutin啟動(dòng)子，actin啟動(dòng)子等。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，構(gòu)建所選用的原始植物表達(dá)載體為CAMBIA公司的pCAMBIA1390表達(dá)載體，其植物篩選標(biāo)記基因?yàn)閔ptII，編碼潮霉素(htgromycin)抗性蛋白。HptII編碼區(qū)的啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子，終止子為CaMV35S polyA。驅(qū)動(dòng)胰島素基因的啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子，終止子為nos polyA。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，構(gòu)建所選用的原始植物表達(dá)載體除了CAMBIA公司的pCAMBIA1390表達(dá)載體外，還可以選用CAMBIA公司的其它表達(dá)載體或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所構(gòu)建的其它常用的植物表達(dá)載體如pGPTV系列，pBI系列pCB系列等。這些植物表達(dá)載體的標(biāo)記基因?yàn)閔ptII、NPTII和bar。HptII基因的編碼產(chǎn)物提供了潮霉素抗性功能，NPTII基因的編碼產(chǎn)物提供了卡那霉素抗性功能，bar基因的編碼產(chǎn)物提供了除草劑抗性功能。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，人胰島素基因置于果實(shí)專一性啟動(dòng)子p2A12的調(diào)控之下，再轉(zhuǎn)入中間載體中。再進(jìn)一步轉(zhuǎn)入雙元表達(dá)載體，完成一個(gè)植物表達(dá)載體的構(gòu)建(見圖2、人工合成的人胰島素基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖。其中人胰島素基因處于果實(shí)專一性啟動(dòng)子p2A12的控制下)。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，驅(qū)動(dòng)人胰島素基因的啟動(dòng)子除了果實(shí)專一性啟動(dòng)子P2A12外，還應(yīng)包括目的是為了在植物某個(gè)或某些特定組織器官中高效表達(dá)胰島素的其它啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子同時(shí)滿足了胰島素基因在不同植物中表達(dá)。這些植物包括蔬菜類和瓜果類作物如番茄、生菜、黃瓜、西瓜、甜瓜、茄子、南瓜、其他水果類植物如香蕉、蘋果、梨、菠蘿及塊根塊莖類植物如胡蘿卜、蘿卜、甘薯、木薯、馬鈴薯等。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，構(gòu)建所選用的原始植物表達(dá)載體為CAMBIA公司的pCAMBIA1390表達(dá)載體，其植物篩選標(biāo)記基因?yàn)閔ptII，編碼潮霉素(htgromycin)抗性蛋白。HptII編碼區(qū)的啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子，終止子為CaMV35S polyA。驅(qū)動(dòng)胰島素基因的啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子，終止子為nos polyA。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，構(gòu)建所選用的原始植物表達(dá)載體除了CAMBIA公司的pCAMBIA1390表達(dá)載體外，還可以選用CAMBIA公司的其它表達(dá)載體或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所構(gòu)建的其它常用的植物表達(dá)載體如pGPTV系列，pBI系列pCB系列等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉的技術(shù)操作，不是本發(fā)明的關(guān)鍵。通過PCR檢測(cè)陽(yáng)性的農(nóng)桿菌菌株，用于轉(zhuǎn)化番茄、生菜和煙草。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，所選用的農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，所選用的農(nóng)桿菌菌株除了LBA4404外，還應(yīng)包括農(nóng)桿菌的其它菌株。這些菌株的特征是本身含有Vir毒性蛋白區(qū)，能夠幫助轉(zhuǎn)入的植物表達(dá)載體中的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物的基因組中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化番茄、生菜和煙草的方法為均為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法。挑取轉(zhuǎn)化了植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于Km50mg/L YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，165rpm培養(yǎng)過夜。當(dāng)菌液濃度至OD600為0.2～0.6時(shí)，將預(yù)培養(yǎng)2天的番茄莖段和葉片外植體侵染3～5分鐘，取出置于無菌濾紙上略微吸干，接到不含抗生素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)兩天左右，然后接種到Hyg(潮霉素)5mg/L，Cb500mg/L的篩選培養(yǎng)基中，隨后每繼代一次，最終在合適hyg濃度的篩選培養(yǎng)基中篩選抗性芽。未經(jīng)侵染的、其他培養(yǎng)條件均相同的植株莖段和葉片外植體作對(duì)照。待轉(zhuǎn)化再生植株長(zhǎng)到2～3cm左右時(shí)，將其接入附加Hyg5mg/l、Cb500mg/l的生根培養(yǎng)基中生根。
根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施方案，植物篩選所用的抗生素除了潮霉素，還包括卡那霉素和除草劑，具體選用何種篩選要看選用植物表達(dá)載體所對(duì)應(yīng)的標(biāo)記基因。如選用pCAMBIA1390載體則篩選標(biāo)記為潮霉素(Hyg)，選用pCAMBIA2390載體則篩選標(biāo)記為卡那霉素(Km)，選用pCAMBIA3390載體則篩選標(biāo)記為除草劑。
本發(fā)明用于靶植物的實(shí)際轉(zhuǎn)化方法對(duì)本發(fā)明不是關(guān)鍵，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種不同的轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組DNA序列導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化的靶植物細(xì)胞。這些方法包括但并不僅限于農(nóng)桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參考有關(guān)文獻(xiàn)得到詳情。最好使被轉(zhuǎn)化的序列穩(wěn)定的整合到靶植物細(xì)胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟失。另外，用于轉(zhuǎn)化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環(huán)形或其它重組載體的形式如人工染色體的形式存在。
用于將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成整個(gè)植株的方法對(duì)本發(fā)明不是關(guān)鍵，可以使用任何對(duì)靶植物合適的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參考有關(guān)文獻(xiàn)得到詳情。
本發(fā)明的有益效果如下(1)植物是高等的真核生物，可以類似于哺乳動(dòng)物的對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊、糖基化和組裝，這對(duì)于具有體內(nèi)活性的醫(yī)用動(dòng)物蛋白的生產(chǎn)十分重要；(2)與微生物發(fā)酵和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不同的是，植物的生長(zhǎng)不受培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)基的限制。通過農(nóng)業(yè)的方法，實(shí)際治療和實(shí)驗(yàn)所需的蛋白質(zhì)的量可以很容易并的達(dá)到并且費(fèi)用低廉(3)對(duì)于一個(gè)地區(qū)的種植方法可以本地化，由于許多可食植物容易再生，作物可以無限制的種植下去，解決了長(zhǎng)途運(yùn)輸傳統(tǒng)疫苗配劑、保持途中和目的地冷藏環(huán)境所面臨的難題；(4)植物作為反應(yīng)器可以輕易的避免動(dòng)物病原體的感染，而用其他方法生產(chǎn)，為了消除感染的可能性，一般需要高溫滅菌，而與此同時(shí)使得部分蛋白質(zhì)失活；(5)更重要的是，植物的可食部分可以直接作為口服耐受治療的載體，從而避免了高費(fèi)用的提取及下游純化過程，而且使得對(duì)于侯選自身抗原的運(yùn)輸變得簡(jiǎn)單易行；(6)并且由于可食疫苗不需要任何注射器，既避免了使用注射器的相對(duì)費(fèi)用，也避免了由注射器污染的可能性而帶來的其他疾病的傳染。
在GENEBANK中找到人胰島素原的序列，從中得到人胰島素A鏈和B鏈的序列，并根據(jù)植物偏愛密碼子，設(shè)計(jì)替換堿基。在設(shè)計(jì)好的合成人胰島素的B鏈和A鏈之間加入設(shè)計(jì)好的連接短肽；在B鏈前加上起始密碼子ATG，A鏈后加上編碼KDEL的DNA序列及終止密碼子TAA；并在該合成基因的前后分別加上兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI；就得到了所設(shè)計(jì)合成的人胰島素基因。
將合成人胰島素基因的雙鏈分成8段(見表2)，使得兩條鏈5’端的一端略短，同時(shí)可作為PCR反應(yīng)的引物，另外3’端略長(zhǎng)，彼此相互重疊并覆蓋基因全長(zhǎng)。注意分段時(shí)盡量以G、C作為結(jié)尾。
(1)將每管(2.5OD)的合成寡核苷酸片段依上表用無菌水進(jìn)行稀釋，使得每一條寡核苷酸鏈的終濃度為0.11nmol/ul；(2)5’端加磷反應(yīng)上述8管各取10ul分別加入0.5ml的Eppendorf管中，在冰上放置15min，其后進(jìn)行加磷反應(yīng)。加磷反應(yīng)于37℃反應(yīng)1hr以上，其體系為25ul體系寡聚核苷酸片段 10ulT4寡聚核苷酸激酶(稀釋10倍) 2.5ul10×緩沖溶液 2.5ul無菌水 10ul(3)退火將加磷后的8個(gè)片段各取5ul，加入0.2ml Eppendorf管中，再加入10ul 10×T4連接酶緩沖溶液及15ul無菌水，混勻95C放置10min，用沸水浴逐漸冷卻至室溫，后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱，慢慢冷卻；用EcoRI和BamHI消化pGEM-11Z載體，酶切過夜后補(bǔ)無菌水400ul，用2倍無水乙醇沉淀，其后溶解至30ul。酶切體系為100ul體系pGEM-11Z質(zhì)粒 59ul10×緩沖溶液 10ulEcoRI 3ulBamHI 3ulRnase 4ul無菌水 21ul將退火后的體系取出，冰上放置10min，再加入載體pGEM-11Z酶切后沉淀的大片段27ul及8ul T4 DNA連接酶(3U/ul)，16℃連接過夜?？偨Y(jié)連接體系為100ul體系；寡核苷酸鏈 8×5ul載體大片段 27ul10×連接酶緩沖溶液 10ulT4 DNA連接酶 8ul無菌水 15ul用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，并利用藍(lán)白篩和PCR反應(yīng)對(duì)重組子進(jìn)行鑒定。具體操作見植物表達(dá)載體構(gòu)建的基本方法。對(duì)鑒定陽(yáng)性的重組子進(jìn)行測(cè)序，與設(shè)計(jì)序列核對(duì)無誤后，將其命名為p11Z-InsK。實(shí)施例2植物表達(dá)載體pCAM35S-InsK的構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAM35S-InsK的構(gòu)建流程見
圖1
(1)分別將含有35S啟動(dòng)子的pBI221質(zhì)粒及p1IZ-InsK質(zhì)粒用HindIII和XbaI進(jìn)行完全酶切，瓊脂糖凝膠電泳后分別回收載體和插入片段，按插入片段載體片段摩爾比3∶1進(jìn)行連接，使35S插入合成人胰島素基因的上游，將其命名為p11Z-InsK-35S；(2)分別將構(gòu)建好的含有35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的胰島素基因的p11Z-InsK-35S和植物表達(dá)在載體pCAMBIA1390用HindIII和EcoRI進(jìn)行完全酶切，連接后得到植物表達(dá)載體pCAM35S-InsK。
HinidIII和BamHI雙酶切切出0.gkb的小片段，PCR擴(kuò)增亦能得到0.8kb的小片段，證明載體的構(gòu)建是正確的。實(shí)施例3植物表達(dá)載體pCAM2A12-InsK的構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAM35S-InsK的構(gòu)建流程見圖2(1)分別將含有2A12啟動(dòng)子的pTM質(zhì)粒及p11Z-InsK質(zhì)粒用HindIII和XbaI進(jìn)行完全酶切，瓊脂糖凝膠電泳后分別回收載體和插入片段，按插入片段載體片段摩爾比3∶1進(jìn)行連接，使2A12插入合成人胰島素基因的上游，將其命名為p11Z-InsK-2A12；(2)分別將構(gòu)建好的含有2A12啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的胰島素基因的p11Z-InsK-2A12和植物表達(dá)在載體pCAMBIA1390用HindIII和EcoRI進(jìn)行完全酶切，連接后得到植物表達(dá)載體pCAM2A12-InsK。
HinidIII和BamHI雙酶切切出0.8kb的小片段，PCR擴(kuò)增亦能得到0.8kb的小片段，證明載體的構(gòu)建是正確的。(P2A12和CaMV35S的大小相似)實(shí)施例4土壤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備(1)將土壤農(nóng)桿菌菌株LBA4404接種子含適當(dāng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；(2)4℃，8,000rpm離心5分鐘，收集菌體于小離心管中；(3)用600ul冰預(yù)冷的500mM CaCl2重懸洗滌細(xì)胞；(4)4℃，8,000rpm離心5分鐘，細(xì)胞沉淀中加入200ul冰預(yù)冷的500mM CaCl2，混勻后備用(24hr至48hr使用最佳)；土壤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化(1)分別加入約1ug構(gòu)建好的植物表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，于液氮中速凍5分鐘，然后37℃溫育5分鐘；(2)加入600ul YEB液體培養(yǎng)基，28℃輕搖2-4小時(shí)；(3)取200ul菌液均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的YEB選擇平板上，28℃倒置培養(yǎng)兩天。挑幾個(gè)菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到陽(yáng)性菌株。實(shí)施例5番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生外植體的制備(1)選取飽滿的番茄種子，用70％乙醇處理1分鐘；(2)用20％次氯酸納溶液處理20分鐘進(jìn)行表面滅菌，并用無菌水清洗3-5遍；(3)播種于番茄固體培養(yǎng)基[普通MS培養(yǎng)基]上，10-14天后兩片子葉完全展開時(shí)用于轉(zhuǎn)化。葉盤法轉(zhuǎn)化番茄及植株再生(1)在靠近疫病1/3處剪取番茄子葉作為外殖體，浸入帶有目的基因的土壤農(nóng)桿菌稀釋液中侵染20分鐘，期間輕輕搖動(dòng)；(2)用無菌濾紙吸去多余的菌液，轉(zhuǎn)移這些葉片于番茄培養(yǎng)基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)+Cb(500)，單位為mg/L]中暗培養(yǎng)兩天；(3)后將葉片外殖體轉(zhuǎn)入[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)，單位為mg/L]中，于25℃光照培養(yǎng)；(4)繼代培養(yǎng)多次后愈傷組織長(zhǎng)出番茄小苗，待小苗稍大后剪下插入1/2MS培養(yǎng)基中生根。
(5)待根系發(fā)達(dá)后移栽入盆中，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。
PCR鑒定證明胰島素基因整合到番茄的基因組中，ELISA檢測(cè)證明胰島素基因在轉(zhuǎn)基因番茄中高效表達(dá)。實(shí)施例6生菜的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生生菜的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生外植體的制備(1)選取飽滿的生菜種子，用70％乙醇處理1分鐘；(2)用20％次氯酸納溶液處理20分鐘進(jìn)行表面滅菌，并用無菌水清洗3-5遍；(3)播種于生菜固體培養(yǎng)基[普通MS培養(yǎng)基]上，10-14天后兩片子葉完全展開時(shí)用于轉(zhuǎn)化。葉盤法轉(zhuǎn)化生菜及植株再生
(1)選取稍大的生菜葉片，剪成0.5平方厘米的小塊，浸入帶有目的基因的土壤農(nóng)桿菌稀釋液中侵染20分鐘，期間輕輕搖動(dòng)；(2)用無菌濾紙吸去多余的菌液，轉(zhuǎn)移這些葉片于生菜培養(yǎng)基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)+Cb(500)，單位為mg/L]中暗培養(yǎng)兩天；(3)后將葉片外殖體轉(zhuǎn)入SM2中，于25℃光照培養(yǎng)；(4)繼代培養(yǎng)多次后愈傷組織長(zhǎng)出生菜小苗，待小苗稍大后剪下插入1/2MS培養(yǎng)基中生根。
(5)待根系發(fā)達(dá)后移栽入盆中，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。
PCR鑒定證明胰島素基因整合到生菜的基因組中，ELISA檢測(cè)證明胰島素基因在轉(zhuǎn)基因生菜中高效表達(dá)。實(shí)施例7煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及植株再生(1)接種農(nóng)桿菌單菌落于含適當(dāng)抗生素的2ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)1-2天，轉(zhuǎn)接入40ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.5，8,000g離心10分鐘，菌體用40ml MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。
(2)取無菌煙草葉片和不含腋芽的莖段，于MS固體培養(yǎng)基中25℃預(yù)培養(yǎng)一天。
(3)重新取出材料，用剪刀切成小塊放入無菌MS液體培養(yǎng)基稀釋過的農(nóng)桿菌中，浸泡15-20分鐘，其間輕搖幾次。
(4)用無菌濾紙吸去多余菌液，于煙草培養(yǎng)基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)+Cb(500)，單位為mg/L]中25℃暗培養(yǎng)兩天。
(5)把材料轉(zhuǎn)入煙草培養(yǎng)基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)，單位為mg/L]中，25℃光照培養(yǎng)至分化出愈傷組織，直至長(zhǎng)出芽；每14-20天繼代培養(yǎng)一次；(6)將長(zhǎng)至3-5cm的芽轉(zhuǎn)入煙草生根培養(yǎng)基[1/2MS培養(yǎng)基]上誘導(dǎo)生根；(7)約2-3周后根系形成，移栽于滅菌的土壤中培養(yǎng)。
PCR鑒定證明胰島素基因整合到煙草的基因組中，ELISA檢測(cè)證明胰島素基因在轉(zhuǎn)基因生菜中高效表達(dá)。實(shí)施例8采用定位重組系統(tǒng)Cre/lox和FLP/FRT來控制胰島素基因在F2代中的刪除在親本1中轉(zhuǎn)入果實(shí)專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的胰島素基因，該啟動(dòng)子和胰島素的兩側(cè)為同向的LoxP元件(Cre重組酶識(shí)別元件)，同時(shí)將銅誘導(dǎo)性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)FLP基因的載體轉(zhuǎn)入親本1中；在親本2中轉(zhuǎn)入胚胎專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶基因，在啟動(dòng)子和Cre重組酶之間為阻斷序列，且該阻斷序列兩側(cè)為同向的FRT元件(FLP重組酶識(shí)別元件)。將親本1和親本2雜交，在0.5μM銅離子的誘導(dǎo)下，在F1代植株中由于FLP重組酶的作用刪除兩個(gè)FRT元件之間的阻斷序列，在F1代發(fā)育至種子形成階段，在胚珠中由于Cre重組酶的作用，可表達(dá)人胰島素的序列由于在兩個(gè)同向的LoxP元件之間，從而被刪除。具體過程見圖3。實(shí)施例9通過定位重組系統(tǒng)與激素調(diào)節(jié)的共同作用使產(chǎn)生人胰島素的番茄不能正常結(jié)實(shí)將含有果實(shí)專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)胰島素基因及胚胎專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre重組酶基因的植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)入親本1；在親本2中轉(zhuǎn)入胚胎專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ipt基因(異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)素)，在啟動(dòng)子和ipt基因之間為阻斷序列，且該阻斷序列兩側(cè)為同向的LoxP元件(Cre重組酶識(shí)別元件)。將親本1和親本2雜交，在F1代胚胎發(fā)育過程中，由于Cre重組酶的作用刪除了兩個(gè)同向LoxP元件之間的阻斷序列，使得ipt基因能在F2代中促進(jìn)植物細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)素，干擾了種子的形成，使得番茄不能正常產(chǎn)生種子。具體過程見圖4。實(shí)施例10轉(zhuǎn)基因植株的鑒定與檢測(cè)植物基因組DNA的制備(1)稱取0.1g植物葉片或莖組織，于研缽中快速用液氮研至粉末并轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，立即加入500ul的提取緩沖液(500mM NaCl，50mM Tris-Cl PH8.0，50mM EDTA，1％(V/V)β-巰基乙醇)，輕輕混勻；(2)解凍后放置于冰上，加入冰冷20％存貯液PVP(存于-20℃)至終濃度為6％。
(3)加入50ul 20％SDS，輕輕混勻后于65℃水浴10分鐘；(4)加入250ul 5M KAc于冰上反應(yīng)30分鐘，離心(15000rpm，10分鐘，4℃)。
(5)取上相轉(zhuǎn)入一新的離心管，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻三次，再置于冰上10分鐘。離心(15000rpm，10分鐘，4℃)，棄去上清；(6)沉淀物抽真空或室溫吹干后，溶解于500ul 1×TE(pH8.0)。用1倍體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一至兩次，取上相；(7)離心(12000rpm，10分鐘，20℃)，取上相轉(zhuǎn)入一新的離心管；(8)加入1倍體積的異丙醇(20℃，5分鐘)，并將管至少顛倒5次；
(9)離心(15000rpm，10分鐘，4℃)，用70％乙醇沖洗沉淀物，抽真空或吹干，最后溶于適量TE(pH8.0)中。轉(zhuǎn)基因番茄、生菜及煙草的PCR鑒定得到完整的pCAM35S-InsK轉(zhuǎn)基因番茄、生菜和煙草后，在生長(zhǎng)初期，取轉(zhuǎn)基因番茄、生菜和煙草葉片并用SDS法提取植株的總DNA進(jìn)行PCR鑒定，以合成人胰島素基因兩端引物擴(kuò)增合成人胰島素基因片段，可以得到約180bp的條帶，說明合成人胰島素基因已整合至轉(zhuǎn)基因植株的基因組。(見圖5轉(zhuǎn)基因番茄、生菜及煙草的PCR鑒定)果實(shí)專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因番茄的PCR鑒定得到完整的pCAM2A12-InsK轉(zhuǎn)基因番茄后，在生長(zhǎng)初期，取轉(zhuǎn)基因番茄葉片并用SDS法提取番茄的總DNA進(jìn)行PCR鑒定，以合成人胰島素基因兩端引物擴(kuò)增合成人胰島素基因片段，可以得到約180bp的條帶，說明合成人胰島素基因已整合至番茄的基因組。(見圖5轉(zhuǎn)基因生菜、番茄及煙草的PCR鑒定)實(shí)施例11轉(zhuǎn)基因植株的ELISA檢測(cè)溶液的準(zhǔn)備1)包被液50mM Na2CO3-NaHCO3，pH9.62)洗滌液0.05％Tween-20，0.01M磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)，pH7.43)封閉液1-2％牛血清白蛋白，洗滌液4)一抗溶液取一瓶兔的抗血清干粉制劑，加入1ml洗滌液溶解，臨用前用洗滌液稀釋10倍5)二抗溶液山羊抗兔IgG-AP，臨用前用洗滌液稀釋2000倍6)顯色緩沖液0.1M NaCl，0.05M MgCl2，0.1M Tris-HCl，pH9.57)顯色液30ml顯色緩沖液，50μl NBT/BCIP[含33μl NBT貯存液(100mg NBT，2ml 70％DMF)和17μl BCIP貯存液(100mg BCIP，2ml 100％DMF)]8)終止液0.15M NaCl，0.1M馬來酸，用NaOH調(diào)至pH7.5ELISA檢測(cè)的具體步驟為1)包被將轉(zhuǎn)人胰島素基因的番茄、生菜和煙草的材料與未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照(約0.1-0.2g濕重)放于Effendorf管中，加液氮冷凍數(shù)秒后將其充分研碎，加入500μl包被液，混勻后12000rpm離心5min，取上清，用包被液適當(dāng)稀釋后各加100μl于反應(yīng)孔中，同時(shí)加入100μl洗滌液為空白對(duì)照，加蓋后置4℃過夜或37℃恒溫箱溫浴2h。
2)封閉棄去孔內(nèi)液體，每孔中加200μl洗滌液，靜置3min后棄去，重復(fù)3次，扣在濾紙上吸干水分。每孔加入200μl封閉液，加蓋后置37℃恒溫箱1h，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次。
3)加入一抗取100μl一抗溶液加于孔中，加蓋后置37℃恒溫箱1-2h，用洗滌液洗滌3次。
4)加入二抗取100μl二抗溶液加于孔中，加蓋后置37℃恒溫箱1-2h，用洗滌液洗滌3次，用顯色緩沖液洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。
5)顯色每孔加入100μl顯色液，反應(yīng)板置于室溫暗處進(jìn)行顯色反應(yīng)，每孔加入50μl終止液終止反應(yīng)。
以未轉(zhuǎn)基因的番茄、生菜和煙草為對(duì)照，對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)基因的番茄、生菜和煙草株系進(jìn)行了酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株均有較強(qiáng)的免疫活性，在對(duì)照中僅有很弱的非特異吸附，說明人胰島素基因在轉(zhuǎn)基因植株中高水平表達(dá)，人胰島素在生菜中平均含量為占可溶蛋白的0.3％，人胰島素在番茄果實(shí)中的平均含量為占可溶蛋白的0.8％，人胰島素在煙草中平均含量為占可溶蛋白的0.3％。為提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，反應(yīng)各步均應(yīng)充分洗滌，以除去殘留物、減少非特異性吸附，還應(yīng)固定洗滌次數(shù)及放置時(shí)間，避免震蕩或相互污染。另外，為使顯色反應(yīng)便于比較，顯色時(shí)置室溫暗處的時(shí)間應(yīng)一致。實(shí)施例12從轉(zhuǎn)基因番茄、生菜和煙草中提取人胰島素整個(gè)操作過程在GMP標(biāo)準(zhǔn)的車間中進(jìn)行。采摘成熟的轉(zhuǎn)基因番茄、新鮮的生菜葉片或新鮮的煙草葉片，表面消毒后用無菌蒸餾水洗凈，切成碎片后加82％乙醇，于10～12℃加入12mol/L硫酸，調(diào)pH2.8～3.0，攪拌提取0.5h。加入6mol/L鹽酸調(diào)pH至2.0，繼續(xù)攪拌提取2.5h，分離殘?jiān)?，殘?jiān)尤?5％乙醇，用6mol/L鹽酸調(diào)pH2.0，10～12℃攪拌提取2h，分離殘?jiān)?。合?次提取液。
堿化 提取液冷至0～5℃，用濃氨水調(diào)pH7.8～8.0，加入硅藻土，板框壓濾，隨即用混合酸(鹽酸4000ml、硫酸1000ml、水4000ml)酸化至pH2.5，待沉淀完全后虹吸清液，吊濾，除去沉淀，溫度控制在0～3℃。
第一次鋅沉淀 清液加入氯化鋅溶液(先配成30～50％溶液，用6mol/L鹽酸調(diào)pH2.5后加入)，溫度2～4℃，待沉淀完全后，虹吸清液，吊濾，除去沉淀，清液用濃氨水調(diào)pH至6.8～7.0，于5℃過夜。
脫脂、鹽析 次日虹吸除去清液，沉淀過濾、收集，溶于5倍量蒸餾水，用6mol/L鹽酸調(diào)pH2.7～2.8，12～15℃放置。次日放出下層清液(回收下層清液，供下批鋅沉淀溶解用)，清液用6mol/L鹽酸調(diào)pH至2.5，再加入16％氯化鈉鹽析，過濾，收集第二次鹽析物。
30％丙酮分級(jí)沉淀 第2次鋅沉淀鹽析物溶于7倍量水中，加入3倍量丙酮，用4mol/L氨水調(diào)pH4.5，冷至0～5℃過夜，除去沉淀(沉淀另行回收)，清液用4mol/L氨水調(diào)pH6.0，加入20％醋酸鋅，析出白色沉淀。
結(jié)晶 過濾收集沉淀，按下列配方結(jié)晶2％檸檬酸500ml，20％醋酸鋅6.5ml，丙酮160ml，蒸餾水稀釋至1000ml，結(jié)晶液冷卻至0～5℃，用4mol/L氨水堿化至pH8.0，過濾除去沉淀。用10％檸檬酸調(diào)節(jié)pH6.0，攪拌結(jié)晶兩天，虹吸除去清液，離心，收集，結(jié)晶，用蒸餾水洗2次，丙酮洗2次，五氧化二磷真空干燥。實(shí)施例13NOD小鼠的飼服實(shí)驗(yàn)NOD小鼠是I型糖尿病的小鼠模型，雌性NOD小鼠在約30周后有75-85％會(huì)自發(fā)的發(fā)生I型糖尿病。通過對(duì)NOD小鼠的短期飼服實(shí)驗(yàn)，用5周齡小鼠每星期5mg用量飼服5周，后取胰腺切片進(jìn)行電鏡觀察，比較飼服合成人胰島素轉(zhuǎn)基因的生菜葉片、煙草蛋白提取液或番茄果實(shí)的NOD小鼠與對(duì)照組胰腺β細(xì)胞的損傷狀況，并依此判斷其是否有效。試驗(yàn)表明，飼服轉(zhuǎn)基因植物的NOD小鼠β細(xì)胞的損傷狀況要明顯好于飼服未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照組。
通過對(duì)NOD小鼠的長(zhǎng)期飼服實(shí)驗(yàn)，每周5mg持續(xù)飼服，或飼服幾周后停止，每周對(duì)NOD小鼠的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行糖尿病發(fā)病率的檢測(cè)及記錄，比較并判斷該飼服實(shí)驗(yàn)是否推遲或預(yù)防了NOD小鼠I型糖尿病的發(fā)生。試驗(yàn)表明，長(zhǎng)期飼服轉(zhuǎn)基因生菜葉片、煙草蛋白提取液、番茄果實(shí)的NOD小鼠糖尿病發(fā)病率均明顯低于對(duì)照組。(見表3)
表1植物偏愛密碼子總結(jié)表(根據(jù)Murray E.E.)

表2所合成8條寡核苷酸片段、分子量及稀釋情況No.1 5′-GATCCATGTT CGTTAACCAA CACC-3′No.2 5′-TTTGCGGATC TCACCTTGTT GAGGCTCTTT ACCTTGTTTG CGGAGAGAGG GGATTC-3′No.3 5′-TTCTACACCC CAAAGACCGG AGGACCATCT GGAGGAGGAA TCGTTGAGCA ATG-3′No.4 5′-CTGCACCTCT ATCTGCTCTC TTTACCAACT TGAGAACTAC TGCAACTAAG-3′No.5 5’-AATTCTTAGT TGCAGTAGTT CTC-3’No.6 5’-AAGTTGGTAA AGAGAGCAGA TAGAGGTGCA GCATTGCTCA ACGATTCC-3’No.7 5’-TCCTCCAGAT GGTCCTCCGG TCTTTGGGGT GTAGAAGAAT CCCCTCTCTC CGCAAAC-3’No.8 5’-AAGGTAAAGA GCCTCAACAA GGTGAGATCC GCAAAGGTGT TGGTTAACGA ACATG-3’

表3NOD小鼠的長(zhǎng)期飼服轉(zhuǎn)基因番茄、生菜和煙草試驗(yàn)

表4農(nóng)桿菌YEB培養(yǎng)基配方成分 每升含量(克)牛肉膏提取物 5.0酵母提取物1.0蛋白胨5.0蔗糖 5.0MgSO4.7H2O 0.5瓊脂(固體培養(yǎng)基用)10表5番茄、生菜及煙草組織培養(yǎng)用MS培養(yǎng)基成分 每升含量(分化培養(yǎng)基)10x MS大量元素母液 100ml100x MS微量元素母液 10ml100x 鐵鹽母液10ml100x 維生素母液 10mllmg/ml6-芐基腺嘌呤1.0mllmg/ml萘乙酸 0.1ml瓊脂 9克PH5.8(生根培養(yǎng)基)10x MS大量元素母液 100ml100x MS微量元素母液 10ml100x 鐵鹽母液10ml100x 維生素母液 10ml瓊脂 9克PH5.8
此專利涉及的菌種已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，單位地址中國(guó)北京中關(guān)村，該微生物分類名稱為大腸埃希氏菌(E coli.)，保藏代號(hào)為p11Z-InsK，保藏編號(hào)為CGMCC NO.0723，保藏日期為2002年3月8日。
總之，本發(fā)明提供了一種利用轉(zhuǎn)基因番茄、生菜和煙草做為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人胰島素方法，并且提供了按植物偏愛密碼子合成的人胰島素基因的DNA序列，構(gòu)建了組成型表達(dá)的CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)人胰島素基因以及果實(shí)專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)人胰島素基因的高效植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄、生菜和煙草，證明該合成的基因能在植物中高效表達(dá)，動(dòng)物試驗(yàn)亦證明有效，能夠用于大規(guī)模生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)胰島素的方法，包括人工合成人胰島素基因，形成帶有所述基因的轉(zhuǎn)基因植物，且所述植物的植株中能夠產(chǎn)生所述胰島素，其特征在于所述胰島素基因中的部分堿基用植物偏愛的密碼子替代，所述胰島素具有類似天然胰島素的三維結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述胰島素基因在植物體中表達(dá)時(shí)所用的啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子或番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述胰島素基因中胰島素A鏈基因有13個(gè)堿基與天然的A鏈基因的堿基不同，胰島素B鏈基因中有18個(gè)堿基與天然的B鏈基因的堿基不同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其特征在于所述的胰島素中B鏈在前，A鏈在后，B鏈和A鏈?zhǔn)怯貌煌贑肽的短肽連接起來的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的短肽序列為Gly-Gly-Pro-Ser-Gly-Gly。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述A鏈和B鏈的基因之間能自主斷裂，且能將編碼順序分別放在不同的轉(zhuǎn)錄單位之中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的胰島素基因3’端堿基具有能使所述胰島素滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的序列，或者所述胰島素C端加上能使所述胰島素滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述序列為KDEL四個(gè)氨基酸的12個(gè)堿基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的胰島素基因是由序列號(hào)為1-8的8條基因片段合成的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用定位重組系統(tǒng)對(duì)外源基因的調(diào)控或植物激素在發(fā)育過程中受到調(diào)節(jié)，使所述轉(zhuǎn)基因植物后代中不存在所述的胰島素基因或在轉(zhuǎn)植物植物后代中不能表達(dá)所述的胰島素基因，或者所述轉(zhuǎn)基因植物本身不能產(chǎn)生發(fā)育正常的種子，或者所述轉(zhuǎn)基因植物本身不能正常結(jié)實(shí)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述的定位重組系統(tǒng)為Cre/lox或FLP/FRT，所述的后代為自交第二代所述的植物激素在發(fā)育過程中受到調(diào)節(jié)是指激素ipt基因調(diào)節(jié)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、10所述的方法，其特征在于所述的植物為雙子葉植物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述的雙子葉植物為蔬菜類或瓜果類或塊根塊莖類作物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述的雙子葉植物包括煙草、番茄、生菜、黃瓜、西瓜、甜瓜、茄子、南瓜、香蕉、蘋果、梨、菠蘿、胡蘿卜、蘿卜、甘薯、木薯、馬鈴薯。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因植物采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或微粒轟擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化后培育形成的。
16.一種藥品，是利用權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的能表達(dá)所述基因的植物或植物器官。
17.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子為2A12。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述表達(dá)利用的載體為pCAM35S-InsK或pCAM2A12-InsK。
19.一種用于權(quán)利要求1所述方法中的載體，其特征在于所述載體為pCAM35S-InsK或pCAM2A12-InsK。
全文摘要
本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因番茄做為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人胰島素。所用的人胰島素基因是依據(jù)植物偏愛密碼子的原則來設(shè)計(jì)所含的密碼子，通過人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在C端加上KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列，避免胰島素在植物細(xì)胞中的降解。將該基因置于CaMV 35S啟動(dòng)子和果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A12的驅(qū)動(dòng)之下通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入番茄中，在番茄的果實(shí)中表達(dá)人胰島素。這種能制造人胰島素的番茄不僅可以方便地成為一種口服產(chǎn)品，用于防治某些胰島素依賴的和自體免疫障礙的糖尿病，而且可以從中提純出人胰島素做成注射用的劑型。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1458161SQ03109739
公開日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2003年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月14日
發(fā)明者林忠平, 倪挺, 陳溪, 胡鳶雷 申請(qǐng)人:林忠平