專利名稱：建立病毒性肝炎小鼠模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，用于模擬、研究和防治人類的病毒性肝炎。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎特別是乙型病毒肝炎是危害人類健康的重要疾病。據(jù)初步估計(jì)全世界乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者約有4～5億，我國是乙型肝炎病毒感染的高發(fā)地區(qū)，人群攜帶乙型肝炎病毒率約為10～20％。全世界每年由于病毒而引起的暴發(fā)型肝炎超過五萬例，死亡率高達(dá)80～90％。病毒性肝炎肝細(xì)胞壞死的分子基礎(chǔ)迄今仍不明確，亦無確定有效的治療方法。因而，深入開展病毒性肝炎肝細(xì)胞壞死的分子免疫機(jī)理的研究，可為預(yù)測病毒性肝炎的疾病衍變和預(yù)后、以及為開辟新的藥物或基因治療途徑提供理論依據(jù)。
由于缺乏體外成功培養(yǎng)人類肝炎病毒的技術(shù)，動物肝炎模型的建立顯得尤為重要。1969年Litcher等科學(xué)家給黑猩猩接種含乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的血清后，黑猩猩出現(xiàn)特異性免疫反應(yīng)，首次證實(shí)乙型肝炎病毒可以感染黑猩猩，這在乙型肝炎的研究中起了重要的作用。但該動物價(jià)格極為昂貴，來源也受到了很大的限制，同時(shí)其感染后無明顯的臨床癥狀，其感染后的經(jīng)過和轉(zhuǎn)歸與人類乙型肝炎有明顯的差別，這些不利因素決定了人們有必要尋找其他更容易獲得且對乙型肝炎病毒更敏感的動物模型。長臂猿對乙型肝炎病毒的敏感性、以及感染后的血清學(xué)和生化改變類似于黑猩猩，但其同樣不產(chǎn)生明顯的臨床癥狀。有些動物如絨毛猴盡管在接種乙型肝炎病毒感染性血清后可出現(xiàn)遲發(fā)性抗原血癥，但卻沒有相應(yīng)的生化和組織病變形成。恒河猴在一定的條件下似乎對乙型肝炎病毒是易感的，但其敏感性卻比黑猩猩和長臂猿都低。恒河猴對不同乙型肝炎病毒株的敏感性并不一致，其對乙型肝炎病毒的adw株相對較敏感。在接種了含乙型肝炎病毒的血清后，恒河猴常產(chǎn)生乙肝抗原表面抗體(HBsAb)，少數(shù)恒河猴可產(chǎn)生低水平的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)血癥，持續(xù)時(shí)間約2周左右，被感染的恒河猴不出現(xiàn)臨床癥狀，血清轉(zhuǎn)氨酶活力無明顯升高，肝組織也缺乏相應(yīng)的肝炎病理改變，這些均限制了恒河猴在乙型病毒肝炎研究中的應(yīng)用。
在選擇用乙型肝炎病毒建立乙型肝炎動物模型的同時(shí)，許多學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)了幾種與乙型肝炎病毒在形態(tài)、基因組結(jié)構(gòu)和發(fā)病機(jī)理等方面相似的動物肝炎病毒，如鴨肝炎病毒(DHBV)、土撥鼠肝炎病毒(WHV)和地松鼠肝炎病毒等等，這些均歸為嗜肝DNA病毒屬，它們各具自身特性，但尚無一個(gè)單獨(dú)的動物模型可以準(zhǔn)確地復(fù)制出所有乙型肝炎病毒感染的全部特征，而且多數(shù)動物模型遺傳背景不清，限制了它們在病毒性肝炎機(jī)制方面的研究。如鴨肝炎病毒模型接種病毒后出現(xiàn)持續(xù)性病毒血癥，伴與不伴有病毒血癥的一過性感染，或無感染情況，肝臟損傷較小，僅適用于乙肝病毒復(fù)制周期的研究。土撥鼠肝炎病毒模型與肝細(xì)胞肝癌(HCC)高度相關(guān)，僅適用于抗腫瘤藥物的篩選。
隨著人們對乙型肝炎病毒認(rèn)識的不斷提高，1985年Chisari等科研工作者通過顯微注射技術(shù)建立了乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因小鼠模型，該模型主要用于乙型肝炎病毒治療性免疫制劑的發(fā)展和臨床效果觀察，為乙型肝炎病毒的深入研究提供了新的途徑。但該模型仍然具有體內(nèi)缺乏病原體復(fù)制、與臨床情況顯著不同的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要克服現(xiàn)有病毒性肝炎動物模型所存在的不足，提供一種建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，用該方法建立的小鼠模型成本低廉、易于復(fù)現(xiàn)、臨床癥狀明顯、可以復(fù)制出肝炎病毒感染的多種特征且與人類情況類似。
為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明通過深入的研究和大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利用單一的鼠肝炎3型病毒(MHV-3病毒)，感染不同種系近親繁殖的小鼠，可以得到不同的肝炎感染模式。由此經(jīng)過嚴(yán)格的篩選，本發(fā)明提出一種建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，該方法包括以下步驟1)不同種系小鼠的準(zhǔn)備至少選擇一組BALB/CJ純系小鼠、一組C3H/HEJ純系小鼠和一組A/J純系小鼠，飼養(yǎng)備用；2)感染源肝炎病毒的準(zhǔn)備選擇純化的鼠肝炎3型病毒(MHV-3病毒)備用；3)不同種系小鼠的感染將步驟2)所選擇的鼠肝炎3型病毒分別注入步驟1)所選擇的各組純系小鼠體內(nèi)，繼續(xù)飼養(yǎng)；4)不同種系小鼠的處理觀察經(jīng)過步驟3)感染后的各組純系小鼠的存活率，并收集各組純系小鼠的肝臟以觀察其肝臟組織學(xué)變化。
對應(yīng)于BALB/CJ純系小鼠組，可見其24～48小時(shí)開始出現(xiàn)毛發(fā)豎直、粘連、行走困難、不食等現(xiàn)象，肝臟病理切片見大面積肝組織壞死，炎性細(xì)胞浸潤，微血管血栓形成，90％小鼠于感染后5～7日內(nèi)死于暴發(fā)性肝炎，由此獲得類似人類暴發(fā)性病毒肝炎的小鼠模型。對應(yīng)于C3H/HEJ純系小鼠組，可見其24～48小時(shí)開始出現(xiàn)毛發(fā)粘連、少動、少食現(xiàn)象，70％小鼠7～10日內(nèi)死亡，30％小鼠存活并發(fā)展為慢性肝炎，由此獲得類似人類慢性病毒肝炎的小鼠模型。對應(yīng)于A/J純系小鼠組，可見其活動自如，飲食正常，全部存活，由此獲得類似人類肝炎病毒健康攜帶者的小鼠模型。
采用本發(fā)明方法所建立的模型具有如下優(yōu)點(diǎn)1.所選鼠肝炎3型病毒感染BALB/CJ、C3H/HEJ和A/J這三種不同種系近親繁殖的小鼠后，可產(chǎn)生類似人類各種不同臨床癥狀類型的肝炎模型，包括暴發(fā)性肝炎，慢性肝炎及臨床健康病毒攜帶者，即其感染模式與人類乙型肝炎病毒的感染模式十分相近。
2.所選鼠肝炎3型病毒感染的特征在于疾病的嚴(yán)重程度與鼠種系密切相關(guān)，低劑量的病毒即可在BALB/CJ敏感鼠中引致暴發(fā)性肝炎，小鼠在5～7天內(nèi)死亡，是研究暴發(fā)性肝炎的理想模型；C3H/HEJ中度敏感鼠先患有急性肝炎，約30％存活者2周后轉(zhuǎn)為慢性肝炎，對其急性肝炎慢性化的衍變窗口期機(jī)體的免疫狀態(tài)及病毒復(fù)制情況進(jìn)行研究，是探討病毒性肝炎慢性遷延的免疫機(jī)制的有力工具。
3.本發(fā)明的小鼠模型重復(fù)性好，遺傳背景清晰，使系統(tǒng)性、動態(tài)性研究病毒性肝炎的遺傳控制因素及分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理成為可能。
4.所選鼠肝炎3型病毒易于體內(nèi)、體外培養(yǎng)，所建模型成本相對低廉，為研究抗病毒藥物的作用機(jī)制和臨床效應(yīng)提供了實(shí)用、可靠的途徑，同時(shí)也克服了乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因小鼠模型體內(nèi)缺乏病原體復(fù)制而與臨床情況顯著不同的局限性。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述本發(fā)明所提出的建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，包括以下步驟1)不同種系小鼠的準(zhǔn)備以12只為一組，選擇若干組BALB/CJ純系雌性小鼠、若干組C3H/HEJ純系雌性小鼠和若干組A/J純系雌性小鼠，在動物繁育實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)備用。上述各組純系雌性小鼠的年齡在6～8周胎齡的范圍內(nèi)較好，因?yàn)檫@個(gè)年齡范圍的小鼠感染肝炎病毒后所反映出的癥狀非常穩(wěn)定，易于模擬人類的感染情況，而所選小鼠最好的年齡應(yīng)為8周胎齡。上述各組純系雌性小鼠的動物級別應(yīng)為清潔級，這樣可防止其他污染對所建模型的干擾和影響，確保模型的準(zhǔn)確性。將上述各組純系雌性小鼠置于無菌過濾空氣鼠籠內(nèi)，控制籠內(nèi)溫度為22℃，12小時(shí)光照/黑暗交替進(jìn)行，供給優(yōu)質(zhì)飼料與水，飼養(yǎng)一周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室新的生活環(huán)境，即可用于下面的實(shí)驗(yàn)。
2)感染源肝炎病毒的準(zhǔn)備選擇鼠肝炎3型病毒，此病毒可以從所有的美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)購置到。將購置到的鼠肝炎3型病毒在DBT細(xì)胞系空斑純化后，于17cL細(xì)胞系繁殖培養(yǎng)，L2細(xì)胞系滴度定量后，即可用于下面的實(shí)驗(yàn)。本例中所用鼠肝炎3型病毒的滴度為4×106pFu/ml。
3)不同種系小鼠的感染將上述滴度為4×106pFu/ml的鼠肝炎3型病毒，通過30號針頭分別對上述各組純系雌性小鼠的中下腹壁行腹腔內(nèi)注射。每只純系雌性小鼠體內(nèi)注入的鼠肝炎3型病毒量在100～1000pFu(病毒噬班形成單位)的范圍內(nèi)都能有效地體現(xiàn)出感染的癥狀，本例中每只純系雌性小鼠體內(nèi)只注入100pFu鼠肝炎3型病毒，這樣可以節(jié)約病毒的用量。注射后的純系雌性小鼠繼續(xù)在無菌過濾空氣鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)。
4)不同種系小鼠的處理(1)觀察一組BALB/CJ純系小鼠、一組C3H/HEJ純系小鼠和一組A/J純系雌性小鼠的存活率，其結(jié)果為12只BALB/CJ敏感組小鼠于鼠肝炎3型病毒感染后24小時(shí)開始出現(xiàn)毛發(fā)豎直、粘連、行走困難、不食等現(xiàn)象，第5天全部死亡，死亡率達(dá)100％。12只C3H/HEJ中度敏感組小鼠于鼠肝炎3型病毒感染后，其中8只于7天內(nèi)死亡，死亡率達(dá)66.67％，存活下來的小鼠發(fā)展為消耗綜合征，表現(xiàn)為體重下降、脫發(fā)、油性毛發(fā)和麻痹。12只A/J耐受組小鼠全部存活。這三種小鼠對鼠肝炎3型病毒感染的敏感性見下圖的生存曲線，圖中橫坐標(biāo)為小鼠感染鼠肝炎3型病毒后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為小鼠存活數(shù)。 (2)收集其他各組純系雌性小鼠的肝臟以觀察其肝臟組織學(xué)變化在小鼠感染鼠肝炎3型病毒后分別設(shè)立0時(shí)、1天、2天、3天、5天、7天、10天、20天等時(shí)間點(diǎn)，收集每組小鼠的肝臟，其中0時(shí)小鼠肝臟作為正常對照組，制作成厚度為4um的肝臟組織石蠟切片，蘇木素、伊紅染色后鏡下觀察。其結(jié)果為BALB/CJ敏感組小鼠感染后24小時(shí)，肝組織匯管區(qū)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤、微血管血栓，形成大量小范圍、不連續(xù)的壞死區(qū)域；至感染后48小時(shí)，大量炎性細(xì)胞浸潤和纖維素沉積，肝臟壞死區(qū)域出現(xiàn)融合，呈大塊性壞死，即BALB/CJ敏感小鼠的肝臟組織病變隨著時(shí)間的推移進(jìn)行性加重。C3H/HEJ中度敏感組小鼠于感染后24小時(shí)，肝臟可見輕度的點(diǎn)、灶狀壞死，肝臟結(jié)構(gòu)較完整，隨著時(shí)間的推移，肝臟可出現(xiàn)中度碎片狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤，少量纖維素沉積，但至感染后第7天，存活下來的小鼠肝臟病變基本停止惡性進(jìn)展。而A/J耐受組小鼠的肝臟組織始終未見明顯異常改變。
由此，選用BALB/CJ純系小鼠可建立類似人類暴發(fā)性病毒肝炎的小鼠模型，選用C3H/HEJ純系小鼠可建立類似人類慢性病毒肝炎的小鼠模型，選用A/J純系小鼠可建立類似人類肝炎病毒健康攜帶者的小鼠模型。
權(quán)利要求
1.一種建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，包括以下步驟1)不同種系小鼠的準(zhǔn)備至少選擇一組BALB/CJ純系小鼠、一組C3H/HEJ純系小鼠和一組A/J純系小鼠，飼養(yǎng)備用；2)感染源肝炎病毒的準(zhǔn)備選擇純化的鼠肝炎3型病毒(MHV-3病毒)備用；3)不同種系小鼠的感染將步驟2)所選擇的鼠肝炎3型病毒分別注入步驟1)所選擇的各組純系小鼠體內(nèi)，繼續(xù)飼養(yǎng)；4)不同種系小鼠的處理觀察經(jīng)過步驟3)感染后的各組純系小鼠的存活率，并收集各組純系小鼠的肝臟以觀察其肝臟組織學(xué)變化，對應(yīng)于BALB/CJ純系小鼠組即可獲得類似人類暴發(fā)性病毒肝炎的小鼠模型，對應(yīng)于C3H/HEJ純系小鼠組即可獲得類似人類慢性病毒肝炎的小鼠模型，對應(yīng)于A/J純系小鼠組即可獲得類似人類肝炎病毒健康攜帶者的小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，其特征在于所說的步驟1)中選擇的各組純系小鼠的年齡為6～8周胎齡，動物級別為清潔級，在無菌過濾空氣鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，其特征在于所說的步驟1)中選擇的各組純系小鼠的年齡為8周胎齡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，其特征在于所說的步驟3)中每只純系小鼠體內(nèi)注入的鼠肝炎3型病毒量為100～1000pFu(病毒噬班形成單位)，在每只純系小鼠的中下腹壁行腹腔內(nèi)注射，注射后的純系小鼠繼續(xù)在無菌過濾空氣鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，其特征在于所說的步驟3)中每只純系小鼠體內(nèi)注入的鼠肝炎3型病毒量為100pFu。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種建立病毒性肝炎小鼠模型的方法。該方法選擇100～1000pFu量的鼠肝炎3型病毒(MHV－3)，通過注射感染不同種系近親繁殖的BALB/CJ、C3H/HEJ和A/J純系小鼠，并觀察受感染后的小鼠的存活率和肝臟組織學(xué)變化，從而建立了暴發(fā)性肝炎、慢性肝炎和無癥狀小鼠這三種嚴(yán)重程度不一、類似人類疾病過程的病毒性肝炎小鼠模型。該模型的建立為系統(tǒng)研究病毒性肝炎的遺傳調(diào)控、分子機(jī)理和防治措施提供了有力的工具。
文檔編號A01K67/027GK1463594SQ02115980
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月14日
發(fā)明者寧琴, 羅小平, 嚴(yán)偉明, 郝連杰 申請人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院