專利名稱：薔薇屬栽培品種的繁殖和體外開花的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物栽培、植物無性繁殖及園藝學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及薔薇屬(rose)植物或組織培養(yǎng)物的無性繁殖，以及體外誘導(dǎo)來源于薔薇屬植物或者組織培養(yǎng)物的薔薇屬幼株開花。更具體地說，本發(fā)明涉及用于薔薇及薔薇屬植物的體外微繁殖(micropropagation)、花芽誘導(dǎo)以及開花的培養(yǎng)基配方和有效的方法。
背景技術(shù)：
薔薇屬屬于薔薇科(Rosaceae Juss)。該科非常大，其成員包括100余個屬和2000個草本及木本的種。很多重要的食用植物和觀賞植物都屬于薔薇科，例如草莓、蘋果、杏、櫻桃、梨及黑梅。薔薇屬發(fā)展至今，其準(zhǔn)確的物種數(shù)目尚不清楚。大多數(shù)的薔薇屬植物生長于北半球溫帶，主要是在中國南部及遠(yuǎn)東，到喜馬拉雅山脈和孟加拉直至埃塞俄比亞，西至北美洲，從北極圈地區(qū)到新墨西哥州。周期性開花或終年開花的薔薇屬在18世紀(jì)末從遠(yuǎn)東傳入歐洲，其來自于中國、印度、日本無數(shù)次傳代培養(yǎng)。薔薇屬是全世界最流行的花之一。薔薇屬一般被做成切花(cut flower)、盆栽植物、或者家庭花園中的栽培植物。切花又分為很多種，包括例如長莖、短莖、小花甜心以及多花束扎薔薇屬。
由于目前大多數(shù)的商用薔薇屬品種都是雜交的，選擇從種子開始的繁殖過程就不十分合適，主要是因為這樣子代間會出現(xiàn)性狀分離問題。雜交切花薔薇屬的商業(yè)化繁殖一般都是通過出芽或者將特定的嫩枝插條或者芽移植嫁接到野生薔薇屬的根莖上進(jìn)行的。而對于小號的瓶裝薔薇屬，一般的慣例是在溫室里經(jīng)插條進(jìn)行田間無性繁殖?？梢蕴娲鲜龇椒ǖ囊环N方法就是微繁殖，也被稱為腋芽繁殖或者體外無性繁殖，即是在消毒無菌條件下進(jìn)行腋芽繁殖。微繁殖的優(yōu)點在于快速對所需植物品種進(jìn)行繁殖，并可得到相同遺傳基因的植物幼苗。從微繁殖得到的幼苗還是無菌的，沒有細(xì)菌、真菌和病毒的污染，也沒有病蟲害。微繁殖的過程包括從相近種屬的植物中選擇準(zhǔn)備外植體(explant)，在含有植物生長激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行外植體的培養(yǎng)，孵育，純種幼芽(或者帶根幼芽)的再生(詳見Douglas分子生物學(xué)方法，Vo1.6，W.Pollard，J.M.、Walker，編輯.(1990)；George和Sherrington，Exegetics，Ltd.U.K.，p.3(1984)；和Brown和Thorpe細(xì)胞培養(yǎng)和植物體細(xì)胞遺傳學(xué)，p49-65，I.K.Vasil編輯.(1986))。微繁殖為所需植物的大量繁殖提供了一種可能的經(jīng)濟(jì)有效的方法。本技術(shù)的一個重要出發(fā)點在于能夠增加所繁殖的植物品種的經(jīng)濟(jì)價值。查閱相關(guān)的文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)目前的繁殖方案在誘導(dǎo)植物幼苗體外開花上大多非常低效。其效率主要取決于所用的栽培品種，但是即使是最好的品種效率也很低(大約10％)。
最近幾年，長度從7.5cm到20cm不等的盆栽薔薇屬品種變得非常走俏，這是因為與切花相比，他們的包裝比較緊密而且花期更長。而且，在合理的價格下可以同時開多個花的能力，使得盆栽的薔薇屬得到更大的普及。同時，全世界也推出了微型薔薇屬雜交品種的培養(yǎng)方法。例如，僅在美國就已經(jīng)有超過300個微型薔薇屬雜交品種登記在冊。最著名的商業(yè)微型薔薇屬雜交育種公司是丹麥的Poulsen Roser ApS(注冊商標(biāo)是PARADE)和新西蘭的De Ruiter的New Rose國際公司。微型盆栽薔薇屬可以種植在花園里，院子里，甚至可以放在房間里以起到裝飾效果。但是，微型盆栽薔薇屬作為室內(nèi)裝飾尚有一定限制，這主要是因為瓶內(nèi)需要泥土。而且，考慮到平均15-30cm的總高度(包括花瓶)，即使是盆栽薔薇屬放在例如桌子這樣的地方上也仍舊是太高了些。還有，由于全世界變得越來越城市化，越來越多的人有更多的時間是在室內(nèi)活動的，比如說家里或者是辦公室。于是，就出現(xiàn)了一種對多花、花期長、清潔而且緊湊的裝飾性薔薇屬的需求。
薔薇屬的商業(yè)化繁殖一般通過出芽或者將特定的嫩枝移植嫁接到野生薔薇屬的根莖上進(jìn)行的。最近幾年里，很多文獻(xiàn)都涉及到通過組織培養(yǎng)物進(jìn)行薔薇屬繁殖的問題。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)所提到的不同的變種和型在營養(yǎng)物和激素需要兩個方面大不相同。大多數(shù)的商業(yè)薔薇屬培育者仍然使用傳統(tǒng)方法進(jìn)行薔薇屬的繁殖。用于爬墻薔薇屬的培養(yǎng)基Improved Blaze使得三種微型薔薇屬品種有明顯的生長，但卻不是對所有的雜交茶薔薇屬有效(Hasegawa，J.Amer Soc.Hort.Sci.1980，105216-220)。而且，與另外兩個老牌的世界品種大馬士革薔薇(R.damascena)和犬薔薇(R.canina)相比，繁殖雜交品種Tropicana和Bridal Pink時所需的植物生長調(diào)控因素有相當(dāng)大的不同(Khosh-Khui和Sink，J.Hort.Sci.198257，315-319；Khosh-Khui和Sink，Scientia Horticultulrae 1982 17，371-376)。
為了優(yōu)化生長條件，大多數(shù)研究都集中在改變特定的生長調(diào)控因子的濃度上(Hasegawa，見上)，還有一些研究觀察了其它因素的影響，這些因素包括某些有機(jī)或者無機(jī)成分、芽的位置、溫度、每日光照時間、Murashige和Skoog兩個成分的濃度以及移栽之間的培養(yǎng)周數(shù)(Khosh-Khui和Sink，上述Bressan等，J.Amer.Soc.Hort.Sci.1982107，979-990)。授予Dobres等的美國專利5,843,782公開了一個薔薇屬微繁殖的方法，其包含在第一個培養(yǎng)基上培養(yǎng)帶有節(jié)點的莖干，所述培養(yǎng)基中包含細(xì)胞分裂素、植物生長素和赤霉素，在第二個培養(yǎng)基上生產(chǎn)可以移栽到土中的開花薔薇屬，所述培養(yǎng)基中包含細(xì)胞分裂素、植物生長素和赤霉素。
本發(fā)明主要涉及開發(fā)用于繁殖微型薔薇屬幼株以及有效地體外培養(yǎng)誘導(dǎo)開花以在無需盆栽及無土的情況下生產(chǎn)微型薔薇屬的新的組合物和方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，利用本發(fā)明可以讓薔薇屬在一個封閉的內(nèi)部裝有培養(yǎng)基的容器內(nèi)開花，以用于商貿(mào)和裝飾。
這里將所列舉的用來說明本發(fā)明的背景或為具體實施提供細(xì)節(jié)的文獻(xiàn)和其它材料作為參考文獻(xiàn)并入本說明書。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供了用于薔薇屬或者薔薇屬組織培養(yǎng)物的無性繁殖和繁殖的方法。
另一方面，本發(fā)明提供了體外誘導(dǎo)經(jīng)繁殖后的植物幼株開花的方法，所述植物幼株是薔薇屬或者薔薇屬組織培養(yǎng)物經(jīng)繁殖后得到的。
另一方面，本發(fā)明提供了用于對源于薔薇屬或者薔薇屬組織培養(yǎng)物的繁殖后幼株進(jìn)行微繁殖及體外開花的組合物。
在一個實施方案中，盆栽薔薇屬的幼枝培養(yǎng)在第一培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基包含無機(jī)營養(yǎng)物，維生素，細(xì)胞分裂素，植物生長素，作為碳源的蔗糖，這樣直到幼枝上萌出芽。將芽從幼枝上切下，移入裝有第一培養(yǎng)基的密閉容器中，培養(yǎng)約50天，它會出幼苗和新的芽。將這些新形成的芽切下，移入裝有第一培養(yǎng)基的密閉容器中，培養(yǎng)，直到更多的幼苗和芽長出來。在繁殖步驟之后，切下薔薇屬的芽，繼續(xù)在第一培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲得更多的幼苗。
在一個優(yōu)選的實施方案中，將幼苗移入第二培養(yǎng)基上誘導(dǎo)花芽，所述培養(yǎng)基中包含無機(jī)營養(yǎng)物，維生素，作為碳源的蔗糖，植物激素苯基噻二唑脲(thidiazuron)，細(xì)胞分裂激動素，植物生長素以及任選加入的肌醇。在這個方案中，幼苗的花芽誘導(dǎo)成功后，移入伸長(elongation)培養(yǎng)基上，后者包含無機(jī)營養(yǎng)物，維生素，碳源蔗糖，細(xì)胞分裂素，植物生長素和肌醇。伸長后，將植物幼苗放入含有無機(jī)營養(yǎng)物、維生素及赤霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使之體外開花。
在另一個實施方案中，一旦繁殖出芽，幼苗就被移入含有無機(jī)營養(yǎng)物、維生素、碳源蔗糖、細(xì)胞分裂素玉米素、肌醇的培養(yǎng)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)花芽。接下來，在本方案中，幼苗就直接被移入包含有無機(jī)營養(yǎng)物、維生素及赤霉素的培養(yǎng)基上，使之體外開花。
附圖簡述本專利申請文件包括至少一幅彩圖。如有需要，將由美國專利商標(biāo)局提供本專利的彩色復(fù)印件，但需付必要的費用。


圖1為一流程圖，示出完成包括繁殖和可栽培微型薔薇屬體外開花等各步驟在內(nèi)所需的時間。圖2示出在密閉容器內(nèi)體外薔薇屬幼株開花的整體圖。圖3示出放置在架上的裝有開花薔薇屬幼株的多個密閉容器的整體圖。
發(fā)明詳述一方面，本發(fā)明提供了用于薔薇屬或者薔薇屬組織培養(yǎng)物的無性繁殖和繁殖的方法。
另一方面，本發(fā)明提供了體外誘導(dǎo)植物幼株開花的方法，所述植物幼株是薔薇屬或者薔薇屬組織培養(yǎng)物經(jīng)繁殖后得到的。
另一方面，本發(fā)明提供了用于對源于薔薇屬或者薔薇屬組織培養(yǎng)物的繁殖后幼株進(jìn)行微繁殖及體外開花的組合物。
在一個實施方案中，盆栽薔薇屬的幼枝培養(yǎng)在第一培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基包含無機(jī)營養(yǎng)物，維生素細(xì)胞分裂素，植物生長素，作為碳源的蔗糖，這樣直到幼枝上萌出芽。將芽從幼枝上切下，移入裝有第一培養(yǎng)基的密閉容器中，培養(yǎng)約50天，它會出幼苗和新的芽。將這些新形成的芽切下，移入裝有第一培養(yǎng)基的密閉容器中，培養(yǎng)，直到更多的幼苗和芽長出來。在繁殖步驟之后，切下薔薇屬的芽，繼續(xù)在第一培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲得更多的幼苗。
我們發(fā)現(xiàn)，與過去的已知方法相比，增加誘導(dǎo)花芽這一步驟，其中向培養(yǎng)基中加入植物激素，這一步驟大大的提高了薔薇屬栽培品種的開花效率。我們還觀察到提高體外開花的效率不需要在最后的培養(yǎng)基中加入植物激素。最后一點，我們發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有技術(shù)相比，在特殊的例子中，在誘導(dǎo)花芽之后和培養(yǎng)體外開花之前加入伸長步驟(該伸長培養(yǎng)基中還包含其它植物激素成分)，也可以提高體外開花的效率。在一個優(yōu)選的實施方案中，幼苗在含有細(xì)胞分裂素、植物生長素及碳源蔗糖的第一培養(yǎng)基上繁殖后，將幼苗移入第二培養(yǎng)基上誘導(dǎo)花芽。該培養(yǎng)基中包含無機(jī)營養(yǎng)物，維生素，作為碳源的蔗糖，植物激素苯基噻二唑脲，細(xì)胞分裂激動素，植物生長素以及肌醇。在這個方案中，幼苗的花芽誘導(dǎo)成功后，將之移入伸長培養(yǎng)基上，后者包含無機(jī)營養(yǎng)物，維生素，碳源蔗糖，細(xì)胞分裂素，植物生長素和肌醇。伸長后，將植物幼苗放入含有無機(jī)營養(yǎng)物、維生素及植物生長素的培養(yǎng)基上伸長，然后，將伸長后的植物幼株移入含有無機(jī)培養(yǎng)物、維生素及氨芐西林的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使之體外開花。
在另一個實施例中，一旦在第一培養(yǎng)基上繁殖出芽，幼苗就被移入含有無機(jī)營養(yǎng)物、維生素、碳源蔗糖、細(xì)胞分裂素玉米素、肌醇的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)花芽。接下來，幼苗就直接被移入包含有無機(jī)營養(yǎng)物、維生素及氨芐西林的培養(yǎng)基上，使之體外開花。
在所有這些例子中，源于植物繁殖的薔薇屬植株可以是正在開花的薔薇屬，可以在本發(fā)明的培養(yǎng)基上保存和展示。未開花的植物幼株則可以用于另一個繁殖步驟中。
組織培養(yǎng)薔薇屬植株微繁殖用的培養(yǎng)基也是本發(fā)明的一個實施方案，所述培養(yǎng)基包含約1.0-2.0mg/L芐基腺嘌呤，約0.05-0.1mg/L吲哚乙酸或者萘乙酸，約1.5％-2.0％的蔗糖作為碳源。所述培養(yǎng)基優(yōu)選地含有約2.0mg/L芐基腺嘌呤，0.1mg/L植物生長素，2.0％蔗糖。本發(fā)明的培養(yǎng)基中不包含赤霉素。
包括開花薔薇屬在內(nèi)，經(jīng)此方法生產(chǎn)的薔薇屬植株也屬本發(fā)明的范疇。薔薇屬植物，優(yōu)選為薔薇屬，最優(yōu)選是從Orange(桔紅)PARADE，F(xiàn)iesta(假日)PARADE，Scarlet(鮮紅)PARADE，Bianca(比安卡)PARADE及Frosty(霜白)PARADE中選擇培育出來的品種。
本發(fā)明還涉及到薔薇屬組織培養(yǎng)物，其包含在密閉的容器中培養(yǎng)長有節(jié)點的薔薇屬莖干，所述容器中含有本發(fā)明的培養(yǎng)基。所述薔薇屬莖干至少應(yīng)包含一個枝椏，可以大量生產(chǎn)例如開花薔薇屬的薔薇屬組織培養(yǎng)物。薔薇屬外植體也屬于本發(fā)明的范圍。薔薇屬外植體可以選自長有節(jié)點的薔薇屬莖干、長有節(jié)點和至少一個幼枝的薔薇屬莖干以及薔薇屬幼枝。將薔薇屬外植體放在盛有培養(yǎng)基的密閉容器內(nèi)培養(yǎng)，直至其長出薔薇屬植株，例如開花薔薇屬。
另外，本發(fā)明還涉及下述問題，即開花薔薇屬植株可以在一段時間內(nèi)保存在培養(yǎng)基上，且無需添加肥料或水分即可存活。一般說來，薔薇屬在密閉容器內(nèi)的花期可達(dá)一個月。本發(fā)明的唯一限制是，密閉容器必須是可以保存住含有水及礦物質(zhì)、鹽及維生素等營養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基，而不會發(fā)生滲漏。在特殊的實施方案中，培養(yǎng)基也可以包含一種或者多種染料，這樣就可以選擇性的提高器皿內(nèi)的體外培養(yǎng)的開花植株的魅力和吸引力。在一個實施方案中，密閉容器由一個底座和一個蓋子組成，這兩部分是粘連在一起的，這樣在手持或者運輸過程中就不會分開，也可以保持其內(nèi)部的濕度。其蓋子，最好是整個容器，都是由高透明度，高清晰度的材料制成的，容器內(nèi)壁應(yīng)覆有一層能夠防止水分在其內(nèi)表面凝結(jié)的化學(xué)物質(zhì)，這樣就可以清楚地看到其內(nèi)的體外開花的幼株。聚碳酸酯、多聚甲基丙烯酸甲酯和玻璃都是合適的材料。其它任何可以耐受高熱(如＞160℃)和高壓(≥2個大氣壓)同時又有高清晰度的材料也都可以使用。例如，這樣的防凝霧化學(xué)物質(zhì)包含Sicanett，意大利Anfora(SV)產(chǎn)品和Siclair(Nettoyant universal)，由法國SI-International S.A.生產(chǎn)。將這種防凝霧的物質(zhì)直接噴在容器的內(nèi)壁上。本發(fā)明還涉及到前面提及的組織培養(yǎng)微繁殖方法兩步中的每個獨立步驟。在這個大體框架內(nèi)，除了前述的成分芐基腺嘌呤和吲哚乙酸或者萘乙酸，本發(fā)明的培養(yǎng)基中還可能包含有其它營養(yǎng)成分。優(yōu)選的培養(yǎng)基是改良的Murashige和Skoog(MS)基本培養(yǎng)基(在Murashige等，Physiol.Plant.，Vol.15，pp.473-97(1962)中有述)。改良的MS培養(yǎng)基是含有Gamborg維生素B5(最終濃度為10mg/L的鹽酸硫胺素，1mg/L的尼克酸，1mg/L的維生素B6及100mg/L的肌醇)的MS培養(yǎng)基，pH5.8，含2％蔗糖，用0.30％植物膠制成凝膠狀。在優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)基中可以含有不同的植物激素以及這里提及的其它附加物。
在本發(fā)明特定的實施方案中，植物生長素包含吲哚乙酸和萘乙酸。細(xì)胞分裂素包含苯基噻二唑脲、芐基腺嘌呤激動素和玉米素。
芐基腺嘌呤可以用其它的天然或者人工合成的細(xì)胞分裂素替代，后者選自6-芐基氨基嘌呤核糖核苷、6-(y-y-雙甲基烯丙基氨酸)嘌呤、DL-雙氫玉米素、t-玉米素核糖核苷、玉米素、N-(2-氯-4-吡啶)-N′-苯脲、N-芐基1-9(2-四氫吡喃)腺嘌呤、激動素、激動素核糖核苷及其類似物，其中細(xì)胞分裂素可以一種單獨使用或者幾種同時使用。吲哚乙酸可以用其它的天然或者人工合成的植物生長素替代，后者選自萘乙酸、吲哚丁酸、毒莠定、麥草畏及其它類似物，一般濃度都在約0.03-0.3mg/l左右。植物生長素可以一種單獨使用或者幾種同時使用。針對各種不同的植物，培養(yǎng)基可以改良使用不同的激素要素組成。誘導(dǎo)開花時，可以在基本培養(yǎng)基中改變營養(yǎng)水平。比如說，MS培養(yǎng)基提供的成分，是供組織培養(yǎng)的植物細(xì)胞營養(yǎng)和生長的基本必要成分，可以由其它的本技術(shù)領(lǐng)域來說很普通的培養(yǎng)或者生長培養(yǎng)基替代。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解針對不同的薔薇屬品種選擇不同組成配比的培養(yǎng)基。一般說來，最初各成分的濃度都低一些，然后根據(jù)需要達(dá)到的效果增加劑量。
誘導(dǎo)開花時，混合物中苯基噻二唑脲的濃度最好是在0.4-0.5mg/L之間。
玉米素的濃度最好是在0.5-1.0mg/L之間。
在繁殖和生長步驟中，培養(yǎng)基中芐基腺嘌呤的最佳濃度是約2mg/L。在已誘導(dǎo)出花芽的幼株的伸長步驟中，培養(yǎng)基中芐基腺嘌呤的最佳濃度是約0.1mg/L。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)基中萘乙酸作為植物生長素的濃度不得超過2mg/L。其最佳濃度在0.05-0.1mg/L之間。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)基中吲哚乙酸作為植物生長素的濃度一般在0.05-0.1mg/L之間。繁殖幼株時其最佳濃度是0.1mg/L。在已誘導(dǎo)出花芽的幼株的伸長步驟中，培養(yǎng)基中芐基腺嘌呤的最佳濃度是約0.1mg/L。
對于本領(lǐng)域人員來說顯然會對微繁殖條件進(jìn)行各種不同的改變，同時還包括選擇用于初始培養(yǎng)的供體組織，后者來自于具有合適的基因型、生理狀態(tài)以及生長狀態(tài)的植株。另外，不同來源的外植體、植物的品種以及培養(yǎng)品種所處的自然環(huán)境都屬于本發(fā)明所預(yù)期的范圍。例如，就改善密閉容器中的薔薇屬品種來說，氣體環(huán)境、溫度和光照條件可能都需要有所不同。一般說來，誘導(dǎo)花芽的最佳溫度應(yīng)≤25℃。任何合適的膠凝劑都可以使用，例如但不限于包含PHYTAGELTM的凝膠，包含GEL RITETM的凝膠；包含AGARGELTM的凝膠；瓊脂也可以，例如但不限于A，E，和M型瓊脂、純化High Gel Strength、Bacteriological Flake；AGARGELTM瓊脂混合物以及PHYTAGELTM；還有瓊脂糖，例如VII型、褐藻酸、角叉膠、轉(zhuǎn)移膠及羥乙基纖維素等。
薔薇屬外植體是本發(fā)明的一個實施方案。所述薔薇屬外植體可以在包含上述培養(yǎng)基的密閉容器中培養(yǎng)，直至生產(chǎn)出薔薇屬植株，如開花薔薇屬。外植體可以來自于植株，例如但不限于薔薇屬，包括但不限于薔薇屬(genus Rosa)，例如但不限于以下栽培品種桔紅PARADE，假日PARADE，鮮紅PARADE，比安卡PARADE、霜白PARADE等；大馬士革薔薇，野薔薇，法國薔薇等。本發(fā)明的組織培養(yǎng)技術(shù)包含在密閉容器中培養(yǎng)薔薇屬外植體，所述容器可以使用如培養(yǎng)皿、試管、燒瓶、eppendorf管、兒童食品瓶、罐頭瓶、或者任何能夠根據(jù)本發(fā)明的方法支持本發(fā)明的薔薇屬生長的密閉的容器。
包括開花薔薇屬在內(nèi)，利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)出的薔薇屬也屬于本發(fā)明的范疇。薔薇屬植株可以保存在密閉容器中。薔薇屬組織培養(yǎng)物或其幼株也屬于本發(fā)明的范疇。薔薇屬組織培養(yǎng)物可以生產(chǎn)薔薇屬，例如開花薔薇屬。
密閉容器內(nèi)的薔薇屬可以用于篩選花色及花形的新培育品種。例如，可在薔薇屬愈傷組織、外植體或者腋芽的組織培養(yǎng)過程中對植株進(jìn)行突變處理?？蓪⑼蛔兒蟮乃N薇屬植株放置在本發(fā)明提供的培養(yǎng)基上生長，然后對花色、花形、抗病能力、生長活力、冷熱度敏感性及其他有價值的特性進(jìn)行篩選。另外，本發(fā)明還可以實現(xiàn)培養(yǎng)中的薔薇屬植株的異花傳粉。例如，由于薔薇屬的花顯然包含雌雄兩種成熟的性器官，于是這樣的花的傳粉過程既可以是接受了來自同一朵花的花粉又可以是接受了來自另一朵花的花粉。或者，花可以在體外繁殖并保存或者展示在用于裝飾的透明干凈的容器內(nèi)。方法概要本說明書使用了下述術(shù)語。
芐基腺嘌呤是一種細(xì)胞分裂素類的植物激素。
玉米素是一種細(xì)胞分裂素類的植物激素。
萘乙酸或者2-萘乙酸是一種植物生長素類的植物激素。
吲哚乙酸或者3-吲哚乙酸是一種植物激素。
細(xì)胞分裂素一詞是指一種植物激素。在低濃度下，這些有機(jī)物可以促進(jìn)根細(xì)胞的伸長。
植物生長素一詞是指一種植物激素。在低濃度下，這些有機(jī)物可以促進(jìn)植物芽的伸長并控制其它特殊生長作用。植物生長素包括吲哚丙酸(IPA)、脫落酸(ABA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，萘乙酸及GA3。
“栽培品種”一詞是指有商業(yè)價值的、源于園藝培育的變種，與自然生長產(chǎn)生的變種不同。
這里所謂的“微繁殖”是指植物的體外無性克隆繁殖，其中在含有適當(dāng)濃度的植物激素、礦物質(zhì)、維生素及碳源等培養(yǎng)基上培養(yǎng)母代植物，經(jīng)誘導(dǎo)得到芽，進(jìn)而得到大量的新幼枝，這一切都可以在很短的時間內(nèi)實現(xiàn)。
以下為在本發(fā)明的實際應(yīng)用中所用的培養(yǎng)基RMS0改良MS培養(yǎng)基，包括全效的Murashige Skoog無機(jī)營養(yǎng)物及Gamborg維生素B5(維生素的最終濃度為10mg/L，煙酸1mg/L，維生素B61mg/L，肌醇100mg/L)，pH5.8，2％蔗糖，以0.30％植物膠使之凝結(jié)。在不同的發(fā)育階段，培養(yǎng)基中的植物激素有所不同。
RMS1RMS0加入2mg/L6-芐基腺嘌呤及0.05mg/L萘乙酸。
RMS2RMS0，其中蔗糖濃度為3％，加入0.4-0.5mg/L苯基噻二唑脲、0.05mg/L萘乙酸、0.1mg/L激動素及400mg/L纖維醇。
RMS3RMS0，其中蔗糖濃度為3％，加入0.5-1.0mg/L玉米素，0.05mg/L萘乙酸及400mg/L纖維醇。
RMS4RMS0，其中蔗糖濃度為3％，加入0.1mg/L芐基腺嘌呤、1.0mg/L吲哚乙酸及400mg/L肌醇。
RMS5RMS0，其中蔗糖濃度為2％，加入2mg/L芐基腺嘌呤及0.1mg/L吲哚乙酸。通過母體出芽的方式獲得外植體在優(yōu)選的實施方案中，有腋芽的幼小枝條被用作外植體。為了確保在培養(yǎng)基上的外植體沒有細(xì)菌及真菌感染(污染物)，在使用前對外植體的表面要進(jìn)行消毒。許多本領(lǐng)域的消毒技術(shù)都可以用于培養(yǎng)用外植體的準(zhǔn)備。這些技術(shù)包括將外植體浸入到含有至少一種消毒物質(zhì)的溶液中。這樣的消毒物質(zhì)包括次氯酸鈉、次氯酸鈣、氯化汞及普通酒精等。
在本發(fā)明的優(yōu)選的方法中，將來自成熟植株的10-12cm長的幼枝剝掉外面的葉子，然后在流動的水下清洗，0.1％HgCl2消毒5-10分鐘，再用流動的水徹底沖洗不少于30分鐘。幼枝浸沒在10-15％的CloroxR(含有5.25％次氯酸鹽)溶液內(nèi)10-15分鐘。最后用蒸餾水沖洗幼枝4-6次。幼枝可以來自于利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)得到的薔薇屬植株組織培養(yǎng)物。因此，我們預(yù)期來自于組織培養(yǎng)物的幼枝可以替代來自成熟植株的幼枝，而并不脫離本發(fā)明的范圍。形成幼苗將外植體放置在固態(tài)培養(yǎng)基上，在16小時光照條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為4500-5500lux(由日光燈提供光源)。如果幼苗接受上述光照條件照射，溫度應(yīng)保持在23℃。如果移去光源，幼苗的環(huán)境溫度應(yīng)保持在19度。整個幼枝在RMS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，(RMS0內(nèi)加入2mg/L6-芐基腺嘌呤及0.05mg/L萘乙酸)。外植體漸漸反青，并通常在15天有后幼芽形成。及時將幼芽切下，以備幼苗繁殖之用。增殖幼苗繁殖增殖，是指從幼年或者重新恢復(fù)幼稚的生長中植物的某個部位獲得整個植物體的過程。這個部位一般是生長點或者是在根尖或芽尖的細(xì)胞快速分裂的區(qū)域，即所謂分生組織(meristemmaterial)。來自于芽的取材被放置在事先確定的激素和營養(yǎng)培養(yǎng)基上，以獲得外植體，然后漸漸形成長有新芽的幼苗。將幼芽逐個從外植體移除，培養(yǎng)在與上述相同的事先確定的激素和營養(yǎng)培養(yǎng)基上，以從一個幼枝上獲得多個幼苗。植物這樣單一親代的無性繁殖，保證了克隆所得到的植物后裔有與其親代同樣的基因特征。將切下的芽放入RMS1培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約50天。依上述步驟培養(yǎng)，芽長成幼苗并且在這些幼苗上有新芽形成?？梢郧邢聲r，將新形成的芽切下、移入新的RMS1培養(yǎng)基上，以備繁殖和幼苗的增殖。增殖比例一般是開始培養(yǎng)時外植體數(shù)目的4-7倍左右。誘導(dǎo)花芽誘導(dǎo)花芽對于達(dá)到商業(yè)規(guī)模的體外開花來說是非常重要的。本發(fā)明提供了兩種不同的誘導(dǎo)花芽的方法以供選用。
在一個實施方案中，通過在裝有RMS2培養(yǎng)基的密閉容器中培養(yǎng)增殖后的幼苗誘導(dǎo)花芽增殖。誘導(dǎo)培養(yǎng)大約需要50天。然后，將幼苗移入密閉容器中保存，容器中含有培養(yǎng)基RMS4用于伸長步驟，后者大約需15-30天。伸長步驟之后，幼苗被移入含有20mg/L-50mg/L氨芐西林的MS0上。通常10-20天內(nèi)開花。
在一個可供選擇但仍舊是優(yōu)選的實施方案中，增殖后，通過在裝有RMS3培養(yǎng)基的密閉容器內(nèi)培養(yǎng)增殖幼苗以誘導(dǎo)花芽，大約需要50天。誘導(dǎo)后，將幼苗直接移入含有20mg/L-50mg/L氨芐西林的MS0上。通常15-20天內(nèi)開花。
實施例本發(fā)明在下述實施例中將得到進(jìn)一步詳述。所提供的實施例均用以說明本發(fā)明，但不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。實施例使用了本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的已知技術(shù)以及下述的特殊技術(shù)。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，本發(fā)明的方法及組合物可組合成各種不同實施方案，這里公開的只是其中很小的一部分。對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，很明顯存在著其他的實施方案且并不脫離本發(fā)明的主導(dǎo)思想。因此所述的實施方案只是例證性的不要解釋為限制性的。
權(quán)利要求
1.用于薔薇屬植株的微繁殖及使所述植株的薔薇開花的方法，其包含(a)從成熟薔薇屬植株或者薔薇屬的組織培養(yǎng)物中取材，在無菌的條件下制備幼枝；(b)在密閉容器中的第一培養(yǎng)基上培養(yǎng)幼枝，所述第一培養(yǎng)基包含細(xì)胞分裂素、植物生長素以及作為碳源的蔗糖以用于生產(chǎn)有芽的外植體；(c)將芽從外植體上移除；(d)在密閉容器中的第一培養(yǎng)基上進(jìn)行芽的繁殖以產(chǎn)生具有新生芽的幼苗；(e)在密閉容器中的第一培養(yǎng)基上增殖所述幼苗；(f)在密閉容器中的第二培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述經(jīng)過增殖的幼苗以誘導(dǎo)花芽，所述的第二培養(yǎng)基至少包含一種細(xì)胞分裂素和一種植物生長素；(g)在密閉容器中的第三培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述有花芽的幼苗，所述的第三培養(yǎng)基包含蔗糖作為碳源。
2.用于薔薇屬植株的微繁殖及使所述植株的薔薇開花的方法，其包含(a)從成熟薔薇屬植株或者薔薇屬的組織培養(yǎng)物中取材，在無菌的條件下制備幼枝；(b)在密閉容器中的第一培養(yǎng)基上培養(yǎng)幼枝，所述的第一培養(yǎng)基包含芐基腺嘌呤、選自萘乙酸和吲哚乙酸的植物生長素以及作為碳源的蔗糖以用于生產(chǎn)有芽的外植體；(c)將芽從外植體上移除；(d)在密閉容器中的所述第一培養(yǎng)基上進(jìn)行芽的繁殖，以產(chǎn)生具有新生芽的幼苗；(e)在密閉容器中的所述第一培養(yǎng)基上增殖所述幼苗；(f)在密閉容器中的第二培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述經(jīng)過增殖的幼苗以誘導(dǎo)花芽，所述的第二培養(yǎng)基包含苯基噻二唑脲、細(xì)胞激動素、作為碳源的蔗糖、肌醇和萘乙酸；(g)在密閉容器中的第三培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述有花芽的幼苗，以誘導(dǎo)伸長及體外開花，所述的第三培養(yǎng)基含有作為碳源的蔗糖、芐基腺嘌呤、吲哚乙酸及肌醇；并(h)在密閉容器中的第四培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述伸長了的幼苗，所述的第四培養(yǎng)基包含作為碳源的蔗糖和抗生素。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述第一培養(yǎng)基中芐基腺嘌呤的濃度在大約1.0mg/L到大約2.0mg/L之間，而蔗糖的濃度大約為2％。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述第一培養(yǎng)基中植物生長素萘乙酸的濃度在大約0.05mg/L到大約0.2mg/L之間。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述第一培養(yǎng)基中植物生長素吲哚乙酸的濃度應(yīng)大約0.1mg/L。
6.權(quán)利要求2，3，4或5中任一項的方法，其中所述第二培養(yǎng)基中苯基噻二唑脲濃度在大約0.1m/L到大約0.3mg/L之間，激動素的濃度大約為0.1mg/L，肌醇的濃度在250mg/L到500mg/L之間，蔗糖的濃度在1.5％到3％之間。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述第二培養(yǎng)基中苯基噻二唑脲濃度在大約0.4mg/L到大約0.5mg/L之間，肌醇的濃度大約為400mg/L，蔗糖的濃度大約為3％。
8.權(quán)利要求6或者7的方法，其中所述第三培養(yǎng)基中芐基腺嘌呤的濃度在大約0.5mggg/L到0.2mg/L之間，吲哚乙酸的濃度大約為1mg/L，肌醇的濃度在250mg/L到500mg/L之間，蔗糖的濃度大約為3％。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述第四培養(yǎng)基中蔗糖的濃度大約為2％，抗生素氨芐西林的濃度在20mg/L到50mg/L之間。
10.用于薔薇屬植株的微繁殖及使所述植株的薔薇開花的方法，其包含(a)從成熟薔薇屬植株或者薔薇屬的組織培養(yǎng)物中取材，在無菌的條件下制備幼枝；(b)在密閉容器中的第一培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述幼枝，所述的第一培養(yǎng)基包含芐基腺嘌呤、選自萘乙酸和吲哚乙酸的植物生長素以及作為碳源的蔗糖以用于生產(chǎn)有芽的外植體；(c)將所述芽從外植體上移除；(d)在密閉容器中的所述第一培養(yǎng)基上進(jìn)行芽的繁殖以產(chǎn)生具有新生芽的幼苗；(e)在密閉容器中的所述第一培養(yǎng)基上增殖所述幼苗；(f)在密閉容器中的第二培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述經(jīng)過增殖的幼苗以誘導(dǎo)花芽，所述的第二培養(yǎng)基包含玉米素、作為碳源的蔗糖、肌醇和萘乙酸；(g)在密閉容器中的第三培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述具有花芽的幼苗以誘導(dǎo)伸長及體外開花，所述的第三培養(yǎng)基含有作為碳源的蔗糖和抗生素。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述第一培養(yǎng)基中芐基腺嘌呤的濃度在大約1.0mg/L到大約2.0mg/L之間。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述第一培養(yǎng)基中植物生長素萘乙酸的濃度在大約0.05mg/L到大約0.2mg/L之間。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述第一培養(yǎng)基中植物生長素吲哚乙酸的濃度為大約0.1mg/L。
14.權(quán)利要求10，11，12或13中任一項的方法，其中所述第二培養(yǎng)基中玉米素的濃度在大約0.5mg/L到大約1.0mg/L之間，激動素的濃度大約為0.1mg/L，肌醇的濃度在250mg/L到500mg/L之間，蔗糖的濃度在1.5％到3％之間。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述第二培養(yǎng)基中肌醇的濃度大約為400mg/L，蔗糖的濃度大約為3％。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第三培養(yǎng)基中蔗糖的濃度大約為2％，抗生素氨芐西林的濃度在20mg/L到50mg/L之間。
17.權(quán)利要求1，2或10中任一項的方法，其中每種培養(yǎng)基還包含營養(yǎng)培養(yǎng)基。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的營養(yǎng)培養(yǎng)基包含有MS培養(yǎng)基及Gamborg′sB5維生素。
19.權(quán)利要求1，2或10中任一項的方法，其中所述薔薇屬植株是薔薇屬雜交品種。
20.權(quán)利要求19的方法，薔薇屬雜交品種選自PARADE薔薇屬變種的栽培品種。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述薔薇屬雜交品種選自桔紅PARADE，假日PARADE，鮮紅PARADE，比安卡PARADE、霜白PARADE的栽培品種。
22.用于薔薇屬植株的組織培養(yǎng)物微繁殖的培養(yǎng)基，其包含大約1.0mg/L至2.0mg/l的芐基腺嘌呤，大約1.0mg/L至2.0mg/L的吲哚乙酸及大約2％的作為碳源的蔗糖。
23.用于薔薇屬幼苗的增殖的培養(yǎng)基，其包含大約2mg/L的芐基腺嘌呤，大約0.05mg/L萘乙酸及大約2％的作為碳源的蔗糖。
24.用于誘導(dǎo)薔薇屬植株花芽的培養(yǎng)基，其包含至少一種選自苯基噻二唑脲、激動素及玉米素的細(xì)胞分裂素；萘乙酸濃度大約為0.5mg/L；作為碳源的3％的蔗糖；以及大約400mg/L的肌醇。
25.權(quán)利要求22，23或24中任一項的培養(yǎng)基，其進(jìn)一步包含營養(yǎng)培養(yǎng)基。
26.權(quán)利要求25的培養(yǎng)基，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含有MS培養(yǎng)基及Gamborg′sB5維生素。
27.權(quán)利要求26的用于誘導(dǎo)薔薇屬植株花芽的培養(yǎng)基，其包含大約0.4至0.5mg/L的苯基噻二唑脲，大約0.5mg/L的萘乙酸，大約0.1mg/L的激動素，3％作為碳源的蔗糖，以及大約400mg/L的肌醇，但所述培養(yǎng)基中不包含玉米素。
28.權(quán)利要求26的用于誘導(dǎo)薔薇屬植株花芽的培養(yǎng)基，其包含大約0.5至1.0mg/L的玉米素，大約0.5mg/L的萘乙酸，3％作為碳源的蔗糖，大約400mg/L的肌醇，但培養(yǎng)基中不包含苯基噻二唑脲和激動素。
29.權(quán)利要求24的培養(yǎng)基，其中所述薔薇屬植株是薔薇屬雜交品種。
30.權(quán)利要求29的培養(yǎng)基，其中所述薔薇屬雜交品種選自桔紅PARADE，假日PARADE，鮮紅PARADE，比安卡PARADE、霜白PARADE的栽培品種。
31.用于薔薇屬栽培品種的微繁殖及使所述薔薇開花的方法，其包含(a)從成熟薔薇屬植株或者薔薇屬的組織培養(yǎng)物中取材，在無菌的條件下制備幼枝；(b)在密閉容器中的第一培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述幼枝，所述的第一培養(yǎng)基包含細(xì)胞分裂素、植物生長素以及作為碳源的蔗糖以用于產(chǎn)生有芽的外植體；(c)將芽從外植體上移除；(d)在密閉容器中的所述第一培養(yǎng)基上進(jìn)行芽的繁殖以產(chǎn)成具有新生芽的幼苗；(e)在密閉容器中的所述第一培養(yǎng)基上增殖所述幼苗；以及(f)在密閉容器中的所述第一培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述經(jīng)過增殖的幼苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于薔薇屬植株的微繁殖和體外誘導(dǎo)所述薔薇屬植株開花的組合物和方法。在含有第一培養(yǎng)基的密閉容器中誘導(dǎo)幼枝產(chǎn)生芽，所述第一培養(yǎng)基包含芐基腺嘌呤、植物生長素及2％作為碳源的蔗糖。將芽切下并培養(yǎng)在用于幼苗繁殖和增殖的培養(yǎng)基上。然后，將幼苗移入含有苯基噻二唑脲、植物生長素及肌醇的培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)花芽，繼而在含有芐基腺嘌呤及植物生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)以使幼苗伸長，最后在不含植物激素的第五培養(yǎng)基上培養(yǎng)使之開花。或者，在繁殖和增殖之后，將幼苗移入含有玉米素、植物生長素及肌醇的培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)開花，然后培養(yǎng)于不含植物激素的培養(yǎng)基上使之伸長并開花。
文檔編號A01H4/00GK1455640SQ00820009
公開日2003年11月12日 申請日期2000年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月9日
發(fā)明者洪焰, 袁梅芳, 王光遠(yuǎn) 申請人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院