專利名稱：一種生產(chǎn)癟籽柚果實(shí)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物新品種選育技術(shù)領(lǐng)域，是一種使柚子果實(shí)中的種子敗育生產(chǎn)癟籽柚的方法，其國際專利分類號是A01H 1/02。
柚(Citrus grandis)是我國和東南亞的特有柑橘類型，具典型單胚性。沙田柚是我國最有名的地方品種，屬自交不親和類型。該品種及由它產(chǎn)生的品種遍及我國柑橘產(chǎn)區(qū)，我國目前的柚品種主要問題是種子多，例如廣西出產(chǎn)的沙田柚為我國迄今品質(zhì)最佳的柚子品種，但其唯一的缺點(diǎn)是每果含種子100余粒，這一不利性狀已成為影響其出口創(chuàng)匯和市場競爭的主要因素。多年來，柑橘育種工作者一直在努力選育無核品種，但見效不大。我國現(xiàn)有的無核柚品種，如官溪蜜柚為無核品種，但果實(shí)?；?果肉失水變干)嚴(yán)重，耐貯性不好，品質(zhì)也變差。因此，改良沙田柚，使其產(chǎn)生種子敗育生產(chǎn)癟籽的柚子具有重要意義。
現(xiàn)有的柑橘育種實(shí)踐表明，通過倍性育種，即培育三倍體可以達(dá)到無核。60年代，以美國Soost等為代表的育種工作者開始進(jìn)行人工培育無核柑桔品種的研究，通過二倍體與同源四倍體雜交，培育了‘Oroblanco’葡萄柚等三倍體無核品種(Soost RK，Cameron JW，1980，Oroblanco，a triploid pummelo-grapefruit hybrid.HortScience，15667-669)。但柑桔天然同源四倍體較少，人工誘變也較為困難，而且同源四倍體往往育性較低，限制了該育種途徑的廣泛應(yīng)用，而且這一途徑耗時長，Soost等人培育以上品種花了近20年的時間。
進(jìn)入八十年代，柑桔細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為柑桔無核育種提供了新的思路。1985年Ohgawara等]獲得了柑桔屬間體細(xì)胞雜種(Ohgawara T et al.1985，Somatichybrid plants obtained by protoplast fusion between Citrus sinensis and Poncirus trifoliata.Theor Appl Genet 711-4)。迄今世界上已獲得100余個組合的種間、屬間異源四倍體體細(xì)胞雜種。但是這些柑橘體細(xì)胞雜種并未用于培育無籽柑橘特別是直接用于柚子果實(shí)品質(zhì)的改良上。
本發(fā)明的目的在克服已有技術(shù)的不足，通過細(xì)胞融合，人工于創(chuàng)造柑桔種間、屬間異源四倍體體細(xì)胞雜種，并利用異源四倍體體細(xì)胞雜種花粉授與二倍體柚子花后，利用其三倍體胚易敗育的特點(diǎn)，克服了多籽柚果實(shí)以及已有無籽柚果實(shí)的不足，既達(dá)到使其種子敗育，又達(dá)到提高柚子品質(zhì)的目的。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種培育無籽柚果實(shí)的方法，包括原生質(zhì)體融合，培養(yǎng)再生，倍性及雜種鑒定，育性檢測選育過程，通過采用細(xì)胞融合經(jīng)培養(yǎng)，鑒定獲得柑桔異源四倍體體細(xì)胞雜種，培育該體細(xì)胞雜種，將其花粉授與二倍體將產(chǎn)生三倍體胚和四倍體胚乳。三倍體胚發(fā)育到80-90天時，由于胚∶胚乳的倍性較正常的2∶3大，而產(chǎn)生敗育。此時，果實(shí)已渡過第二次生理落果期，種子的停止發(fā)育并不影響座果和果實(shí)的生長。這一授粉方式的最終結(jié)果是，果實(shí)成熟時，種子敗育，從而生產(chǎn)出癟籽或無籽柚子果實(shí)。另外，原來輸送給種籽的養(yǎng)分轉(zhuǎn)而輸送給果實(shí)汁囊，果實(shí)含糖量有所提高。
本發(fā)明的進(jìn)一步的過程是將親本(柑橘)之一的懸浮細(xì)胞系原生質(zhì)體與另一不同種或?qū)儆H本的葉肉原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞融合、培養(yǎng)并再生植株。采用細(xì)胞學(xué)、同工酶、RAPD等方法進(jìn)行雜種鑒定，確定種間、屬間異源四倍體體細(xì)胞雜種。柑桔體細(xì)胞雜種開花后，對雜種的花粉進(jìn)行育性評價，為育性強(qiáng)的組合的花粉授與二倍體單胚性多籽柚品種，果實(shí)成熟時，種子敗育，從而生產(chǎn)出無籽(癟籽)柚果實(shí)。原來輸送給種子的養(yǎng)分轉(zhuǎn)而輸送給果實(shí)汁囊，果實(shí)可溶性固形物提高了。
本發(fā)明的具體細(xì)節(jié)是分別建立融合兩親本的懸浮細(xì)胞系和離體無菌小苗，酶解法分別獲得雙親的胚性細(xì)胞懸浮系原生質(zhì)體和葉肉原生質(zhì)體。對雙親原生質(zhì)體采用聚乙二醇或電融合法誘導(dǎo)融合，電融合參數(shù)為交變電場強(qiáng)度125V/cm，作用時間60s，直流電場強(qiáng)度1250V/cm，波寬30-50us，脈沖間隔0.5s，脈沖個數(shù)5個。電融合后離心3-5分鐘，在BH3培養(yǎng)基上進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)，及時降低參透壓并擴(kuò)大培養(yǎng)面，再生胚狀體經(jīng)誘導(dǎo)生芽、生根或試管嫁接后移至土壤中。采用蘇木精染色法對再生植株進(jìn)行根尖或莖尖染色體計(jì)數(shù)，確定倍性水平。對雙親及再生四倍體植株進(jìn)行POX、GOT同工酶分析或RAPD分析，綜合鑒定出種間、屬間異源四倍體體細(xì)胞雜種植株。雜種植株開花后，以醋酸洋紅染色法和發(fā)芽力測定法明確其育性，將其花粉授與沙田柚品種，以刺激沙田柚座果。沙田柚果實(shí)成熟時，產(chǎn)生癟粒種子或種痕。
本發(fā)明的效果是通過細(xì)胞融合技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測技術(shù)，人工創(chuàng)造了一批柑桔種間、屬間體細(xì)胞雜種植株，并針對國內(nèi)外柚生產(chǎn)中的問題，創(chuàng)造性地提出了以柑桔體細(xì)胞雜種花粉授于二倍體柚果實(shí)進(jìn)而生產(chǎn)無籽柚果實(shí)的新思路，這一發(fā)明已經(jīng)得到多次實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐的證實(shí)。到目前為止已獲得柑橘屬間提細(xì)胞雜種7個，種間雜種9個，如實(shí)施例一的表1所示。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施必將對我國無籽柚果實(shí)產(chǎn)業(yè)化和柚子果品的出口產(chǎn)生積極的影響。
本發(fā)明的積極效果還可以通過以下的實(shí)施例得到說明表2本發(fā)明培育的柑橘體細(xì)胞雜種花粉授以沙田柚果實(shí)的種籽狀況
由表2可見，與對照相比(用普通二倍體酸柚授粉)，授體細(xì)胞雜種花粉后的沙田柚果實(shí)飽滿種子由對照的48.3粒/果下降到1粒/果，最少的為0粒飽滿種子。
與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1)細(xì)胞融合方法創(chuàng)造異源四倍體，不僅克服了不同種間、屬間的生殖隔離，效率較高，而且比同源四倍體花粉育性高。2)我國柚產(chǎn)區(qū)人工授粉較為普遍，以柑桔異源四倍體體細(xì)胞雜種花粉代替二倍體酸柚花粉，授與沙田柚，不僅不影響座果和產(chǎn)量，果實(shí)由多籽變無籽，而且果實(shí)含糖量提高了1-2個百分點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)癟籽柚果實(shí)的方法，包括原生質(zhì)體融合，培養(yǎng)再生，倍性及雜種性鑒定，育性檢測，有性雜交過程，其特征在于，采用細(xì)胞融合，經(jīng)培養(yǎng)，鑒定，獲得柑桔異源四倍體體細(xì)胞雜種，將其花粉授與二倍體柚，直接生產(chǎn)種子敗育的癟籽柚果實(shí)。
全文摘要
一種生產(chǎn)癟籽柚果實(shí)的方法,屬于植物新品種選育技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于,通過細(xì)胞融合獲得種間、屬間異源四倍體體細(xì)胞雜種,并采用細(xì)胞學(xué)、同工酶、RAPD等方法進(jìn)行遺傳鑒定,將柑桔體細(xì)胞雜種花粉授與二倍體單胚性多籽柚品種,直接生產(chǎn)出癟籽柚果實(shí)。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明既能提高柚子的座果率,又能直接大量生產(chǎn)種子敗育的癟籽柚。
文檔編號A01H1/02GK1329820SQ0010961
公開日2002年1月9日 申請日期2000年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月19日
發(fā)明者鄧秀新, 郭文武, 伊華林, 劉繼紅, 夏仁學(xué), 孫中海 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)