具有免疫增強(qiáng)活性的包含寡核苷酸的復(fù)合體及其用圖【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明設(shè)及具有免疫刺激活性的包含寡核巧酸的復(fù)合體及其用途。更具體而言，本發(fā)明設(shè)及包含具有免疫刺激活性的CpG寡脫氧核巧酸(0DN)和β-葡聚糖的復(fù)合體及其藥物用途?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]CpG寡脫氧核巧酸(CpG0DN)是包含免疫刺激CpG基序的短的（約20個(gè)堿基對(duì)）、單鏈的合成DNA片段，是Toll樣受體9(化R9)的有效激動(dòng)劑，活化樹(shù)突細(xì)胞(DC)和B細(xì)胞W產(chǎn)生I型干擾素（IFN)和炎性細(xì)胞因子(非專利文件1、2)，并且作為對(duì)于化1型體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答(包括細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞(CTL)應(yīng)答）的佐劑(非專利文件3、4)。因此，CpG0DN已假定為針對(duì)傳染病、癌癥、哮喘和花粉癥的可能的免疫治療劑(非專利文件2、5)。[0003]存在至少四種類型的CpG0DN，其每一種具有不同的骨架、序列和免疫刺激特性(非專利文件6)。0(也稱為A)型CpG0DN通常包含具有憐酸二醋(P0)骨架和硫代憐酸醋(PS)多G尾的一個(gè)回文CpG基序，其活化類漿細(xì)胞DC(pDC)W產(chǎn)生大量的IFN-a，但無(wú)法誘導(dǎo)pDC成熟和B細(xì)胞活化(非專利文件7、8)。其他Ξ類0DN由PS骨架組成。Κ(也稱為B)型CpG0DN含有非回文的多CpG基序，并且強(qiáng)烈活化B細(xì)胞W產(chǎn)生比-6和pDCW成熟，但幾乎不產(chǎn)生IFN-a(非專利文件8、9)。近期，C和P型CpG0DN已被開(kāi)發(fā);運(yùn)些分別含有一個(gè)和兩個(gè)回文CpG序列，其兩個(gè)均可W如K型活化B細(xì)胞和如D型活化pDC，盡管相比于P型CpG0DN，C型CpG0DN誘導(dǎo)較弱的IFN-a產(chǎn)生(非專利文件10-12)。許多優(yōu)秀的K型CpG0DN描述于專利文件1中。[0004]D和P型CpG0DN已顯示形成高級(jí)結(jié)構(gòu)化ogsteen堿基配對(duì)W分別形成稱為G四聯(lián)體(tetrad)的平行四倍結(jié)構(gòu)和順式和反式回文部分之間的沃森克里克堿基配對(duì)，其對(duì)于通過(guò)pDC的活躍的IFN-a產(chǎn)生是必需的（非專利文件12-14)。盡管此類更高級(jí)結(jié)構(gòu)似乎對(duì)于定位至早期內(nèi)體和經(jīng)化R9的信號(hào)傳導(dǎo)是必需的，但它們受制于產(chǎn)物多態(tài)性、聚集和沉淀，因而阻礙了其臨床應(yīng)用(非專利文件15)。因此，僅K和C型CpG0DN通常可用作免疫治療劑和疫苗佐劑用于人使用(非專利文件16和17)。雖然K型CpG0DN在人臨床試驗(yàn)中增強(qiáng)祀向傳染病和癌癥的疫苗的免疫原性(非專利文件6、16)，但抗原和K型CpG0DN之間的化學(xué)和物理結(jié)合對(duì)于最優(yōu)佐劑效應(yīng)是必需的。運(yùn)些結(jié)果表明運(yùn)四種(K、D、P和C)類型的CpG0DN具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，然而開(kāi)發(fā)活化B細(xì)胞和pDC兩者而無(wú)聚集的"一體化(all-in-one)"CpG0DN尚未完成。[0005]裂權(quán)菌多糖(SPG)，一種來(lái)源于裂權(quán)菌(Schizophyllumcommune)的可溶性β-1,3-葡聚糖，是在日本被批準(zhǔn)作為宮頸癌患者的放療增強(qiáng)劑的藥物，持續(xù)最近Ξ十年(非專利文件18)。類似地，香茹多糖化NT)，一種來(lái)源于香茹的可溶性β-1,3-葡聚糖，是于1985年批準(zhǔn)的藥物，且與氣喀晚藥物組合使用，用于無(wú)法實(shí)施手術(shù)的和復(fù)發(fā)性胃癌患者（非專利文件19、20)。護(hù)1，3-葡聚糖已顯示與多脫氧腺巧酸((^)形成作為^鏈螺旋結(jié)構(gòu)的復(fù)合體(非專利文件21)。[0006]專利文件2-4公開(kāi)了包括裂權(quán)菌多糖和核酸(基因）作為基因載體的β-1,3-葡聚糖的復(fù)合體的用途。運(yùn)些文件描述了形成復(fù)合體增強(qiáng)了基因的反義作用及其針對(duì)核酸酶的抗性作用。[0007]專利文件5公開(kāi)了具有β-1，3-鍵的多糖作為載體(轉(zhuǎn)染劑)增強(qiáng)具有CpG序列的免疫刺激寡核巧酸的用途，其中憐酸二醋鍵被硫代憐酸醋鍵或二硫代憐酸醋鍵所取代。[000引專利文件6公開(kāi)了由免疫刺激寡核巧酸和具有長(zhǎng)的β-1,6-葡糖巧鍵側(cè)鏈的β-1,3-葡聚糖組成的免疫刺激復(fù)合體。[0009]本發(fā)明人之前證實(shí)與SPG形成復(fù)合體的與在5'端具有憐酸二醋鍵的多dA連接的小鼠和人源化CpG0DN增強(qiáng)細(xì)胞因子產(chǎn)生并且用作流感疫苗佐劑和用于化2細(xì)胞相關(guān)疾病的預(yù)防劑和治療劑(非專利文件22、23,專利文件7)。當(dāng)多(dA)加入到K型和D型的各CpG的5'端W形成與SPG的復(fù)合體時(shí)，兩者顯示增強(qiáng)的活性同時(shí)保持K型和D型的特性。然而，實(shí)現(xiàn)朝向其更有效且更成本節(jié)約的臨床前W及臨床開(kāi)發(fā)的CpG-SPG復(fù)合體的高產(chǎn)量是困難的。近期，當(dāng)具有硫代憐酸醋鍵的多（dA)連接至CpG0DN時(shí)，復(fù)合體形成的效率評(píng)價(jià)接近100%(非專利文件24)。然而，仍未進(jìn)行徹底的研究W鑒定最佳的人源化CpG序列和因素的優(yōu)化W獲得四種類型的CpG0DN的"一體化"活性。[0010]專利文件8公開(kāi)了抗原/CpG寡核巧酸/β-1,3-葡聚糖類型Ξ元復(fù)合體的生產(chǎn)方法。[00川[文件列表][專利文件]專利文件1:US8,030,285Β2專利文件2:WO01/034207A1專利文件3:WO02/072152A1專利文件4:JP-A-2004-107272專利文件5:W02004/100965A1專利文件6:JP-A-2007-70307專利文件7:JP-A-2008-100919專利文件8:JP-A-2010-174107[非專利文件]非專利文件1,Η.,等人.AToll-likereceptorrecognizesbacterialDM.NaUire408，740-745(2000).非專利文件2:Krie邑，A.Μ.TherapeuticpotentialofToll-likereceptor9activation.Naturereviews.Drugdiscovery5,471-484(2006).非專利文件3:化azolotMillan,C丄.，Weeratna,R.,Krieg,A.M.,Siegrist,C.A.&Davis,H.L.CpGDNAcaninducestrongThlhumoralandcell-mediatedimmuneresponsesagainsthepatitisBsurfaceantigeninyoungmice.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica95,15553-15558(1998).非專利文件4:Chu,R.S.，Targoni,O.S.，Krieg,A.M.，Lehmann,P.V.&Harding,C.V.CpGoligodeoxynucleotidesactasadjuvantsthatswitchonThelper1(Thl)immunity.TheJournalofexperimentalmedicine186,1623-1631(1997).非專矛U文件5:Klinman,D.M.ImmunotherapeuticusesofCpGoligodeoxynucleotides.Naturereviews.Immunology4，249-258(2004).非專利文件6:Vollmer，J.&Krieg，A.M.ImmunotherapeuticapplicationsofCpGoligodeoxynucleotideTL民9agonists.Advanceddrugdeliveryreviews61，195-204(2009).非專禾U文件7:Krug，A.，IdentificationofCpGoligonucleotidesequenceswithhighinductionofIFN-alpha/betainplasmacytoiddendriticcells.Europeanjournalofimmunology31，2154-2163(2001).非專利文件8:Vei'thelyi,D·，Ishii,K.J·，Gursel,M·，Takeshita,F.&Klinman,D.M.HumanperipheralbloodcellsdifferentiallyrecognizeandrespondtotwodistinctCPGmotifs.Journalofimmunology166，2372-2377(2001).非專利文件9:Hartmann，G.&Krieg，A.M.MechanismandfunctionofanewlyidentifiedCpGDNAmotifinhumanprimaryBcells.Journalofimmunology164，944-953(2000).非專利文件l〇:Hartmann,G·，等人.RationaldesignofnewCpGoligonucleotidesthatcombineBcellactivationwithhighIFN-alphainductioninplasmacytoiddendriticcells.Europeanjournalofimmunology33，1633-1641(2003).非專利文件ll:Marshall，J.D·，等人.IdentificationofanovelCpGDNAclassandmotifthatoptimallystimulateBcellandplasmacytoiddendriticcellfunctions.Journalofleukocytebiology73，781-792(2003).非專利文件12:Samulowitz，U.，等人.Anovelclassofimmune-stimulatoryCpGoligodeoxynucleotidesunifieshighpotencyintypeIinterferoninductionwithpreferredstructuralproperties.Oligonucleotides20，93-101(2010).非專利文件13:Kerkmann，M.，等人.Spontaneousformationofnucleicacid-b過(guò)sedn過(guò)nop過(guò)rticlesisresponsibleforhighinterferon-過(guò)Iph過(guò)inductionbyCpG-Ainplasmacytoiddendriticcells.TheJournalofbiologicalchemistry280,8086-8093(2005).非專利文件14:Klein，D.C·，Latz,E·，Espevik，T.&Stokke,B.T.Higherorderstructureofshortimmunostimulatoryoligonucleotidesstud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