一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]常規(guī)的細(xì)胞水平、動(dòng)物水平的藥物篩選方法不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且容易受到多重因素的干擾，假陽性、假陰性率較高，也很難確定藥物作用的靶點(diǎn)，并且需要大量的被篩選化合物。近十年來，隨著生物檢測(cè)技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，分子水平的藥物篩選方法不斷涌現(xiàn)，如:表面等離子體共振法、核磁共振法、下游信號(hào)分子檢測(cè)法、熒光偏振法、虛擬篩選法等等，每種方法有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，都屬于間接的篩選方法。至今還沒有以受體空間構(gòu)象變化為指針，可以直接、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)受體對(duì)藥物反應(yīng)的高靈敏度的篩選法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，根據(jù)受體空間構(gòu)象變化為指針，可以直接、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)受體對(duì)藥物反應(yīng)的高靈敏度的篩選法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，篩選方法包括了以下步驟:
[0005]步驟I:構(gòu)建的褪黑素受體2分子探針:
[0006]A.用PCR的方法將VSV-G tag及限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分別引入人褪黑素的cDNA的5 ’端，并用Over lapping PCR法將eCFP的cDNA連接到受體cDNA的3 ’端，將“受體-eCFP”連接到pcDNA5/FRT/T0 載體，從而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受體-eCFP 質(zhì)粒；
[0007]B.用突變法將eYFP熒光基團(tuán)的cDNA接入質(zhì)粒中受體第三內(nèi)環(huán)中，從而得原始的分子探針質(zhì)粒；
[0008]C.用探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)，以表達(dá)受體分子探針，并用市售的受體激動(dòng)劑激活探針，用Olympus高速熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)探針的靈敏度；
[0009]D.根據(jù)探針靈敏度的監(jiān)測(cè)結(jié)果，對(duì)探針進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化；
[0010]步驟2:建立誘導(dǎo)表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體分子探針的Flp-1n T-Rex HEK293細(xì)胞系:
[0011]A.將優(yōu)化后的分子探針質(zhì)粒和pOG44載體共轉(zhuǎn)染Flp-1n T-Rex HEK293細(xì)胞，并用200ug/ml Hygromycin篩選陽性細(xì)胞克??；
[0012]B.用lug/ml Doxycycline誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體分子探針，用VSV抗體檢測(cè)探針蛋白的表達(dá)，用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)分子探針的細(xì)胞定位；
[0013]C.用受體激動(dòng)劑處理已經(jīng)表達(dá)的受體分子探針Flp-1nT-Rex HEK293細(xì)胞，得到不同激動(dòng)劑劑量的受體激活的FRET曲線，并在停止給藥后繼續(xù)用生理鹽水洗脫激動(dòng)劑。
[0014]其中，步驟I中對(duì)探針進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化具體如下:
[0015]褪黑素受體共有363個(gè)氨基酸殘基，將CFP熒光基團(tuán)接于五羥色胺受體C端第363氨基酸之后，調(diào)整eYFP基團(tuán)在受體第三內(nèi)環(huán)的位置:將eYFP基團(tuán)置于第238-239位氨基酸之間。
[0016]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0017]1.本發(fā)明采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法建立了褪黑素受體2分子探針，該分子探針具有高靈敏度，低噪音，高通量的特點(diǎn)，不僅能篩選受體激動(dòng)劑也能篩選拮抗劑/反向激動(dòng)劑，并且篩選過程不受下游信號(hào)的干擾。
[0018]2.經(jīng)過合理設(shè)計(jì)的分子探針能夠?qū)χ兴幓旌衔镞M(jìn)行篩選，能一步到位的在受體水平上篩選到分子作用靶點(diǎn)明確的先導(dǎo)化合物。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明分子探針的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0022]實(shí)施例1
[0023]如圖1所示，本發(fā)明公開了一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，篩選方法包括了以下步驟:
[0024]步驟I:構(gòu)建的褪黑素受體2分子探針:
[0025]A.用PCR的方法將VSV-G tag及限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分別引入人褪黑素的cDNA的5 ’端，并用Over lapping PCR法將eCFP的cDNA連接到受體cDNA的3 ’端，將“受體-eCFP”連接到pcDNA5/FRT/T0 載體，從而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受體-eCFP 質(zhì)粒；
[0026]B.用突變法將eYFP熒光基團(tuán)的cDNA接入質(zhì)粒中受體第三內(nèi)環(huán)中，從而得原始的分子探針質(zhì)粒；
[0027]C.用探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)，以表達(dá)受體分子探針，并用市售的受體激動(dòng)劑激活探針，用Olympus高速熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)探針的靈敏度；
[0028]D.根據(jù)探針靈敏度的監(jiān)測(cè)結(jié)果，對(duì)探針進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，褪黑素受體共有363個(gè)氨基酸殘基，將CFP熒光基團(tuán)接于五羥色胺受體C端第363氨基酸之后，調(diào)整eYFP基團(tuán)在受體第三內(nèi)環(huán)的位置:將eYFP基團(tuán)置于第238-239位氨基酸之間。
[0029]步驟2:建立誘導(dǎo)表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體分子探針的Flp-1n T-Rex HEK293細(xì)胞系:
[0030]A.將優(yōu)化后的分子探針質(zhì)粒和pOG44載體共轉(zhuǎn)染Flp-1n T-Rex HEK293細(xì)胞，并用200ug/ml Hygromycin篩選陽性細(xì)胞克隆；
[0031]B.用lug/ml Doxycycline誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體分子探針，用VSV抗體檢測(cè)探針蛋白的表達(dá)，用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)分子探針的細(xì)胞定位；
[0032]C.用受體激動(dòng)劑處理已經(jīng)表達(dá)的受體分子探針Flp-1nT-Rex HEK293細(xì)胞，得到不同激動(dòng)劑劑量的受體激活的FRET曲線，并在停止給藥后繼續(xù)用生理鹽水洗脫激動(dòng)劑。
[0033]實(shí)施例2
[0034]實(shí)驗(yàn)?zāi)康募胺椒?為了驗(yàn)證本發(fā)明制備分子探針的可行性和有效性，本實(shí)施例分別以生理鹽水、陽性對(duì)照藥物Rame Iteon和人參粗提物分別研究三者對(duì)褪黑素受體2分子探針熒光共振能量轉(zhuǎn)移變化，具體的實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例1所述，此處不再贅述。
[0035]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:如圖2所示，將表達(dá)褪黑素受體2分子探針的細(xì)胞置于高速熒光顯微鏡下，分別用生理鹽水、陽性對(duì)照藥物Rame Iteon和人參粗提物處理細(xì)胞，監(jiān)測(cè)褪黑素受體2分子探針的熒光共振能量轉(zhuǎn)移變化，實(shí)驗(yàn)證明褪黑素受體2分子探針能對(duì)生理鹽水并無明顯反應(yīng)、對(duì)陽性對(duì)照藥物Rame Iteon發(fā)生高靈敏度的反應(yīng)，對(duì)人參粗提物也有與陽性對(duì)照藥物Rame Iteon相似的反應(yīng)，可以初步證明人參粗提物含有作用于褪黑素受體2分子探針的活性成分。當(dāng)陽性藥物Rame Iteon作用于探針時(shí)(第15s開始)，F(xiàn)RET信號(hào)值降低(第15s至30s)，當(dāng)撤去藥物(31s后)FRET信號(hào)值恢復(fù)，說明激動(dòng)劑Rame Iteon與褪黑素受體2分子探針的結(jié)合使探針的兩個(gè)熒光基團(tuán)空間距離增大，降低了能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)人參粗提物作用于探針時(shí)(第15s開始)，F(xiàn)RET信號(hào)值升高(第15s至30s)，當(dāng)撤去藥物(31s后)FRET信號(hào)值得到一定恢復(fù)，說明人參粗提物中的成分與褪黑素受體2分子探針的結(jié)合使探針的兩個(gè)熒光基團(tuán)空間距尚減小，提尚了能量轉(zhuǎn)移。
[0036]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，其特征在于，所述的篩選方法包括了以下步驟: 步驟I:構(gòu)建的褪黑素受體2分子探針: A.用PCR的方法將VSV-Gtag及限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分別弓丨入人褪黑素的cDNA的5 ’端，并用Overlapping PCR法將eCFP的cDNA連接到受體cDNA的3 ’端，將“受體-eCFP”連接到pcDNA5/FRT/T0 載體，從而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受體-eCFP 質(zhì)粒； B.用突變法將eYFP熒光基團(tuán)的cDNA接入質(zhì)粒中受體第三內(nèi)環(huán)中，從而得原始的分子探針質(zhì)粒； C.用探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)，以表達(dá)受體分子探針，并用市售的受體激動(dòng)劑激活探針，用Olympus高速熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)探針的靈敏度； D.根據(jù)探針靈敏度的監(jiān)測(cè)結(jié)果，對(duì)探針進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化； 步驟2:建立誘導(dǎo)表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體分子探針的Flp-1nT-Rex HEK293細(xì)胞系: A.將優(yōu)化后的分子探針質(zhì)粒和pOG44載體共轉(zhuǎn)染Flp-1nT-RexHEK293細(xì)胞，并用200ug/mlHygromycin篩選陽性細(xì)胞克??； B.用lug/mlDoxycycline誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體分子探針，用VSV抗體檢測(cè)探針蛋白的表達(dá)，用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)分子探針的細(xì)胞定位； C.用受體激動(dòng)劑處理已經(jīng)表達(dá)的受體分子探針Flp-1nT-RexHEK293細(xì)胞，得到不同激動(dòng)劑劑量的受體激活的FRET曲線，并在停止給藥后繼續(xù)用生理鹽水洗脫激動(dòng)劑。2.如權(quán)利要求1所述的一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，其特征在于:所述的步驟I中對(duì)探針進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化具體如下: 褪黑素受體共有363個(gè)氨基酸殘基，將CFP熒光基團(tuán)接于五羥色胺受體C端第363氨基酸之后，調(diào)整eYFP基團(tuán)在受體第三內(nèi)環(huán)的位置:將eYFP基團(tuán)置于第238-239位氨基酸之間。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，包括了構(gòu)建的褪黑素受體2分子探針和建立誘導(dǎo)表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體分子探針的Flp-In？T-Rex？HEK293細(xì)胞系，采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法建立了褪黑素受體2分子探針，該分子探針具有高靈敏度，低噪音，高通量的特點(diǎn)，不僅能篩選受體激動(dòng)劑也能篩選拮抗劑/反向激動(dòng)劑，并且篩選過程不收下游信號(hào)的干擾；經(jīng)過合理設(shè)計(jì)的分子探針能夠?qū)χ兴幓旌衔镞M(jìn)行篩選，能一步到位的在受體水平上篩選到分子作用靶點(diǎn)明確的先導(dǎo)化合物。
【IPC分類】C12N15/62, C12Q1/02, C12N5/10, C12N15/85
【公開號(hào)】CN105648025
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】徐天瑞, 楊洋, 劉瑩, 王珍
【申請(qǐng)人】昆明理工大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年3月2日