山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]我國有著豐富的山羊品種資源，但是由于受繁殖率以及生長性能的影響，我國山羊的養(yǎng)殖還有很大的提升空間。隨著國民生活水平的不斷提高，由于山羊肉營養(yǎng)豐富，肉質鮮美，受到越來越多的消費者的青睞。
[0003]骨骼肌衛(wèi)星細胞是由Mauro于1961年首先發(fā)現(xiàn)的，它是一種位于肌細胞膜和基底膜之間的具有增殖和分化能力的肌源性干細胞，以后進一步證實肌衛(wèi)星細胞參與了骨骼肌的生長和修復，具有自我增值和多向分化的能力，維持著體內肌肉干細胞池的穩(wěn)定，在骨骼肌的生長和再生中起著重要的作用。自從被發(fā)現(xiàn)有干性以來一直是研究熱點，如何從動物骨骼肌組織中分離獲得一定數(shù)量且純度高的骨骼肌衛(wèi)星細胞是研究骨骼肌衛(wèi)星細胞的所有學者所追求的目標。近年來對于骨骼肌衛(wèi)星細胞系的分離方法進展不是很大，本發(fā)明通過對山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞系體外分離培養(yǎng)技術的優(yōu)化，以期獲得高質量的骨骼肌衛(wèi)星細胞，為骨骼肌的研究提供重要的工具材料。對于骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)能夠幫助我們深入了解骨骼肌的生長發(fā)育過程。同時也可以幫助我們更好地理解一些疾病的致病機理，同時在改良畜產品的生產效率上提供可靠的理論支持。
[0004]骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離技術發(fā)展由來已久，最早于1974年由Bischoff分離得到的。之后在各個物種中相繼分離出了骨骼肌衛(wèi)星細胞。目前分離骨骼肌衛(wèi)星細胞的方法主要有兩步酶法和組織塊法，但是各有利弊。近年的研究表明，骨骼肌衛(wèi)星細胞具有無限增值能力屬于干細胞，具有多向分化能力。骨骼肌衛(wèi)星細胞系的建立有助于了解肌肉的發(fā)育過程，為生物育種提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離純化方法。
[0006]為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是，山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離純化方法，包括以下步驟:
[0007](I)采集山羊肌肉組織，先用酒精清洗消毒，再用生理鹽水沖洗后放入DMEM/F12培養(yǎng)基中，于12h之內進行骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離；
[0008](2)用含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗肌肉組織，將其剪成0.5X0.5cm的大組織塊；
[0009](3)將獲得的大組織塊放入培養(yǎng)皿中，加入0.25 %胰蛋白酶-EDTA進行消化，保證胰蛋白酶能夠完全沒過大組織塊，4 V條件下靜置12h，加入增殖培養(yǎng)基終止消化;之后將培養(yǎng)皿中的大組織塊連同培養(yǎng)液轉移至50ml的離心管內，1000r/min離心8min，吸除上清液，再用增殖培養(yǎng)液重懸，用無菌吸管將大組織塊及培養(yǎng)液轉移至培養(yǎng)皿中；
[0010](4)將步驟(3)得到的大組織塊再剪成0.5?Imm3的小組織塊，再加入適量的增殖培養(yǎng)液，將小組織塊均勻地鋪開在培養(yǎng)皿中，各小組織塊之間的間距在3_，吸去培養(yǎng)基，待小組織塊充分吸附于培養(yǎng)瓶后，再把培養(yǎng)瓶翻轉過來觀察小組織塊是否充分吸附于培養(yǎng)瓶上，再慢慢加入預熱至37°C的培養(yǎng)液，重新置于細胞培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況，每兩天更換培養(yǎng)液;待細胞長至80 %?90 %匯合度時，吸去培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)液，用預熱至37°C的PBS清洗細胞，以去除殘余的血清和組織塊及死細胞，重復2次，從而得到未純化的山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞；
[0011](5)采用差速貼壁法進行原代山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的純化:首先將步驟(4)得到的未純化貼壁細胞用DPBS洗滌3次，胰酶消化3min，加入2倍體積增殖培養(yǎng)液終止消化；1500r/min離心7min，收集細胞，加入增殖培養(yǎng)液重懸;按5 X 14?8 X 14個接種至事先包被有明膠的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)Ih，當有大量細胞貼壁時取上層未貼壁的懸浮細胞重新接種至新的培養(yǎng)皿上，此時貼壁的細胞主要為成纖維細胞，由于骨骼肌衛(wèi)星細胞的貼壁速度較慢，此步驟重復2?3次，第4天換液，去除血細胞及未貼壁的死細胞，并觀察細胞生長情況，此后連續(xù)5天進行骨骼肌衛(wèi)星細胞的純化。
[0012]作為優(yōu)選，在步驟(2)中，所述青霉素的濃度為500IU/ml，所述鏈霉素的濃度為500yg/ml0
[0013]作為優(yōu)選，在步驟(3)中，所述增殖培養(yǎng)基的成分為80%DMEM/F12+10 %胎牛血清+10%馬血清。
[0014]作為優(yōu)選，在步驟(3)中，加入3ml的0.25%胰蛋白酶-EDTA進行消化。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:采用胰蛋白酶消化和組織塊法相結合進行骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離，在細胞傳代時繼續(xù)進行差速貼壁法進行山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的純化，并通過后期傳代過程中連續(xù)5代以上繼續(xù)采用差速貼壁法進行山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的純化，得到了純度更高的骨骼肌衛(wèi)星細胞。
【具體實施方式】
[0016]本實施例是一種山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離純化方法，包括以下步驟:
[0017]1、山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離
[0018](I)首先將實驗室中用到的實驗臺、器材等消毒滅菌，配制相應的試劑，試劑包括含有雙抗的PBS、含有雙抗的生理鹽水、細胞培養(yǎng)液等。
[0019](2)采集離體的黃淮山羊的肌肉組織，先用75%的酒精充分清洗消毒，用含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗肌肉組織，其中青霉素和鏈霉素的濃度分別為500IU/ml和500μg/ml，然后去除脂肪和結締組織，盡量沖去表面的血漬和污漬，將其剪成0.5X0.5cm大小的組織塊，并要求在兩個小時之內進行原代細胞的分離。
[0020](3)將取回的組織送至實驗室后，先將組織塊放在75%的酒精中浸泡15分鐘，再用含有雙抗的生理鹽水沖洗表面，最后用酒精噴灑表面，然后用含有雙抗的PBS沖洗組織樣的表面3遍，最后用不含雙抗的PBS沖洗一遍。
[0021](4)將充分消毒的肌肉組織置于消毒、滅菌的托盤上，連同托盤送至照過紫外的超凈臺中。之后在體視顯微鏡下撕開肌肉束，并用玻璃棒輕輕擠壓，以釋放出成纖維細胞等部分雜細胞。
[0022](5)然后加入適量的0.25%胰酶-EDTA進行消化，4°C條件下靜置12h，然后用吸管將組織塊轉移至50ml的離心管內，將獲得的肌絲在含有雙抗的I3BS中洗滌2?3次，每次I?2min，吸掉最后一次的洗滌液。將組織塊切成Imm3大小的組織塊，再加入2ml增殖培養(yǎng)液，用無菌吸管將組織塊轉移至處理過的培養(yǎng)瓶中，并均勻地鋪開在培養(yǎng)瓶中，每小塊之間的間距在5mm，吸去培養(yǎng)基后倒置，待組織塊充分吸附于培養(yǎng)瓶后，翻轉培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)液沒過組織塊，再慢慢加入37°C預熱的培養(yǎng)液5ml。重新置于5%C02濃度的飽和培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況，每兩天更換培