一種心肌組織工程產(chǎn)品及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)為支架材料的心肌組織工程產(chǎn)品及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]心肌組織工程是融合細(xì)胞生物學(xué)、生物材料學(xué)和工程學(xué)的原理和技術(shù)，將具有形成心肌組織能力的種子細(xì)胞與具有良好生物相容性、可降解性與一定的生物力學(xué)特性的生物支架材料復(fù)合，體外構(gòu)建出能夠進(jìn)行心肌移植、修復(fù)心肌損傷的工程化心肌組織，其主要研宄內(nèi)容涉及種子細(xì)胞、支架材料以及工程化心肌組織構(gòu)建等三個(gè)方面。其中，生物支架材料的選擇是開展工程化心肌組織構(gòu)建的關(guān)鍵。
[0003]組織工程支架材料需要具備良好的生物相容性，沒有免疫原性，合適的降解時(shí)間，且應(yīng)該具有一定的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性支持細(xì)胞的生長和分化。心肌組織工程對支架材料的要求又有其特殊性:首先，心臟是全身灌注率和耗氧率最高的器官之一，與其他組織相比，心肌細(xì)胞對缺血異常敏感，因此支架材料應(yīng)具有良好的生物通透性，有利于營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸。其次，心肌細(xì)胞的活動(dòng)要求支架材料有足夠的彈性、可拉伸性以及機(jī)械穩(wěn)定性。第三，體內(nèi)移植后容易血管化，從而便于與宿主整合。
[0004]目前，心肌組織工程常用的支架材料包括人工合成支架材料以及天然生物材料，這些材料至今都無法完全滿足以上這些標(biāo)準(zhǔn)。因此，研宄人員一直致力于對現(xiàn)有的支架材料進(jìn)行優(yōu)化或研發(fā)新型的生物支架材料以更好的滿足心肌組織工程對生物支架材料的要求。
[0005]脫細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)為心肌組織工程支架材料的選擇指出了新的方向。利用脫細(xì)胞技術(shù)去除組織中各種細(xì)胞成分以及遺傳物質(zhì)而獲得的天然生物支架材料及脫細(xì)胞基質(zhì)材料，保留了細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和天然成分，有利于細(xì)胞粘附、增殖、分化及其生物學(xué)功能的發(fā)揮。目前，研宄人員已經(jīng)獲得了各種不同組織來源的脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料，如小腸、皮膚、角膜、肺、肝、腎等。盡管如此，上述脫細(xì)胞基質(zhì)材料均不能滿足心肌組織工程支架材料的特殊需求。而心臟脫細(xì)胞基質(zhì)本身也存在供體來源短缺的問題。因此，亟需開發(fā)新的基于脫細(xì)胞技術(shù)的心肌組織工程支架材料。
[0006]大網(wǎng)膜是連接胃大彎至橫結(jié)腸的腹膜組織，從胃與腸之間向前膨出，在腸的前方下垂形成皺襞，呈圍裙?fàn)钫诒豢?、回腸。大網(wǎng)膜來源廣泛，高度血管化，富含各類生長因子，且具有很好的力學(xué)性能，目前已廣泛用于各類移植物的體內(nèi)移植平臺(tái)。然而，目前大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)相關(guān)研宄剛剛起步，尚未見以大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)為支架材料，構(gòu)建工程化心肌組織的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了心肌組織工程產(chǎn)品的制備方法，其包括:
[0008](I)制備大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸鈉、DNA酶和胰蛋白酶的脫細(xì)胞液浸泡大網(wǎng)膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理的步驟；以及
[0009](2)構(gòu)建并培養(yǎng)心肌細(xì)胞-大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合體。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了心肌組織工程產(chǎn)品的制備方法，其按照以下操作步驟進(jìn)行:
[0011](I)制備大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料
[0012]將新鮮的大網(wǎng)膜組織震蕩浸泡于由甲醇、氯仿與乙醚以體積比為1:1: 0.2-1混合而成的脫脂溶液中處理，脫脂溶液浸泡時(shí)間為18-30h，震蕩頻率為150-250r/min ;將去除脂肪的大網(wǎng)膜組織于PBS中清洗，并震蕩浸泡于由十二烷基硫酸鈉、DNA酶和胰蛋白酶組成的脫細(xì)胞液中處理，脫細(xì)胞液中十二烷基硫酸鈉、DNA酶和胰蛋白酶含量分別為1-3%重量比的十二烷基硫酸鈉、3500-4500U/L的DNA酶、0.1-0.5%重量比的胰蛋白酶，浸泡時(shí)間為12-24h，震蕩頻率為100-200r/min ;將經(jīng)脫細(xì)胞液處理后的大網(wǎng)膜組織經(jīng)冷凍干燥后輻照滅菌；
[0013](2)構(gòu)建并培養(yǎng)心肌細(xì)胞-大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合體
[0014]將I X 16-1 X 1VmL的心肌細(xì)胞懸液l_3mL接種于步驟⑴制備的大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)材料上，得到復(fù)合構(gòu)建物；將復(fù)合構(gòu)建物培養(yǎng)于37°C、5% CO2孵箱中l(wèi)_2h，然后添加DMEM培養(yǎng)液8-15mL，繼續(xù)培養(yǎng)至第7_21天，每12h更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)結(jié)束即可獲得心肌組織工程產(chǎn)品。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了根據(jù)上述方法獲得的心肌組織工程產(chǎn)品，其包含心肌細(xì)胞和大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料。
[0016]與其他方式構(gòu)建的心肌組織工程產(chǎn)品相比，本發(fā)明中構(gòu)建的心肌組織工程產(chǎn)品以大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)為支架材料，由于大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)具有良好的三維網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)，且富含生長因子，因此其有利于心肌細(xì)胞的生長以及營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，對未來應(yīng)用該心肌組織工程產(chǎn)品進(jìn)行心肌損傷修復(fù)以及以其為模型進(jìn)行心肌治療性藥物篩選等具有重要意義。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了上述心肌組織工程產(chǎn)品在制備用于心肌細(xì)胞再生的藥物中的用途。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了上述心肌組織工程產(chǎn)品在制備用于心肌組織修復(fù)的藥物中的用途。
【附圖說明】
[0019]圖1大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)的掃描電鏡觀察。
[0020]圖2基于大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)的心肌組織工程產(chǎn)品Live/Dead染色X 200。
[0021 ] 圖3心肌組織工程產(chǎn)品CTnT免疫組織化學(xué)染色X 200。
[0022]圖4超聲心動(dòng)圖檢測心臟功能(二尖瓣水平短軸切面)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]在本申請中，縮寫詞的含義如下:
[0024]DMEM:Dulbecco' s modified eagle medium培養(yǎng)液，是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基；
[0025]HEPEs:4-羥乙基哌嗪乙磺酸；
[0026]PBS:磷酸鹽緩沖液；
[0027]SDS:十二烷基硫酸鈉；
[0028]VEGF:血管外源性內(nèi)皮生長因子；
[0029]bFGF:喊性成纖維細(xì)胞生長因子；
[0030]HE染色:蘇木精-伊紅染色；
[0031]EthD-1I1:溴化乙錠同型二聚體-1II ；
[0032]calcein AM:二乙酰甲醋
[0033]DNA酶:脫氧核糖核酸酶；
[0034]min:分鐘。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了心肌組織工程產(chǎn)品的制備方法，其包括:
[0036](I)制備大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸鈉、DNA酶和胰蛋白酶的脫細(xì)胞液浸泡大網(wǎng)膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理的步驟；以及
[0037](2)構(gòu)建并培養(yǎng)心肌細(xì)胞-大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合體。
[0038]在某些實(shí)施方案中，步驟(I)還包括脫脂處理步驟。在示例性實(shí)施方案中，脫脂處理的步驟在脫細(xì)胞處理的步驟之前進(jìn)行。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該脫脂處理的步驟使用體積比為1:1: 0.2-1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液進(jìn)行。在某些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的體積比為1:1: 0.4-0.7。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的體積比為1:1: 0.5。
[0039]在某些實(shí)施方案中，在進(jìn)行脫細(xì)胞處理的過程中還進(jìn)行震蕩。
[0040]在某些具體的實(shí)施方案中，在脫細(xì)胞處理的步驟中，將大網(wǎng)膜組織于PBS中清洗，并震蕩浸泡于包含十二烷基硫酸鈉、DNA酶和胰蛋白酶的脫細(xì)胞液中處理，脫細(xì)胞液中十二烷基硫酸鈉、DNA酶和胰蛋白酶的含量分別為1-3%重量比的十二烷基硫酸鈉、3500-4500U/L DNA酶、0.1-0.5%重量比的胰蛋白酶。在某些更具體的實(shí)施方案中，脫細(xì)胞液由十二烷基硫酸鈉、DNA酶和胰蛋白酶組成。
[0041]在某些示例性的實(shí)施方案中，脫細(xì)胞液中十二烷基硫酸鈉的含量可以為1.0%重量比、1.1 %重量比、1.2%重量比、1.3%重量比、1.4%重量比、1.5%重量比、1.6%重量比、1.7%重量比、1.8%重量比、1.9%重量比、2.0%重量比、2.1%重量比、2.2%重量比、2.3%重量比、2.4%重量比、2.5%重量比、2.6%重量比、2.7%重量比、2.8%重量比、2.9%重量比或3.0%重量比。
[0042]在某些示例性的實(shí)施方案中，脫細(xì)胞液中DNA酶的含量可以為3500U/L、3600U/L、3700U/L、3800U/L、3900U/L、4000U/L、4100U/L、4200U/L、4300U/L、4400U/L 或 4500U/L。
[0043]在某些示例性的實(shí)施方案中，脫細(xì)胞液中胰蛋白酶的含量可以為0.1 %重量比、0.2%重量比、0.3%重量比、0.4%重量比或0.5%重量比。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了心肌組織工程產(chǎn)品的制備方法，其按照以下操作步驟進(jìn)行:
[0045](I)制備大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料
[0046]將新鮮的大網(wǎng)膜組織震蕩浸泡于由甲醇、氯仿與乙醚以體積比為1:1: 0.2-1混合而成的脫脂溶液中處理，脫脂溶液浸泡時(shí)間為18-30h，震蕩頻率為150-250r/min ;將去除脂肪的大網(wǎng)膜組織于PBS中清洗，并震蕩浸泡于由十二烷基硫酸鈉、DNA酶和胰蛋白酶組成的脫細(xì)胞液中處理，脫細(xì)胞液中十二烷基硫酸鈉、DNA酶和胰蛋白酶含量分別為1-3%重量比的十二烷基硫酸鈉、3500-4500U/L的DNA酶、0.1-0.5%重量比的胰蛋白酶，浸泡時(shí)間為12-24h，震蕩頻率為100-200r/min ;將經(jīng)脫細(xì)胞液處理后的大網(wǎng)膜組織經(jīng)冷凍干燥后輻照滅菌；
[0047](2)構(gòu)建并培養(yǎng)心肌細(xì)胞-大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合體
[0048]將I X 16-1 X 1VmL的心肌細(xì)胞懸液l_3mL接種于步驟⑴制備的大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)材料上，得到復(fù)合構(gòu)建物；將復(fù)合構(gòu)建物培養(yǎng)于37°C、5% CO2孵箱中l(wèi)_2h，然后添加DMEM培養(yǎng)液8-15mL，繼續(xù)培養(yǎng)至第7_21天，每12h更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)結(jié)束即可獲得心肌組織工程產(chǎn)品。
[0049]在某些實(shí)施方案中，步驟(I)中新鮮的大網(wǎng)膜組織來源于豬、牛、羊等哺乳類動(dòng)物。
[0050]在本申請中，大網(wǎng)膜是可商購的，可以購自例如屠宰場。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了根據(jù)上述方法獲得的心肌組織工程產(chǎn)品，其包含心肌細(xì)胞和大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料。
[0052]與其他方式構(gòu)建的心肌組織工程產(chǎn)品相比，本發(fā)明中構(gòu)建的心肌組織工程產(chǎn)品以大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)為支架材料，由于大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)具有良好的三維網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)，且富含生長因子，因此其有利于心肌細(xì)胞的生長以及營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，對未來應(yīng)用該心肌組織工程產(chǎn)品進(jìn)行心肌損傷修復(fù)以及以其為模型進(jìn)行心肌