專利名稱：稻谷內(nèi)源性酶激活法生產(chǎn)高gaba功能食品材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品領(lǐng)域，特別是涉及利用稻谷內(nèi)源性酶激活法生產(chǎn)高GABA功能食品材料的方法，改善食物產(chǎn)品結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
作為一種具有多種生理功能的生物活性因子，GABA在美國、日本等國家已廣泛用于營養(yǎng)補(bǔ)充劑和功能食品中，1996年，富含GABA的米胚芽制品在日本實現(xiàn)了商業(yè)化。日本科學(xué)家利用米胚芽等原料開發(fā)制造的富含GABA的功能食品配料，將其應(yīng)用于飲料、果醬、糕點(diǎn)、餅干、調(diào)味料等制品中?，F(xiàn)有報道顯示，應(yīng)用生物技術(shù)制造的高濃度GABA飲料以及利用乳酸菌等制作的富含GABA的食品配料，均可直接作為或者用于抗高血壓、增進(jìn)腦機(jī)能及肝功能的功能食品。上世紀(jì)九十年代中期，日本ORYZA油化學(xué)公司開發(fā)出一種名為GABARICEGERM的保健食品添加劑，其后不久，日本食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會報道了該產(chǎn)品在改善失眠、抑郁和更年期綜合癥等方面的顯著效果，證實了 GABA的多種生理作用，并指出富含GABA的食品是一種功能性食品。2007年日本可口可樂公司推出了面向大眾的、具有放松和抗緊張效果的GABA功能性飲料“AQUARIUS SHARP CHARGE”，GABA產(chǎn)品市場得到了進(jìn)一步的擴(kuò)展，而我國在這方面的研究尚處于起步階段，亟待發(fā)展和提高。利用高產(chǎn)GABA品種的發(fā)芽糙米內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化提高發(fā)芽糙米中GABA的含量，對功能型稻米品種選育，稻米深加工及發(fā)芽糙米食品的研究開發(fā)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種易操作，效果好的稻谷內(nèi)源性酶激活法生產(chǎn)高GABA功能食品材料的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
一種稻谷內(nèi)源性酶激活法生產(chǎn)高GABA功能食品材料的方法，其特征是:
(1)在明確稻米內(nèi)源性谷氨酸脫羧酶特性和活性調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上，采用谷氨酸脫羧酶激活技術(shù)，生產(chǎn)高GABA含量的稻米健康食品；
(2)以富含GABA的發(fā)芽糙米為原料，采用鈍化分解GABA的轉(zhuǎn)氨酶預(yù)處理，生產(chǎn)留胚GABA精白米；
(3)采用含有谷氨酸脫羧酶激活劑和特殊緩沖體系的天然培養(yǎng)液進(jìn)行發(fā)芽；
(4)以米糠、米胚芽作為GAD源，將其固定化后生產(chǎn)富集GABA的食品配料，并將其應(yīng)用到GABA營養(yǎng)配合米粉生產(chǎn)中。一種稻谷內(nèi)源性谷氨酸脫羧酶的制備方法，其特征是:包括下列步驟:
(O Y-氨基丁酸的制備:稱取糙米置于盤中，先用自來水沖洗一遍，洗去表面的雜質(zhì)和灰塵，再加入4倍體積的水浸泡，將浸泡后的糙米均勻地攤于盤中，加入水，蓋上濕潤的紗布，發(fā)芽；然后稱取發(fā)芽糙米，加入水磨成漿狀，制成糙米漿；取一定量的糙米漿，在其中加入底物L(fēng)-谷氨酸、輔酶PLP及激活劑CaCl2，在PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化生成GABA ； (2)谷氨酸脫羧酶提取:稱取發(fā)芽糙米，加入由磷酸緩沖液、維生素B6、EDTA、β-巰基乙醇及NaCL組成的提取緩沖液研磨勻漿，靜置提取后離心，上清液即為谷氨酸脫羧酶提取液；
(3)谷氨酸脫羧酶分離純化:谷氨酸脫羧酶提取液中加入(順4)404至30%飽和度，靜置，冷凍離心去除部分雜蛋白；上清液加入(NH4)2SO4至50%飽和度，靜置，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀，沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液；在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH4+，得到GAD粗酶液，冷凍干燥保存；采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱對米胚GAD進(jìn)行分離,控制米胚GAD的等電點(diǎn)在4.5 4.7，分離采用磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；再取經(jīng)上述處理得到的米胚GAD上Superdex 200凝膠柱，用磷酸鉀緩沖液反復(fù)洗脫，即得分離純化后的谷氨酸脫羧酶。所述的稻谷內(nèi)源性谷氨酸脫羧酶的制備方法，包括下列步驟:
(1)Y-氨基丁酸制備:稱取200g的糙米置于盤中，先用自來水沖洗一遍，洗去表面的雜質(zhì)和灰塵，再加入4倍體積的水于40°C下浸泡12h ;將浸泡后的糙米均勻地攤于鋪有四層紗布的盤中，加入水，蓋上濕潤的紗布，置于35°C下發(fā)芽72h，得發(fā)芽糙米；稱取50g發(fā)芽糙米,加入200mL水用高速組織搗碎機(jī)磨成楽；狀,得糙米楽;；取一定量的糙米衆(zhòng)，在其中加入
9.5mmol/L底物谷氨酸鈉、輔酶PLP、0.2mmol/L激活劑CaCl2，在pH為6.5的PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化生成GABA，控制轉(zhuǎn)化溫度為40.(TC ；
(2)谷氨酸脫羧酶提取:稱取IOOg的發(fā)芽糙米，加入50mmol/LpH5.7磷酸緩沖液，0.5mmol/L 維生素 B6, 2mmol/L EDTA, 0.2% 的 β -巰基乙醇，0.15mol/L NaCL 的提取緩沖液研磨勻漿，定容至IOOOmL,靜置提取2h后離心lOmin，上清液即為GAD提取液；
(3)谷氨酸脫羧酶分離純化:GAD提取液中加入(NH4)2SO4至30%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心去除部分雜蛋白，上清液加入(NH4)2SO4至50%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀，沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH4+，得到GAD粗酶液，冷凍干燥保存；采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱對米胚GAD進(jìn)行分離,控制米胚GAD的等電點(diǎn)在4.7 ;分離采用50mmol/L、pH5.6、1.30mol/L NaCl濃度的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；再取一定量經(jīng)上述離子交換色譜分離并透析除鹽的米胚GAD上Superdex200凝膠柱，用pH5.6，含lmmol/L PLP和lmmol/L PMSF的50mmol/L磷酸鉀緩沖液反復(fù)洗脫，即得分離純化后的GAD。本發(fā)明通過控制發(fā)芽條件，采用降低氧分壓和低pH培養(yǎng)方式，采用含有Ca2+、H+的培養(yǎng)液，進(jìn)行糙米發(fā)芽培養(yǎng)，使發(fā)芽糙米中富集GABA ;采用蒸氣滅酶技術(shù)，鈍化發(fā)芽糙米中Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)活性，提高GABA保存率的問題；采用低溫干燥工藝，降低發(fā)芽糙米中的水分至安全含水量并能夠達(dá)到產(chǎn)品較為疏松的結(jié)構(gòu)，以利于后續(xù)的蒸煮糊化。以米糠、米胚芽作為GAD源，將其固定化后生產(chǎn)富集GABA的食品配料，并將其應(yīng)用到GABA營養(yǎng)配合米粉生產(chǎn)中。加速開發(fā)富含GABA功能因子的食品材料，可作為或者用于抗高血壓、增進(jìn)腦機(jī)能及肝功能的功能食品。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。圖1是本發(fā)明的流程示意圖。
具體實施例方式實施例1:
(l)GABA(Y-氨基丁酸)制備:稱取200g的糙米(糙米由稻谷礱谷并除雜制備)置于淺盤中，先用自來水沖洗一遍,洗去表面的雜質(zhì)和灰塵,再加入4倍體積的水于25°C下浸泡3h。將浸泡后的糙米均勻地攤于鋪有四層紗布的淺盤中，加入適量的水，蓋上濕潤的紗布，置于25°C下發(fā)芽24h并定時噴水。稱取50g發(fā)芽糙米，加入200mL水用高速組織搗碎機(jī)磨成漿狀，取一定量的糙米漿，在其中加入8.0mmol/L底物L(fēng)-谷氨酸、0.2mmol/L輔酶PLP、0.2mmol/L激活劑CaCl2，在pH為6.1的PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化生成GABA，控制轉(zhuǎn)化溫度為 37.5。。。(2)GAD (谷氨酸脫羧酶)提取:稱取IOOg的發(fā)芽糙米，加入50mmol/L磷酸緩沖液(pH5.7), 0.5mmol/L 維生素 B6，2mmol/L EDTA，0.2% 的 β -巰基乙醇，0.15mol/L NaCL 的提取緩沖液研磨勻漿，定容至IOOOmL,靜置提取2h后離心lOmin，上清液即為GAD提取液。(3)GAD(谷氨酸脫羧酶)分離純化:酶提取液中加入(NH4)2SO4至30%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心去除部分雜蛋白。上清液加入(NH4)2SO4至50%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀。沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH5.6, ImmoI/L PLP和lmmol/L PMSF)。在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH4+，得到GAD粗酶液，冷凍干燥保存。采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱對米胚GAD進(jìn)行分離,控制米胚GAD的等電點(diǎn)在4.5。分離采用50mmol/L、pH5.6、0.25mol/L NaCl濃度的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，再取一定量經(jīng)離子交換色譜分離并透析除鹽的米胚GAD (蛋白質(zhì)含量約為5mg/ml)上Superdex 200 凝膠柱，用 ρΗ5.6,含 lmmol/L PLP 和 lmmol/L PMSF 的 SOmmoI /I,憐酸鉀緩沖液反復(fù)洗脫，即得分離純化后的GAD。實施例2:
(l)GABA(Y-氨基丁酸)制備:稱取200g的糙米(糙米由稻谷礱谷并除雜制備)置于淺盤中,先用自來水沖洗一遍,洗去表面的雜質(zhì)和灰塵,再加入4倍體積的水于30°C下浸泡6h。將浸泡后的糙米均勻地攤于鋪有四層紗布的淺盤中，加入適量的水，蓋上濕潤的紗布，置于30°C下發(fā)芽36h并定時噴水。稱取50g發(fā)芽糙米，加入200mL水用高速組織搗碎機(jī)磨成漿狀，取一定量的糙米漿，在其中加入8.5mmol/L底物谷氨酸鈉、輔酶PLP、0.2mmol/L激活劑CaCl2，在pH為6.2的PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化生成GABA，控制轉(zhuǎn)化溫度為38.(TC。(2) GAD (谷氨酸脫羧酶)提取:稱取200g的糙米，加入提取液800ml (50mmol/L憐酸鉀緩沖液，pH5.6, 2mmol/L 疏基乙醇，2mmol/L EDTA, lmmol/L PLP, lmmol/L PMSF 和10%甘油)，用高速分散器打成勻漿，四層紗布過濾，9000g、4°C離心25min，上清液即為米胚GAD提取液。(3)GAD(谷氨酸脫羧酶)分離純化:酶提取液中加入(NH4)2SO4至30%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心去除部分雜蛋白。上清液加入(NH4)2SO4至50%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀。沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH5.6, ImmoI/L PLP和lmmol/L PMSF)。在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH4+，得到GAD粗酶液，冷凍干燥保存。采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱對米胚GAD進(jìn)行分離,控制米胚GAD的等電點(diǎn)在4.6。分離采用50mmol/L、pH5.6、0.50mol/L NaCl濃度的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。再取一定量經(jīng)離子交換色譜分離并透析除鹽的米胚GAD (蛋白質(zhì)含量約為5mg/ml)上Superdex 200 凝膠柱，用 ρΗ5.6,含 lmmol/L PLP 和 lmmol/L PMSF 的 SOmmoI /I,憐酸鉀緩沖液反復(fù)洗脫，即得分離純化后的GAD。實施例3:
(l)GABA(Y-氨基丁酸)制備:稱取200g的糙米(糙米由稻谷礱谷并除雜制備)置于淺盤中,先用自來水沖洗一遍,洗去表面的雜質(zhì)和灰塵,再加入4倍體積的水于35°C下浸泡9h。將浸泡后的糙米均勻地攤于鋪有四層紗布的淺盤中，加入適量的水，蓋上濕潤的紗布，置于30°C下發(fā)芽46h并定時噴水。稱取50g發(fā)芽糙米，加入200mL水用高速組織搗碎機(jī)磨成漿狀，取一定量的糙米漿，在其中加入9.0mmol/L底物谷氨酸鈉、輔酶PLP、0.2mmol/L激活劑CaCl2，在pH為6.3的PBS緩沖液(含50mmol/L磷酸緩沖液(pH5.7),0.2mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)，2mmol/L EDTA，0.2% 的 β -巰基乙醇，0.15mol/L NaCL)中轉(zhuǎn)化生成 GABA，控制轉(zhuǎn)化溫度為38.5°C。(2)GAD (谷氨酸脫羧酶)提取:稱取IOOg的發(fā)芽糙米，加入50mmol/L磷酸緩沖液(pH5.7),0.5mmol/L 維生素 B6，2mmol/L EDTA，0.2% 的 β -巰基乙醇，0.15mol/L NaCL 的提取緩沖液研磨勻漿，定容至IOOOmL,靜置提取2h后離心lOmin，上清液即為GAD提取液。(3)GAD(谷氨酸脫羧酶)分離純化:酶提取液中加入(NH4)2SO4至30%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心去除部分雜蛋白。上清液加入(NH4)2SO4至50%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀。沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH5.6, ImmoI/L PLP和lmmol/L PMSF)。在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH4+，得到GAD粗酶液，冷凍干燥保存。采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱對米胚GAD進(jìn)行分離,控制米胚GAD的等電點(diǎn)在4.7。分離采用50mmol/L、pH5.6、0.75mol/L NaCl濃度的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。再取一定量經(jīng)離子交換色譜分離并透析除鹽的米胚GAD (蛋白質(zhì)含量約為5mg/ml)上Superdex 200 凝膠柱，用 ρΗ5.6,含 lmmol/L PLP 和 lmmol/L PMSF 的 SOmmoI /I,憐酸鉀緩沖液反復(fù)洗脫，即得分離純化后的GAD。實施例4:
(l)GABA(Y-氨基丁酸)制備:稱取200g的糙米(糙米由稻谷礱谷并除雜制備)置于淺盤中,先用自來水沖洗一遍,洗去表面的雜質(zhì)和灰塵,再加入4倍體積的水于35°C下浸泡12h。將浸泡后的糙米均勻地攤于鋪有四層紗布的淺盤中，加入適量的水，蓋上濕潤的紗布，置于35°C下發(fā)芽60h并定時噴水。稱取50g發(fā)芽糙米，加入200mL水用高速組織搗碎機(jī)磨成漿狀，取一定量的糙米漿，在其中加入9.5mmol/L底物谷氨酸鈉、輔酶PLP、0.2mmol/L激活劑CaCl2，在pH為6.4的PBS緩沖液(含50mmol/L磷酸緩沖液(pH5.7),0.5mmol/L維生素B6, 2mmol/L EDTA, 0.2%的β -巰基乙醇，0.15mol/L NaCL)中轉(zhuǎn)化生成GABA,控制轉(zhuǎn)化溫度為39.(TC。(2) GAD (谷氨酸脫羧酶)提取:稱取200g的糙米，加入提取液800ml (50mmol/L憐酸鉀緩沖液，pH5.6, 2mmol/L 疏基乙醇，2mmol/L EDTA, lmmol/L PLP, lmmol/L PMSF 和10%甘油)，用高速分散器打成勻漿，四層紗布過濾，9000g、4°C離心25min，上清液即為米胚GAD提取液。(3)GAD(谷氨酸脫羧酶)分離純化:酶提取液中加入(NH4)2SO4至30%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心去除部分雜蛋白。上清液加入(NH4)2SO4至50%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀。沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH5.6, ImmoI/L PLP和lmmol/L PMSF)。在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH4+，得到GAD粗酶液，冷凍干燥保存。采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱對米胚GAD進(jìn)行分離,控制米胚GAD的等電點(diǎn)在4.6。分離采用50mmOl/L、pH5.6、1.00mOl/L NaCl濃度的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。再取一定量經(jīng)離子交換色譜分離并透析除鹽的米胚GAD (蛋白質(zhì)含量約為5mg/ml)上Superdex 200 凝膠柱，用 ρΗ5.6,含 lmmol/L PLP 和 lmmol/L PMSF 的 SOmmoI /I,憐酸鉀緩沖液反復(fù)洗脫，即得分離純化后的GAD。實施例5:
(I)GABA(y-氨基丁酸)制備:稱取200g的糙米(糙米由稻谷礱谷并除雜制備)置于淺盤中,先用自來水沖洗一遍,洗去表面的雜質(zhì)和灰塵,再加入4倍體積的水于40°C下浸泡12h。將浸泡后的糙米均勻地攤于鋪有四層紗布的淺盤中，加入適量的水，蓋上濕潤的紗布，置于35°C下發(fā)芽72h并定時噴水。稱取50g發(fā)芽糙米，加入200mL水用高速組織搗碎機(jī)磨成漿狀，取一定量的糙米漿，在其中加入9.5mmol/L底物谷氨酸鈉、輔酶PLP、0.2mmol/L激活劑CaCl2，在pH為6.5的PBS緩沖液(含50mmol/L磷酸緩沖液(pH5.7)，0.2mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)，2mmol/L EDTA, 0.2% 的 β -巰基乙醇，0.15mol/L NaCL)中轉(zhuǎn)化生成 GABA，控制轉(zhuǎn)化溫度為40.(TC。(2)GAD (谷氨酸脫羧酶)提取:稱取IOOg的發(fā)芽糙米，加入50mmol/L磷酸緩沖液(pH5.7), 0.5mmol/L 維生素 B6，2mmol/L EDTA, 0.2% 的 β -巰基乙醇，0.15mol/L NaCL 的提取緩沖液研磨勻漿，定容至IOOOmL,靜置提取2h后離心lOmin，上清液即為GAD提取液。(3)GAD(谷氨酸脫羧酶)分離純化:酶提取液中加入(NH4)2SO4至30%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心去除部分雜蛋白。上清液加入(NH4)2SO4至50%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀。沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH5.6, ImmoI/L PLP和lmmol/L PMSF)。在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH4+，得到GAD粗酶液，冷凍干燥保存。采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱對米胚GAD進(jìn)行分離,控制米胚GAD的等電點(diǎn)在4.7。分離采用50mmOl/L、pH5.6、1.30mOl/L NaCl濃度的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。再取一定量經(jīng)離子交換色譜分離并透析除鹽的米胚GAD (蛋白質(zhì)含量約為5mg/ml)上Superdex 200 凝膠柱，用 ρΗ5.6,含 lmmol/L PLP 和 lmmol/L PMSF 的 SOmmoI /I,憐酸鉀緩沖液反復(fù)洗脫，即得分離純化后的GAD。GABA 生成量:935.58 mg/L;谷氨酸轉(zhuǎn)化率:0.8351。
權(quán)利要求
1.一種稻谷內(nèi)源性酶激活法生產(chǎn)高GABA功能食品材料的方法，其特征是: (1)在明確稻米內(nèi)源性谷氨酸脫羧酶特性和活性調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上，采用谷氨酸脫羧酶激活技術(shù)，生產(chǎn)高GABA含量的稻米健康食品； (2)以富含GABA的發(fā)芽糙米為原料，采用鈍化分解GABA的轉(zhuǎn)氨酶預(yù)處理，生產(chǎn)留胚GABA精白米； (3)采用含有谷氨酸脫羧酶激活劑和特殊緩沖體系的天然培養(yǎng)液進(jìn)行發(fā)芽； (4)以米糠、米胚芽作為GAD源，將其固定化后生產(chǎn)富集GABA的食品配料，并將其應(yīng)用到GABA營養(yǎng)配合米粉生產(chǎn)中。
2.一種稻谷內(nèi)源性谷氨酸脫羧酶的制備方法，其特征是:包括下列步驟: (O Y-氨基丁酸的制備:稱取糙米置于盤中，先用自來水沖洗一遍，洗去表面的雜質(zhì)和灰塵，再加入4倍體積的水浸泡，將浸泡后的糙米均勻地攤于盤中，加入水，蓋上濕潤的紗布，發(fā)芽；然后稱取發(fā)芽糙米，加入水磨成漿狀，制成糙米漿；取一定量的糙米漿，在其中加入底物L(fēng)-谷氨酸、輔酶PLP及激活劑CaCl2，在PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化生成GABA ； (2)谷氨酸脫羧酶提取:稱取發(fā)芽糙米，加入由磷酸緩沖液、維生素B6、EDTA、β-巰基乙醇及NaCL組成的提取緩沖 液 研磨勻漿，靜置提取后離心，上清液即為谷氨酸脫羧酶提取液； (3)谷氨酸脫羧酶分離純化:谷氨酸脫羧酶提取液中加入(順4)404至30%飽和度，靜置，冷凍離心去除部分雜蛋白；上清液加入(NH4)2SO4至50%飽和度，靜置，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀，沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液；在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH4+，得到GAD粗酶液，冷凍干燥保存；采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱對米胚GAD進(jìn)行分離,控制米胚GAD的等電點(diǎn)在4.5 4.7，分離采用磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；再取經(jīng)上述處理得到的米胚GAD上Superdex 200凝膠柱，用磷酸鉀緩沖液反復(fù)洗脫，即得分離純化后的谷氨酸脫羧酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的稻谷內(nèi)源性谷氨酸脫羧酶的制備方法，其特征是:包括下列步驟: (1)Y-氨基丁酸制備:稱取200g的糙米置于盤中，先用自來水沖洗一遍，洗去表面的雜質(zhì)和灰塵，再加入4倍體積的水于40°C下浸泡12h ;將浸泡后的糙米均勻地攤于鋪有四層紗布的盤中，加入水，蓋上濕潤的紗布，置于35°C下發(fā)芽72h，得發(fā)芽糙米；稱取50g發(fā)芽糙米,加入200mL水用高速組織搗碎機(jī)磨成楽；狀,得糙米楽;；取一定量的糙米衆(zhòng)，在其中加入·9.5mmol/L底物谷氨酸鈉、輔酶PLP、0.2mmol/L激活劑CaCl2，在pH為6.5的PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化生成GABA，控制轉(zhuǎn)化溫度為40.(TC ； (2)谷氨酸脫羧酶提取:稱取IOOg的發(fā)芽糙米，加入50mmol/LpH5.7磷酸緩沖液，·0.5mmol/L 維生素 B6, 2mmol/L EDTA, 0.2% 的 β -巰基乙醇，0.15mol/L NaCL 的提取緩沖液研磨勻漿，定容至IOOOmL,靜置提取2h后離心lOmin，上清液即為GAD提取液； (3)谷氨酸脫羧酶分離純化:GAD提取液中加入(NH4)2SO4至30%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心去除部分雜蛋白，上清液加入(NH4)2SO4至50%飽和度，4°C靜置lh，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀，沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH4+，得到GAD粗酶液，冷凍干燥保存；采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱對米胚GAD進(jìn)行分離,控制米胚GAD的等電點(diǎn)在4.7 ;分離采用50mmol/L、pH5.6、1.30mol/L NaCl濃度的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；再取一定量經(jīng)上述離子交換色譜分離并透析除鹽的米胚GAD上Superdex200凝膠柱，用pH5.6，含lmmol/L PLP和lmmol/L PMSF的50mmol/L磷酸鉀緩沖液反復(fù)洗脫，即得分離純 化后的GAD。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種稻谷內(nèi)源性酶激活法生產(chǎn)高GABA功能食品材料的方法，在明確稻米內(nèi)源性谷氨酸脫羧酶特性和活性調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上，采用谷氨酸脫羧酶激活技術(shù)，生產(chǎn)高GABA含量的稻米健康食品；以富含GABA的發(fā)芽糙米為原料，采用鈍化分解GABA的轉(zhuǎn)氨酶預(yù)處理，生產(chǎn)留胚GABA精白米；采用含有谷氨酸脫羧酶激活劑和特殊緩沖體系的天然培養(yǎng)液進(jìn)行發(fā)芽；以米糠、米胚芽作為GAD源，將其固定化后生產(chǎn)富集GABA的食品配料，并將其應(yīng)用到GABA營養(yǎng)配合米粉生產(chǎn)中。本發(fā)明方法簡便，可以加速開發(fā)富含GABA功能因子的食品材料，可作為或者用于抗高血壓、增進(jìn)腦機(jī)能及肝功能的功能食品。
文檔編號A23L1/29GK103181523SQ20131009556
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者王立峰, 陳靜宜 申請人:南京財經(jīng)大學(xué), 王立峰