專利名稱：用于治療癌癥及/或腫瘤的到手香葉汁的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于治療癌癥及/或腫瘤的植物組合物。
背景技術：
到手香(Plectranthus amboinicus，亦稱為Plectranthus amboinicus(Lour.)Spreng.，Coleus amboinicus Lour.，Coleus aromaticus Benth.，Coleus crassifolius Benth.，Plectranthus aromaticus(Benth.)Roxb.，Coleus suganda Blanco，Coleus carnosus Hassk.，及Ma jana amboinica(Lour.)Kuntze)，屬于唇形花科(Lamiaceae)之植物，并具有如下常用名鄉(xiāng)村琉璃苣(country borage)、古巴牛至(Cuban oregano)、印度琉璃苣(Indianborage)、安波里彩葉草(Amboini coleus)、法國百里香(French thyme)、墨西哥薄荷(Mexican mint)、西班牙百里香(Spanish thyme)、到手香(Tao-shou-hsiang)和湯薄荷(soup mint)。到手香在熱帶地區(qū)(非洲的部分地區(qū)、印度、東南亞、西印度群島、墨西哥，近來在美國南部)作為藥用植物、野菜和調(diào)味用植物來進行栽培。其芳香的葉片可用作肉類、湯類、魚類和當?shù)仄【频恼{(diào)味品，并可作為蔬菜食用及用來洗衣服和頭發(fā)。在遠東，人們亦為了獲取到手香的香精油和以之作為觀賞植物而種植到手香。
到手香亦用于傳統(tǒng)療法。例如，其葉片浸汁(用蜜調(diào)為甜味)能減輕咳嗽和感冒。另外，用力摩擦其葉片所產(chǎn)生的氣霧有助于消除鼻塞。到手香在臺灣得到廣泛應用，既可在例如燒傷、蚊蟲叮咬、癬及水腫等情況下用于外敷，也可作為例如驅風劑和平喘藥用于內(nèi)服。此外，幾十年來，到手香因其抗細菌和抗真菌特性而為人們所熟知。最近有人證明，來自到手香的二萜內(nèi)脂類、三萜(triterpene)類和齊墩果酸可以通過抑制可誘導炎癥反應的COX-1和COX-2的活性來抑制動物的炎癥反應(美國專利公開案第20020068098號、第20020076452號、第20020077350號、第20020110604號及第20030108628號，及美國專利第6,629,835號)。
但是，現(xiàn)有技術文獻資料從沒有教示或暗示到手香具有治療癌癥及/或腫瘤的效用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于治療癌癥及/或腫瘤的組合物，其包括有效量的到手香葉汁。
本發(fā)明同時提供一種治療癌癥及/或腫瘤的方法，其包括向需要此治療的患者投與本發(fā)明之組合物。
本發(fā)明進一步提供了一種用于制備本發(fā)明之組合物的方法，其中葉汁使用包括以下步驟的方法來制備(a)收獲到手香葉片；(b)用蒸餾水清洗步驟(a)所得葉片；(c)除去葉片上的水；及(d)自步驟(c)所得葉片獲得葉汁。
本發(fā)明之一具體實施例是一種用于治療癌癥及/或腫瘤的組合物，其包括有效量的分子量大于50kD的到手香葉汁組份。
因此，本發(fā)明亦提供一種用于制備供治療癌癥及/或腫瘤用的組合物的方法，該組合物包括有效量的分子量大于50kD的到手香葉汁組份，其中分子量大于50kD的到手香葉汁組份的制備方法包括以下步驟(a)收獲到手香葉片；(b)用蒸餾水清洗步驟(a)所得葉片；(c)除去葉片上的水；(d)自步驟(c)所得葉片獲得葉汁；及(e)使步驟(d)所得葉汁通過一過濾器，以除掉分子量小于50kD的組份，并獲得分子量大于50kD的組份。


圖1展示到手香葉汁的HPLC譜圖。
圖2展示實施例3中所述的葉汁百分含量對HepG2細胞計數(shù)的關系曲線圖。
圖3展示實施例3中所述的用葉汁處理后葉汁的作用天數(shù)對HepG2細胞計數(shù)的關系曲線圖。
圖4展示實施例3中所述的葉汁百分含量對Huh7細胞計數(shù)的關系曲線圖。
圖5展示實施例3中所述的用葉汁處理后葉汁的作用天數(shù)對Huh7細胞計數(shù)的關系曲線圖。
圖6展示實施例4中所述的用葉汁處理后葉汁的作用天數(shù)對Bowes細胞計數(shù)的關系曲線圖。
圖7展示實施例5中所述的用葉汁及/或太平洋紫杉醇處理HepG2細胞第3天時其細胞計數(shù)變化結果。
圖8展示實施例5中所述的用葉汁及/或太平洋紫杉醇處理Huh7細胞第3天時其細胞計數(shù)變化結果。
圖9展示實施例6中所述的接種有Huh7細胞的小鼠經(jīng)葉汁治療后其腫瘤面積變化結果。
圖10展示實施例6中所述的接種有Huh7細胞的小鼠經(jīng)葉汁治療后其體重變化結果。
圖11展示實施例6中所述的接種有Huh7細胞的小鼠停止葉汁治療后其腫瘤面積變化結果。
圖12展示實施例6中所述的接種有Huh7細胞的小鼠停止葉汁治療后其體重變化結果。
圖13展示實施例7中所述的接種有Bowes細胞的小鼠經(jīng)葉汁治療后其腫瘤面積變化結果。
圖14展示實施例7中所述的接種有Bowes細胞的小鼠經(jīng)葉汁治療后其體重變化結果。
圖15展示實施例7中所述的接種有Bowes細胞的小鼠停止葉汁治療后其腫瘤面積變化結果。
圖16展示實施例7中所述的接種有Bowes細胞的小鼠停止葉汁治療后其體重變化結果。
圖17展示實施例8中所述的葉汁及其組份的百分含量對HepG2細胞計數(shù)的關系曲線圖。
圖18展示實施例8中所述的用葉汁及其組份處理HepG2細胞后其細胞計數(shù)變化結果。
圖19展示分子量大于50kD的到手香葉汁組份的HPLC圖譜。
圖20展示實施例9中所述的用葉汁及其組份處理HepG2細胞后其細胞計數(shù)變化結果。
圖21展示實施例10中所述的葉汁及其組份的百分含量對HepG2細胞計數(shù)的關系曲線圖。
圖22展示實施例10中所述的用葉汁及其組份處理Huh7細胞后其細胞計數(shù)變化結果。
圖23展示實施例11中所述的用葉汁及其組份處理Huh7細胞后其細胞計數(shù)變化結果。
具體實施例方式
根據(jù)本發(fā)明，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)到手香葉汁對治療癌癥及/或腫瘤有顯著作用。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種治療癌癥及/或腫瘤的組合物，其包括有效量的到手香葉汁。
本文所用之“葉汁”一詞亦可稱為“葉的提取物”，指葉片中所含的天然汁液。葉汁可通過除去組織碎片及/或殘留物得到。
本文所用之“腫瘤”一詞指身體任何一部位的病態(tài)隆凸、突起或增生，特別是指由新組織沉積物形成的增生，或瘤體。本文所用術語“惡性腫瘤”亦稱為“惡性腫瘤疾病”或“癌癥”，指由異常的和不受控的細胞分裂引起的腫瘤生長，它可以通過淋巴系統(tǒng)或血流擴散到身體其它部位。
本文所用之“有效量”一詞指當將組合物投予一動物時可對該動物產(chǎn)生期望效果的量。例如，一組合物用于治療腫瘤的有效量是指可控制動物體內(nèi)腫瘤生長及/或可清除動物體內(nèi)腫瘤所需的用量。
在本發(fā)明一實施例中，本發(fā)明之組合物用于抑制惡性腫瘤生長。在本發(fā)明的另一實施例中，當使用本發(fā)明之組合物治療時可使惡性腫瘤細胞例如HepG2、Huh7和Bowes的數(shù)量降低甚至可將其消除。
在篩查對本發(fā)明組合物有反應的腫瘤細胞系的過程中，發(fā)現(xiàn)該組合物通過p53網(wǎng)絡控制腫瘤生長。本發(fā)明組合物可抑制其p53基因(包括野生型、部分功能型和突變活性型)具功能性的腫瘤細胞的生長。因此，根據(jù)本發(fā)明治療的腫瘤是為與p53相關的腫瘤。
p53網(wǎng)絡是細胞周期中G1檢查點的分子探測器，且可監(jiān)控DNA損傷、核苷酸庫水平(pool level)、有絲分裂紡錘體狀態(tài)和基因毒性應激反應。p53網(wǎng)絡還可控制細胞周期進程、細胞死亡程序、周期性衰老和可能的分化。因此，p53被認為是腫瘤抑制基因。事實上，人類癌癥中有一半以上與p53中一或多處改變有關。另外，突變型p53蛋白質可能已獲得一種新的獨立于野生型p53外的腫瘤促進活性?，F(xiàn)已研制出一些針對p53網(wǎng)絡來治療惡性腫瘤的方法(美國專利第5,382,510號、第5,840,579號、第6,183,964號、第6,472,385號及第6,531,512號)。
在本發(fā)明一實施例中，所治療的腫瘤包括肝細胞癌和黑素瘤。更佳地，所治療的腫瘤包括與p53網(wǎng)絡相關的肝細胞癌和黑素瘤。
本發(fā)明之到手香葉汁可用高效液相色譜(HPLC)來分析及鑒別。例如，50微升到手香葉汁使用內(nèi)徑(I.D.)為4.6毫米、長度(L)為15厘米的ZORBAX C18管柱進行高效液相色譜，并在214納米處獲得圖譜，該圖譜包括保留時間分別為1.756、2.573、7.118、7.851、9.715、10.278、10.864、11.212、12.287、12.799、13.178、13.413、14.027、14.794、16.253和18.742分鐘的峰；其中所述葉汁使用0-30％的乙腈和0.1％的TFA在30分鐘內(nèi)實施線性梯度洗脫進行分離，流速為1毫升/分鐘。
在研究到手香葉汁各組份的藥效時，發(fā)現(xiàn)分子量大于50kD的組份在治療癌癥及/或腫瘤方面較其它組份效果更好。在本發(fā)明一實施例中，0.001％的分子量大于50kD的組份表現(xiàn)出很強的抑制肝細胞癌(HepG2)生長的能力，而其它組份在劑量達到0.5％時才有同樣的療效。
本發(fā)明之分子量大于50kD的組份可用高效液相色譜來分析和鑒別。例如，50微升分子量大于50kD的組份使用內(nèi)徑(I.D.)為4.6毫米、長度(L)為15厘米的ZORBAX C18管柱進行高效液相色譜，并在214納米處獲得圖譜，該圖譜包括保留時間分別為2.574、4.798、5.728、7.101、9.701、10.279、10.808、11.189、12.235、13.35、13.584、13.903、14.113、15.114、16.206、16.736、18.619、22.137、24.676和26.902分鐘的峰；其中分子量大于50kD的組份使用0-30％的乙腈和0.1％的TFA在30分鐘內(nèi)實施線性梯度洗脫進行分離，流速為1毫升/分鐘。
在本發(fā)明一實施例中，該組合物進一步包括一種抗腫瘤劑。因為腫瘤生長涉及復雜的網(wǎng)絡共同作用，因此，結合使用針對不同網(wǎng)絡的抗腫瘤劑可合理地提高治療效果。在本發(fā)明一較佳實施例中，該抗腫瘤劑是太平洋紫杉醇。太平洋紫杉醇(亦稱為紅豆杉醇)是一種臨床用抗癌藥，具有很強的抑制G2M晚期有絲分裂的特性，通過調(diào)介Bcl-2磷酸化作用和紫杉醇誘導的細胞凋亡機制而表現(xiàn)出很強的抗腫瘤特性。此外，人們發(fā)現(xiàn)太平洋紫杉醇可通過與微管結合來增加對有絲分裂的阻斷作用(Lanni S.Jennifer，Lowe W.Scott，Licitra J.Edward，Liu O.Jun，Jacks Tyler.P53-independent aopotosis induced bypaciltaxel through an indirect mechanism.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol94，September 19979979-9683)。在本發(fā)明的一實施例中，包含5％到手香葉汁和50nM紫杉醇的組合物所具有的抑制腫瘤生長的效果強于僅包含到手香葉汁或太平洋紫杉醇的組合物。這一結果暗示了p53和Bcl-xL細胞凋亡途徑的交互作用(cross-talking)是治療癌癥及/或腫瘤的有效方法。
為了方便施予，將本發(fā)明之組合物調(diào)配于一種醫(yī)藥上可接受的載劑中。
本文所使用之“醫(yī)藥上可接受的載劑”一詞包括任何溶劑、分散介質、等滲劑與吸收阻抑劑等等。這些醫(yī)藥上可接受的載劑可自多種材料制備得到，其包括但不限于稀釋劑、結合劑和粘結劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、疏松劑以及制備特定治療用組合物需要的其它材料，例如緩沖液和吸收劑。這些可供醫(yī)藥活性物質用的介質和試劑的用途已為該項技術領域人員所熟知。除非任何常用介質或試劑與活性成分不相容，否則，本發(fā)明涵蓋其皆可用于本發(fā)明組合物中。
本發(fā)明之組合物可通過若干方式投予患者。該組合物較佳通過注射、口服或局部用藥施予患者。
本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明組合物的方法。具體來說，葉汁通過包括以下步驟的方法制備(a)收獲到手香葉片；(b)用蒸餾水清洗步驟(a)所得葉片；(c)除去葉片上的水分，較佳通過自然風干；及(d)自步驟(c)所得葉片獲得葉汁。
在本發(fā)明的一實施例中，葉片可通過一些常用方法如碾磨、攪拌、攪動、切割或切碎來處理成小碎片。
葉汁制備方法視需要還可以進一步包括步驟(d2)，即離心步驟(d)中所得葉汁以除去組織纖維。在本發(fā)明的一實施例中，系在15000rpm及24℃下進行兩次離心，每次離心5分鐘。
葉汁制備方法視需要還可以進一步包括葉汁除菌步驟。在本發(fā)明一實施例中，葉汁通過過濾除菌。
葉汁制備方法視需要還可以進一步包括葉汁濃縮步驟。
本發(fā)明也提供了一種用于治療癌癥及/或腫瘤的組合物，其包括有效量分子量大于50kD的到手香葉汁組份。
本發(fā)明還提供了一種制備供治療癌癥及/或腫瘤用的組合物的方法，該組合物包括有效量分子量大于50kD的到手香葉汁組份，其中所述分子量大于50kD的到手香葉汁組份通過包括以下步驟的方法來制備(a)收獲到手香葉片；(b)用蒸餾水清洗步驟(a)所得葉片；(c)除去葉片上的水分；(d)自步驟(c)所得葉片獲取葉汁；及(e)使步驟(d)所得葉汁通過一過濾器，以自所得葉汁除去分子量小于50kD的組份，并獲得分子量大于50kD的組份。
除步驟(e)外，制備分子量大于50kD的到手香葉汁組份的方法與上述制備到手香葉汁的方法相同。根據(jù)分子量范圍來分離各組份的方法在本技術領域中已很成熟。本發(fā)明一實施例使用Amicon超離心過濾裝置，該等過濾器具有不同尺寸的孔徑，可按分子量大小來分離各種組份。
以下所給出的實施例僅用于闡釋目的而非用于限制本發(fā)明的范圍。
實例1制備到手香葉汁到手香來源于臺灣特有生物研究保育中心(Taiwan Endemic SpeciesResearch Institute，位于臺灣南投)。收獲到手香葉片后，用蒸餾水清洗葉片，并風干以除去葉片上殘余的水分。葉片組織被碾磨成微細顆粒及葉汁。葉汁在24℃下以15,000rpm離心5分鐘以濃縮葉汁。收集上清液，并在24℃下以15,000rpm再離心5分鐘以盡可能除去組織纖維。所得葉汁用0.22微米針頭過濾器過濾除菌。在使用前將新鮮葉汁保存在4℃陰暗處。所有的植物粗提物應在3天內(nèi)使用或-80℃長期保存。
在Agilent1100系列液體色譜系統(tǒng)上實施色譜檢測，該系統(tǒng)由1100四組泵(帶脫氣器)、1100可變波長檢測器和1100標準自動樣品收集器組成。使用ChemStation軟件實施進一步峰分析。
大量溶劑和移動相采用Millipore溶劑過濾設備(Millipore，Bedford，MA)通過0.22微米尼龍膜過濾器(AlltechAssociates，Pty.Ltd)過濾。
用0.1％TFA(三氟乙酸)平衡管柱，Milli-Q流速為1毫升/分鐘。將溶于PBS中的1×粗提樣品50微升注入ZORBAXC18管柱(4.6毫米內(nèi)徑×15厘米)，并將該管柱置于溫度設置在25℃的管柱恒溫箱中。進樣后，用0-60％的乙腈和0.1％TFA在30分鐘內(nèi)對分析物實施線性梯度洗脫以將分析物分離出來。在214納米處檢測分析物。
色譜結果見圖1，記錄下來的各個峰的數(shù)據(jù)見表1。
表1


實例2篩查對葉汁有反應的細胞系細胞系除非特別指明，下述不同組織來源的9種人類腫瘤細胞系皆購自商業(yè)細胞培養(yǎng)收集中心臺灣新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所。
在最低必需培養(yǎng)基(補加有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、50IU/mL青霉素和50微克/毫升鏈霉素)中培養(yǎng)HepG2和Hep3B細胞。在RPMI-1640培養(yǎng)基(補加有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、50IU/mL青霉素和50微克/毫升鏈霉素)中培養(yǎng)U937和K562細胞。在高糖達爾克必需基本培養(yǎng)基(補加有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、50IU/mL青霉素和50微克/毫升鏈霉素)中培養(yǎng)Calu-1和TL細胞。
將培養(yǎng)物保存于含5％CO2、溫度為37℃且具有一定濕度的環(huán)境中。所有細胞培養(yǎng)試劑均購自Gibco-Invitrogen有限公司(Grand Island，N.Y.U.S.A.)和HyClone(Logan，Utah，U.S.A.)。
處理在所有的活體外試驗中，將3％按照實例1制備的葉汁直接加到經(jīng)繼代培養(yǎng)的細胞中。
細胞計數(shù)將20微升細胞懸浮液加入到20微升0.4％的錐藍中，用相差顯微鏡進行總細胞計數(shù)。
結果見表2，“○”代表對葉汁有反應的細胞(即處理后細胞數(shù)量減少)；“×”代表對葉汁無反應的細胞(即處理后細胞數(shù)量增加)。
表2


根據(jù)表2所示結果，其p53基因具功能性的細胞系對葉汁有反應，證明葉汁可通過p53網(wǎng)絡控制腫瘤生長。
實例3用葉汁治療肝細胞癌本實例中所用的肝細胞癌細胞系是HepG2和Huh7，且細胞培養(yǎng)和處理操作如實例2所述。將細胞分成對照組(未經(jīng)處理)和試驗組(分別用1％、3％、5％、7％或9％的葉汁處理)。每組重復8次(HepG2)或4次(Huh7)。
分別在第1天、第3天和第5天測定每組HepG2細胞計數(shù)，結果見圖2、圖3和表3。由圖2和圖3可看出，葉汁對細胞的抑制作用在第1天(P＜0.001)、第3天(P＜0.001)和第5天(P＜0.001)均隨劑量增大而增強，具有劑量相依性。另外，葉汁的抑制作用在第1天(受抑制細胞計數(shù)/葉汁百分含量1.2×104)、第3天(受抑制細胞計數(shù)/葉汁百分含量6.18×104)及第5天(受抑制細胞計數(shù)/葉汁百分含量10.44×104)均隨處理時間的增加而增強。
表3


分別在第1天、第3天和第5天測定每組Huh7細胞計數(shù)，結果見圖4、圖5和表4。由圖4和圖5可看出，葉汁對細胞的抑制作用在第1天(P＜0.05)、第3天(P＜0.001)和第5天(P＜0.001)均隨劑量增大而增強，具有劑量相依性。另外，葉汁的抑制作用在第1天(受抑制細胞計數(shù)/葉汁百分含量0.49×104)、第3天(受抑制細胞計數(shù)/葉汁百分含量2.47×104)及第5天(受抑制細胞計數(shù)/葉汁百分含量3.63×104)均隨處理時間的增加而增強。
表4

實例4用葉汁治療黑素瘤本實例中所用的黑素瘤細胞系是Bowes，經(jīng)細胞培養(yǎng)和處理操作如實例2所述。將細胞分成對照組(未經(jīng)處理)和試驗組(經(jīng)1％或3％葉汁處理)。每組重復5次。
在第1天、第3天和第5天測定每組Bowes細胞計數(shù)，結果見圖6。由圖6可看出，葉汁的抑制作用第1天(P＜0.01)和第5天(P＜0.01)均隨劑量增大而增強，表現(xiàn)出強的劑量相依性。另外，葉汁的抑制作用在第1天(受抑制細胞計數(shù)/葉汁百分含量2.22×104)、第3天(受抑制細胞計數(shù)/葉汁百分含量3.26×104)，及第5天(受抑制細胞計數(shù)/葉汁百分含量25.8×104)均隨處理時間的增加而增強。
實例5用葉汁及/或紫杉醇治療肝細胞癌本實例中所用的肝細胞癌細胞系是HepG2和Huh7，細胞培養(yǎng)和處理操作如實例2所述。將細胞分成對照組(未經(jīng)處理)和試驗組(分別用5％葉汁、50nM紫杉醇、及5％葉汁與50nM紫杉醇的混合物處理)。每組重復6次。
在第3天測定每組HepG2細胞計數(shù)，結果見圖7。由圖7可看出，所有試驗組的細胞生長皆明顯受到抑制。各試驗組抑制率分別為52.13％(5％葉汁P＜0.05)、43.77％(50nM紫杉醇P＝0.052)、或76.57％(5％葉汁與50nM紫杉醇的混合物P＜0.001)。以上結果表明，本發(fā)明之葉汁與紫杉醇之組合對細胞生長的抑制作用較單獨使用葉汁或紫杉醇為強。
在第3天測定每組Huh7細胞計數(shù)，結果見圖8。由圖8可看出，所有試驗組的細胞生長皆明顯受到抑制。各試驗組抑制率分別為50.21％(5％葉汁P＝0.110)、66.09％(50nM紫杉醇P＜0.05)、74.68％(5％葉汁與50nM紫杉醇的混合物P＜0.01)。以上結果表明，本發(fā)明之葉汁與紫杉醇之組合對細胞生長的抑制作用較單獨使用葉汁或紫杉醇為強。
實例6用葉汁治療肝細胞癌的動物模型接種按實例2中提到的條件培養(yǎng)Huh7細胞，得到總數(shù)為3×108個細胞。然后將得到的細胞懸浮于DMEM中，使細胞密度為2×108個/毫升。選取5～6周齡重約20克的NOD-scid小鼠，取0.1毫升上述細胞溶液接種于小鼠右背的皮下區(qū)域。對照組小鼠接種0.1毫升DMEM。
治療對長出大腫瘤(尺寸大于10毫米×10毫米，一只小鼠)、中腫瘤(尺寸介于7毫米×7毫米到10毫米×10毫米之間，一只小鼠)和小腫瘤(尺寸小于7毫米×7毫米，兩只小鼠)的小鼠分別用按實例1所述方法制備的葉汁來進行治療。葉汁劑量是小鼠體重的10％。將葉汁裝進注射器內(nèi)，將其針頭扎進腫瘤周邊的皮下部位，然后將葉汁注入腫瘤內(nèi)部。在每周一、周三及周五測量腫瘤大小并稱小鼠體重，同時繼續(xù)用葉汁治療。空白組注入10％的PBS。
結果結果見圖9。用葉汁治療后小腫瘤的面積縮小(R2＝0.564，B＝-2.09平方毫米/天，P＜0.01)；中腫瘤的生長(R2＝0.834，B＝6.19平方毫米/天，P＜0.01)受到抑制，僅為對照組的27.1％；但大腫瘤(R2＝0.995，B＝34.38平方毫米/天，P＜0.01)的生長未受到抑制。另外，所有接受葉汁治療的小鼠體重均下降(未接種的小鼠R2＝0.178，B＝-0.13克/天，P＜0.05；具有小腫瘤的小鼠R2＝0.281，B＝-0.09克/天，P＝0.051；具有中腫瘤的小鼠R2＝0.576，B＝-0.11克/天，P＜0.05；具有大腫瘤的小鼠R2＝0.210，B＝-0.11克/天，p＝0.302)。只有沒有接受葉汁治療的小鼠體重增加(R2＝0.730，B＝0.24克/天，P＜0.001)(見圖10)。
復發(fā)性小腫瘤組在第13天停止投藥，但繼續(xù)監(jiān)測腫瘤面積大小，結果見圖11。結果表明小腫瘤的生長速率(R2＝0.558，B＝0.72平方毫米/天，P＜0.05)僅為對照組的2.4％(R2＝0.622，B＝30.62平方毫米/天，P＜0.01)。另外，停止投藥后，所有小鼠的體重均增加(空白組R2＝0.743，B＝0.53克/天，P＜0.001；小腫瘤組R2＝0.045，B＝0.02克/天，P＜0.615；對照組R2＝0.214，B＝0.11克/天，P＜0.05)(見圖12)。
實例7用葉汁治療黑素瘤的動物模型接種按實例2中提到的條件培養(yǎng)Bowes細胞，得到總數(shù)為3×108個細胞。然后將得到的細胞懸浮于DMEM中，使細胞密度為2×108個/毫升。選取5～6周齡重約20克的NOD-scid小鼠，取0.1毫升上述細胞溶液接種于小鼠右背的皮下區(qū)域。對照組小鼠接種0.1毫升DMEM。
治療對長出大腫瘤(尺寸大于10毫米×10毫米，一只小鼠)和小腫瘤(尺寸小于10毫米×10毫米，兩只小鼠)的小鼠分別用按實例1所述方法制備的葉汁來進行治療。葉汁劑量是小鼠體重的10％。將葉汁裝進注射器內(nèi)，將其針頭扎進腫瘤周邊的皮下部位，然后將葉汁注入腫瘤內(nèi)部。在每周一、周三、周五測量腫瘤大小并稱小鼠體重，同時繼續(xù)用葉汁治療。空白組注入10％的PBS。
結果結果見圖13。用葉汁治療后大腫瘤的面積縮小(R2＝0.924，B＝-3.08平方毫米/天，P＜0.01)；小腫瘤的生長(R2＝0.564，B＝1.50平方毫米/天，P＜0.01)受到抑制，僅為對照組的37.7％。另外，除沒有接受葉汁治療的小鼠體重明顯增加外(R2＝0.897，B＝0.09克/天，P＜0.001)，所有接受葉汁治療的小鼠體重均略有增加(見圖14)。
復發(fā)性小腫瘤組在第24天停止投藥，但繼續(xù)監(jiān)測腫瘤面積大小，結果見圖15。結果表明停止投藥后小腫瘤的生長速率(R2＝0.750，B＝4.1平方毫米/天，P＜0.001)比投藥時(R2＝0.564，B＝1.50平方毫米/天，P＜0.01)快173％。另外，空白組小鼠在停止PBS注射后其腫瘤生長速率(R2＝0.320，B＝5.13平方毫米/天，P＜0.001)比用PBS注射時(R2＝0.608，B＝3.98平方毫米/天，P＜0.001)快29％。小腫瘤組和空白組在停止投藥后具有相似的生長速率。另外，停止葉汁治療后所有小鼠的體重均稍有增加，但空白組的體重增加(R2＝0.315，B＝-0.03克/天，P＜0.05)明顯高于小腫瘤組(見圖16)。
實施例8葉汁組份對HepG2細胞生長的抑制效果葉汁組份使用Amicon超離心過濾裝置(Amicon Ultra PL-10，10,000標稱分子量限值(NMWL)；Amicon Ultra PL-30，30,000NMWL；Amicon Ultra PL-50，50,000NMWL，Millipore)將實例1中制備的葉汁分為以下組份#1組份(分子量＜10K，25X葉汁)、#2組份(分子量＜10kD，1X葉汁)、#3組份(分子量在10kD到30kD之間，25X葉汁)、#4組份(分子量在10kD到30kD之間，1X葉汁)、#5組份(分子量在30kD到50kD之間，25X葉汁)、#6組份(分子量在30kD到50kD之間，1X葉汁)、#7組份(分子量＜50kD，25X葉汁)、#8組份(分子量＞50kD，25X葉汁)、#9組份(分子量＞50kD，1X葉汁)。
處理使用HepG2細胞系來篩查葉汁組份。細胞系操作如實例2所述，且在第4天進行細胞計數(shù)。
HepG2細胞于第4天的存活力見表5。
表5

結果表明，#1、#2、#3、#7、#8和#9組份對腫瘤生長的抑制具有劑量相依性。并且，#2和#9組份對HepG2細胞的生長抑制效果較其他組份更強。
進一步使用1X和25X葉汁、0％、0.01％、0.1％、0.5％、1％和3％的#1、#2及#9組份處理HepG2細胞。每組重復4到7次。
結果表明，0.5％(P＜0.05)、1％(P＜0.001)和3％(P＜0.001)的#2組份，0.01％的#9組份(P＜0.001)，1％的葉汁(P＜0.05)與1％(P＜0.01)及3％(P＜0.001)的25X葉汁能顯著抑制HepG2生長。另一方面，1％的1X葉汁(P＝0.848)和1％的#1組份不具有顯著的抑制效果。此證明，#9組份的抑制作用最強，其有效劑量僅為0.01％；#2組份也有很強的抑制作用，其有效劑量為0.5％；25X葉汁的有效劑量為1％。0.5％、1％和3％的#2組份，0.01％的#9組份，3％的1X葉汁和1％及3％的25X葉汁的抑制率分別為34.3％、62.8％、98.7％、39.7％、54.8％、53.6％和83.8％。
受抑制細胞數(shù)量與1X葉汁、25X葉汁、#1組份、#2組份和#9組份的百分含量的比率見圖17。
圖17表明，1X(P＜0.001，R2＝0.525)和25X(P＝0.001，R2＝0.689)葉汁及#1組份(P＜0.001，R2＝0.333)、#2組份(P＜0.001，R2＝0.792)和#9組份(P＜0.001，R2＝0.498)可顯著抑制HepG2生長且具有劑量相依性。在第4天受抑制的細胞數(shù)量與1X葉汁、25X葉汁、#1組份、#2組份和#9組份的百分含量的比率分別為10.2×104、15.7×104、9.22×104、18.4×104和43.7×104。抑制效果自大到小為#9組份＞#2組份＞25倍葉汁＞1倍葉汁＞#1組份。
此外，亦分析了相同劑量的1X葉汁、25X葉汁、#1組份、#2組份和#9組份的抑制效果，結果見圖18。
當劑量為0.1％和0.5％時，#9組份的抑制效果顯著強于1X和25X葉汁、#1組份和#2組份(均為P＜0.001)。
當劑量為1％時，#9組份的抑制效果顯著強于1X葉汁(P＝0.001)、25X葉汁、#1組份(P＝0.059)和#2組份(P＝0.072)。另外，#2組份的抑制效果顯著強于1X葉汁(P＝0.05)。
當劑量為0.001％時，#9組份的抑制效果顯著強于25X葉汁(P＝0.063)。
當劑量為0.1％時，#9組份的抑制效果顯著強于1X和25X葉汁、#1組份和#2組份(均為P＜0.001)。
實例9用葉汁的#9組份治療肝細胞癌HepG2按實例1所述對#9組份進行色譜分析。
色譜分析結果見圖19，記錄下來的各個峰的數(shù)據(jù)見表6。
表6

本實例中所用的肝細胞癌細胞系是HepG2，細胞培養(yǎng)和處理操作如實例2所述。將細胞分成對照組(未經(jīng)處理)和試驗組(如實例8所述分別用1X葉汁、0％、0.001％、0.01％、0.1％、0.5％或1％的#9組份處理。每組重復4到8次。
在第4天測定每組HepG2細胞計數(shù)，結果見圖20。由圖20可看出，1％(P＜0.001)、0.5％(P＜0.001)、0.1％(P＜0.001)和0.01％(P＜0.001)的#9組份具有顯著的抑制效果。另外，0.001％(P＝0.092)的#9組份亦可較顯著地抑制細胞生長。1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％的#9組份的抑制率分別為93.6％、94.7％、93.8％、39.7％和18.5％。受抑制的細胞數(shù)量與#9組份百分含量的比率為43.65×104。
實例10葉汁組份對Huh7細胞生長的抑制效果葉汁組份如實例8中所述制備。
處理使用Huh7細胞系來篩查葉汁組份。細胞系操作如實例2所述，在第4天進行細胞計數(shù)。
Huh7細胞于第4天的存活率見表7。
表7

結果表明，#1、#2和#9組份可抑制腫瘤生長，且具有劑量相依性。
此外，進一步使用1X和25X葉汁、0％、0.01％、0.1％、0.5％、1％和3％的#1、#2及#9組份處理Huh7細胞。每組重復4到7次。
結果表明，1％(P＜0.01)和3％(P＝0.001)的#1組份、1％(P＜0.05)和3％(P＜0.05)的#2組份、0.01％的#9組份(P＝0.01)及0.5％(P＜0.05)、1％(P＜0.05)和3％(P＜0.01)的25X葉汁能顯著抑制Huh7生長。另一方面，1％(P＝0.937)和3％(P＝0.666)1X葉汁未顯示顯著的抑制效應。此證明，#9組份的抑制效果最強，其有效劑量僅為0.01％；25X葉汁也具有很強的抑制效果，其有效劑量為0.5％；#1和#2組份的有效劑量是1％。1％和3％的#1組份、1％和3％的#2組份、0.01％的#9組份和0.5％、1％及3％的25X葉汁的抑制率分別為59.3％、76.2％、53.9％、64.2％、53.7％、49.9％、53.9％和67.1％。
受抑制細胞數(shù)量與1X葉汁、25X葉汁、#1組份、#2組份和#9組份的百分含量的比率見圖21。
圖21表明，1X葉汁(P＝0.001，R2＝0.346)和#1組份(P＜0.001，R2＝0.429)、#2組份(P＝0.001，R2＝0.354)及#9組份(P＜0.001，R2＝0.440)可顯著抑制HepG2生長且具有劑量相依性。受抑制細胞數(shù)量與第4天時25X葉汁、#1組份、#2組份和#9組份的百分含量的比率分別為4.41×104、5.22×104、4.52×104、15.8×104。抑制效果自大到小為#9組份＞#1組份＞#2組份＞25X葉汁。
此外，亦分析了相同劑量的1X葉汁、25X葉汁、#1組份、#2組份和#9組份的抑制效果，結果見圖22。
當劑量為1％(P＜0.01)和0.5％(P＜0.01)時，#9組份的抑制效果顯著強于1X葉汁。另外，當劑量為0.5％時，#9組份的抑制效果顯著強于#2組份(P＝0.05)。
實例11用葉汁的#9組份處理肝細胞癌Huh7本實例中所用的肝細胞癌細胞系是Huh7，細胞培養(yǎng)和處理操作如實例2所述。將細胞分成對照組(未經(jīng)處理)和試驗組(如實例10中所述分別用1X葉汁、0％、0.001％、0.01％、0.1％、0.5％或1％的#9組份處理)。每組重復4到6次。
在第4天測定每組Huh7細胞計數(shù)，結果見圖23。由圖23可看出，1％(P＜0.001)、0.5％(P＜0.001)、0.1％(P＜0.05)和0.01％(P＜0.05)的#9組份具有顯著的抑制效果。另外，0.001％(P＝0.067)的#9組份亦可較顯著地抑制細胞生長。1％、0.5％、0.1％、0.01％及0.001％的#9組份的抑制率分別為90.8％、88.6％、58.5％、53.7％和48.5％。受抑制細胞數(shù)量與#9組份百分含量的比率為15.8×104。
盡管以上對本發(fā)明實施例進行了闡釋和說明，但所屬技術領域的技術人員可對其作出各種的更改及改進。因此，本發(fā)明的實施例僅用于闡釋目的而不具有限制意義。本發(fā)明并非意欲受限于所闡釋的特定形式，而且所有不脫離本發(fā)明精神和范圍的修改皆包含在隨附權利要求的范圍中。
權利要求
1.一種用于治療癌癥及/或腫瘤的組合物，其包括有效量的到手香葉汁。
2.如權利要求1的組合物，其用于治療惡性腫瘤。
3.如權利要求1的組合物，其中所述腫瘤為一與p53相關的腫瘤。
4.如權利要求1的組合物，其中所述腫瘤包括肝細胞癌和黑素瘤。
5.如權利要求1的組合物，其中50微升到手香葉汁使用內(nèi)徑(I.D.)為4.6毫米、長度(L)為15厘米的ZORBAX C18管柱進行高效液相色譜(HPLC)，并在214納米處獲得圖譜，該圖譜包括保留時間分別為1.756、2.573、7.118、7.851、9.715、10.278、10.864、11.212、12.287、12.799、13.178、13.413、14.027、14.794、16.253和18.742分鐘的峰；其中所述到手香葉汁使用0-30％的乙腈和0.1％的TFA在30分鐘內(nèi)實施線性梯度洗脫進行分離，流速為1毫升/分鐘。
6.如權利要求1的組合物，其包括有效量的分子量大于50kD的到手香葉汁組份。
7.如權利要求1的組合物，其進一步包括一種抗腫瘤劑。
8.如權利要求7的組合物，其中所述抗腫瘤劑為太平洋紫杉醇。
9.如權利要求1的組合物，其調(diào)配于一醫(yī)藥上可接受的載劑中。
10.如權利要求1的組合物，其通過注射、口服或局部用藥施予患者。
11.一種用于制備如權利要求1的組合物的方法，其中該葉汁使用包括以下步驟的方法來制備(a)收獲到手香葉片；(b)用蒸餾水清洗步驟(a)所得葉片；(c)除去葉片上的水；及(d)自步驟(c)所得葉片獲得葉汁。
12.如權利要求11的方法，其中所述用于制備葉汁的方法進一步包括步驟(d2)，即離心自步驟(d)所得葉汁以除掉組織纖維。
13.如權利要求11的方法，其中所述用于制備葉汁的方法進一步包括一葉汁除菌步驟。
14.如權利要求13的方法，其中所述葉汁通過過濾除菌。
15.如權利要求的方法，其中所述用于制備葉汁的方法進一步包括一葉汁濃縮步驟。
16.一種用于治療癌癥及/或腫瘤的組合物，其包括有效量的分子量大于50kD的到手香葉汁組份。
17.如權利要求16的組合物，其中50微升分子量大于50kD的組份使用內(nèi)徑(I.D.)為4.6毫米、長度(L)為15厘米的ZORBAX C18管柱進行高效液相色譜(HPLC)，并在214納米處獲得圖譜，該圖譜包括保留時間分別為2.574、4.798、5.728、7.101、9.701、10.279、10.808、11.189、12.235、13.35、13.584、13.903、14.113、15.114、16.206、16.736、18.619、22.137、24.676和26.902分鐘的；峰；其中所述分子量大于50kD的組份使用0-30％的乙腈和0.1％的TFA在30分鐘內(nèi)實施線性梯度洗脫進行分離，流速為1毫升/分鐘。
18.如權利要求16的組合物，其用于治療惡性腫瘤。
19.如權利要求16的組合物，其中所述腫瘤為與p53相關的腫瘤。
20.如權利要求16的組合物，其中所述腫瘤包括肝細胞癌和黑素瘤。
21.如權利要求16的組合物，其進一步包括一種抗腫瘤劑。
22.如權利要求21的組合物，其中所述抗腫瘤劑為太平洋紫杉醇。
23.如權利要求16的組合物，其調(diào)配于一醫(yī)藥上可接受的載劑中。
24.如權利要求16的組合物，其通過注射、口服或局部用藥施予患者。
25.一種制備如權利要求16的組合物的方法，其中分子量大于50kD的葉汁組份使用包括以下步驟的方法來制備(a)收獲到手香葉片；(b)用蒸餾水清洗步驟(a)所得葉片；(c)除去葉片上的水；(d)自步驟(c)所得葉片獲得葉汁；及(e)使步驟(d)所得葉汁通過一過濾器，以除掉分子量小于50kD的葉汁組份，并獲得分子量大于50kD的組份。
26.如權利要求25的方法，其中所述用于制備分子量大于50kD的葉汁組份的方法進一步包括步驟(d2)，即離心自步驟(d)所得葉汁以除掉組織纖維。
27.如權利要求25的方法，其中所述用于制備分子量大于50kD的葉汁組份的方法進一步包括一分子量大于50kD的葉汁組份的除菌步驟。
28.如權利要求25的方法，其中所述分子量大于50kD的葉汁組份通過過濾除菌。
29.如權利要求25的方法，其中所述用于制備分子量大于50kD的葉汁組份的方法進一步包括一分子量大于50kD的葉汁組份的濃縮步驟。
30.一種如權利要求1的組合物在生產(chǎn)供治療癌癥及/或腫瘤用藥物中之用途。
31.一種如權利要求16的組合物在生產(chǎn)供治療癌癥及/或腫瘤用藥物中之用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療腫瘤的組合物，其包括有效量的到手香(Plectranthus amboinicus)葉汁。本發(fā)明同時提供了制備該組合物的方法。
文檔編號A61P35/00GK1806818SQ200510001758
公開日2006年7月26日 申請日期2005年1月19日 優(yōu)先權日2005年1月19日
發(fā)明者盧昆山, 魏誠佑, 夏靜吾, 龍輝 申請人:威今基因科技股份有限公司, 夏靜吾