專利名稱：：制造有效生物反應(yīng)器的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明記載了制造有效生物反應(yīng)器的方法。
背景技術(shù)：
：在名為"suspensionculturevessels"的專利申請PCT/US06/22312中描述了早先的發(fā)現(xiàn)，其中描述了在搖床平臺上用于懸浮哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物的寬體(wide-body)培養(yǎng)容器，該培養(yǎng)容器具有倒椎臺狀(fmsto-conical)底部。出人意料地，該系統(tǒng)明顯比傳統(tǒng)生物反應(yīng)器和平底搖瓶更好。已經(jīng)描述了這一系統(tǒng)使得培養(yǎng)基通過較小的水-機(jī)械應(yīng)力(hydro-mechanicalstress)而輕易地攀至容器壁。這一系統(tǒng)產(chǎn)生了寬闊的薄培養(yǎng)基層用于延展表面，更多的通氣以及更好的混合。引起興趣的是，并不清楚這一基于搖床的椎臺狀底部容器系統(tǒng)的準(zhǔn)確作用機(jī)制。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了該作用機(jī)制?；谠撟饔脵C(jī)制，即增加培養(yǎng)基中的溶氧水平的方法，本發(fā)明設(shè)計并檢測了若干類型的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明描述了先前記載的具有倒椎臺狀或倒截椎底部(專利申請PCT/US06/22312)的懸浮培養(yǎng)容器的作用機(jī)制。本發(fā)明公開了增加培養(yǎng)基中溶氧(DO)的方法，該方法構(gòu)成設(shè)計并制造有效哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)。圖1:用于懸浮哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物的具有倒椎臺狀底部的寬體容器。圖2a:FluorometrixDO/pH補(bǔ)丁狀傳感器(patchsensor)監(jiān)測技術(shù)的示圖。圖2b:FluorometrixDO/pH補(bǔ)丁狀傳感器監(jiān)測系統(tǒng)。圖3:在搖床平臺上具有倒椎臺狀底部的150ml工作容積培養(yǎng)容器。圖4:使用氣泵使靜止?fàn)顟B(tài)的培養(yǎng)基起泡來增加DO水平。圖5a、b、c、d、e:Nikon數(shù)碼相機(jī)捕捉的瞬間培養(yǎng)基表面特征。在該瞬間，所有圖片顯示標(biāo)記的主要在容器壁一側(cè)的培養(yǎng)基表面水平。這一培養(yǎng)基運(yùn)動的特征通過重復(fù)"清掃"或沖洗暴露于空氣的平滑容器表面而增加培養(yǎng)基中的DO。圖6a、b:使用標(biāo)記塑料管的滾動運(yùn)動，管內(nèi)的培養(yǎng)基重復(fù)"清掃"或"沖洗"暴露于空氣的平滑容器壁表面。該運(yùn)動使培養(yǎng)基中的DO迅速增加至100%。圖7:使用具有倒椎臺狀底部(直徑3cm)的塑料管，在具有恒定DO100%的可調(diào)搖床平臺上培養(yǎng)4天，懸浮培養(yǎng)的CHOK細(xì)胞輕易達(dá)到2.2%pcv。對于細(xì)胞克隆魯棒性(robustness,或稱健壯性)篩選創(chuàng)造了一有效的小型生物反應(yīng)器系統(tǒng)。圖8a:用于混合培養(yǎng)基的前后運(yùn)動的球形自滾式生物反應(yīng)器。圖8b:用于混合培養(yǎng)基的搖床平臺上的球形自滾式生物反應(yīng)器。圖8C:具有內(nèi)凸軌道的錐形自滾式生物反應(yīng)器。圖9a:用于塑料培養(yǎng)袋的具有倒椎臺狀底部的10升容器底。圖9b:具有倒椎臺狀底部的10升容器底。圖10a:目前的Flurometrix細(xì)胞克隆魯棒性篩選和優(yōu)化高通量小型生物反應(yīng)器系統(tǒng)的工藝。圖10b:用于細(xì)胞系魯棒性篩選的具有倒椎臺狀底部的基于搖床的多個孔。發(fā)明的具體說明本發(fā)明至少部分基于早先的發(fā)現(xiàn)，即不用復(fù)雜的控制塔和相關(guān)的DO以及pH探針，適合哺乳動物細(xì)胞的懸浮液在具有倒椎臺狀或倒截椎底部的培養(yǎng)容器中，于具有某一運(yùn)動距離的搖床平臺上生長明顯比傳統(tǒng)Applikon生物反應(yīng)器以及平底搖瓶更好(圖1)。為了研究其作用機(jī)制，使用了DO傳感器、pH傳感器及它們的監(jiān)測系統(tǒng)(w皿flu醒etrix.函)(圖2a、b)。還使用數(shù)碼相機(jī)(Nikon)來捕捉并研究倒椎臺狀底部容器振蕩運(yùn)動期間具體的培養(yǎng)基運(yùn)動。首先，測量具有倒椎臺狀底部的150ml工作容積容器中培養(yǎng)基的DO(圖3)。發(fā)現(xiàn)DO水平輕易達(dá)到100%(表l)。然后使用氣泵使同一容器中處于靜止?fàn)顟B(tài)的培養(yǎng)基起泡(圖4)。出人意料地，其在合理的時間段內(nèi)DO不能達(dá)到100%(表2)。這一現(xiàn)象是非常出人意料的，因?yàn)槌Ｒ?guī)使用起泡法來校正3升Applikon生物反應(yīng)器中的DO探針并假定DO達(dá)到100%。這一現(xiàn)象背后必然存在一種作用機(jī)制。表l:向以120rpm振蕩的、具有倒椎臺狀底部的150ml工作容積培養(yǎng)容器(圖3)中加入新鮮的培養(yǎng)基。每30min，測量DO。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2:向未振蕩的、具有倒椎臺狀底部的150ml工作容積培養(yǎng)容器中加入新鮮的培養(yǎng)基。使用氣泵起泡向培養(yǎng)基中加入DO(圖4)。每30min，測量DO。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>探尋答案時，使用高速相機(jī)來捕捉具有倒椎臺狀底部的培養(yǎng)容器在振蕩時的瞬間運(yùn)動(圖5a、b、c、d)(圖3)。所有圖片清楚地顯示在瞬間運(yùn)動時，培養(yǎng)基主要在培養(yǎng)容器的一側(cè)而另一側(cè)大部分暴露于空氣接觸。由于倒椎形底部，振蕩運(yùn)動輕易地使培養(yǎng)基運(yùn)動攀至容器壁的一側(cè)。這產(chǎn)生培養(yǎng)基流的循環(huán)運(yùn)動，重復(fù)"清掃"或沖洗暴露于空氣的容器壁。假設(shè)這一循環(huán)運(yùn)動及其重復(fù)的"清掃"增加培養(yǎng)基中的DO。發(fā)現(xiàn)溶氧(DO)是以在水或培養(yǎng)基中混合的氧氣微泡的形式且發(fā)生于水分子之間。上面的情況下，在瞬間暴露于空氣的階段，微小的氧氣泡被平滑玻璃或塑料表面吸收并因此形成氧氣泡微層是可能的。然后假設(shè)在平滑表面上瞬間形成的氣泡層太微小而在水中組裝成DO的微泡尺寸。這一微泡層隨后被循環(huán)培養(yǎng)基流所"清掃"或洗去，從而使氧氣輕易溶解在水中。這一循環(huán)運(yùn)動由于倒椎臺狀底部和振蕩運(yùn)動而一次次發(fā)生，從而比直接使培養(yǎng)基起泡(包括鼓泡)更有效地增加DO水平。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，使用具有4ml培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)速為60rpm滾筒的12ml塑料管(NUNC)(圖6a、b)。在10min短暫滾動后，管中的所有培養(yǎng)基樣品達(dá)到100%DO。這一研究顯示了培養(yǎng)基或培養(yǎng)基流以某一速度或重復(fù)清掃或接觸暴露于空氣的平滑表面，出人意料地有效增加了培養(yǎng)基DO。然后在管中以滾筒速度為60和100rpm培養(yǎng)CHOK-懸浮細(xì)胞4天。如預(yù)期，這4天培養(yǎng)期間，所有情況下的DO均達(dá)到100%。然而，細(xì)胞根本沒有生長。因此總結(jié)對于最佳懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，除了足夠的培養(yǎng)基DO，必須進(jìn)行有效地混合。然后在具有倒椎臺狀底部的50ml離心管(NUNC)中于可調(diào)整的搖床平臺上培養(yǎng)細(xì)胞4天(圖7)。所有細(xì)胞都生長且輕易達(dá)到2.2%緊實(shí)細(xì)胞體積(pcv)。這一結(jié)果表明對于最佳懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，除了足夠的DO，還需要混合運(yùn)動?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，設(shè)計了若干用于原型構(gòu)建的生物反應(yīng)器類型。對于每種類型，考慮將重復(fù)使用培養(yǎng)基流用力清掃或接觸暴露于空氣的平滑表面的方法與足夠的培養(yǎng)基混合運(yùn)動整合一起來增加培養(yǎng)基中DO(圖8a、b、c)。實(shí)施例4中進(jìn)一步描述細(xì)節(jié)。還通過在無血清懸浮培養(yǎng)基中使用表達(dá)TNFR2-FC-IL-lra的CHOK懸浮細(xì)胞系檢査了批量培養(yǎng)工藝的細(xì)節(jié)。清楚地顯示了具有倒椎臺狀底部的培養(yǎng)容器是理想的，其具有最佳的DO水平、細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率(表3)。實(shí)施例1也描述了細(xì)節(jié)。實(shí)施例1、具有倒椎臺狀底部的150ml工作容積容器的分批培養(yǎng)研究使用小規(guī)模的150ml工作容積搖瓶容器在無血清培養(yǎng)基B001中對表達(dá)TNFR2-Fc-IL-lra藥物候選者的CHO生產(chǎn)細(xì)胞系進(jìn)行分批培養(yǎng)8天。使用FlurometrixDO補(bǔ)丁狀傳感器監(jiān)測系統(tǒng)每日測量DO(圖2a、b)。除了使用Flurometrix監(jiān)測系統(tǒng)以夕卜，還通過便攜式pH測量儀測量pH(圖2b)。通過穩(wěn)歩(one-touch)葡萄糖測量儀(圖2b)測量葡萄糖。表3清楚地顯示具有倒椎臺狀底部的培養(yǎng)容器是理想的，其具有最佳的DO水平、細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。表3、同時監(jiān)控DO、pH、葡萄糖。具有倒椎臺狀底部的150ml工作容積容器中分批培養(yǎng)工藝的混合速度和溫度。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2、在具有倒椎臺狀底部的生物反應(yīng)器容器底上制造一次性塑料細(xì)胞培養(yǎng)袋設(shè)計并構(gòu)建具有倒椎臺狀底部的生物反應(yīng)器容器底和軟性塑料袋(圖9a、b)。這些底和袋被設(shè)計為在具有可調(diào)運(yùn)動距離的搖床平臺上使用。設(shè)計的倒椎臺狀底部和可調(diào)搖床平臺旨在使培養(yǎng)基攀至盡可能高且盡可能容易(使用最小的振蕩能量)以增加培養(yǎng)基中的DO水平并滿足高細(xì)胞密度培養(yǎng)條件下高水平02使用的挑戰(zhàn)。設(shè)計了3、10、20、40、100、500和1000升尺寸的容器底和塑料袋用于原型構(gòu)建和檢測。目標(biāo)是構(gòu)建成本有效的剪力較小的一次性哺乳動物培養(yǎng)物生物反應(yīng)器用于研發(fā)和工業(yè)使用。實(shí)施例3、設(shè)計具有倒椎臺狀底部的基于搖床的多孔板用于在髙通量蛋白質(zhì)表達(dá)滴定篩選后產(chǎn)生克隆魯棒性篩選生產(chǎn)細(xì)胞系的魯棒性對于給定蛋白質(zhì)藥物的大規(guī)模工藝的穩(wěn)定性以及最終表達(dá)產(chǎn)率是重要的。在從數(shù)以千計的細(xì)胞克隆篩選的高表達(dá)細(xì)胞系中，它們中的一些是滿足工業(yè)生產(chǎn)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的魯棒(robust，或稱健壯)細(xì)胞系。所選的魯棒細(xì)胞系能夠以高密度生長較長時間并因此產(chǎn)生比原始篩選的細(xì)胞克隆表達(dá)效價>10倍的更高表達(dá)效價。當(dāng)前用于細(xì)胞系魯棒性篩選及工藝優(yōu)化的微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)(www.flurometrix.com)(圖10a)對于高細(xì)胞密度細(xì)胞生長不是最佳的且不具有最佳DO水平來支撐高密度細(xì)胞群。因此，其并未篩選魯棒細(xì)胞克隆。沒有充足的培養(yǎng)基DO，就不可能優(yōu)化高細(xì)胞密度補(bǔ)料分批工藝。在搖床平臺上設(shè)計的多個孔板(圖10b)將提供培養(yǎng)基足夠的DO，這是由于振蕩運(yùn)動以及培養(yǎng)孔的倒椎臺狀底部支撐高細(xì)胞密度生長，從而能夠篩選給定細(xì)胞系在最大密度下的最終生長能力以及與非魯棒細(xì)胞克隆相區(qū)別。這一系統(tǒng)除了非常經(jīng)濟(jì)有效外還易于掌握。實(shí)施例4、基于結(jié)合了有效混合運(yùn)動來增加培養(yǎng)基中DO的方法設(shè)計有效生物反應(yīng)器基于上面進(jìn)行的滾筒實(shí)驗(yàn)(圖6a、b)，發(fā)現(xiàn)了增加哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中DO的方法。隨后設(shè)計滾動生物反應(yīng)器(圖8a、b、c)。圖8a示出通過重復(fù)沖洗暴露于空氣的容器內(nèi)表面的球形自滾式生物反應(yīng)器容器。這一滾動運(yùn)動增加培養(yǎng)基中的DO以支撐高細(xì)胞密度生長。而水平面的前后運(yùn)動使得培養(yǎng)基在滾動運(yùn)動期間充分混合(圖8a)。它們一起支撐最佳懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。圖8b示出球形自滾式生物反應(yīng)器容器。這一滾動運(yùn)動通過重復(fù)沖洗暴露于空氣的容器內(nèi)表面而支撐高細(xì)胞密度生長。而在水平面的軌道搖床平臺使得培養(yǎng)基在滾動運(yùn)動期間充分混合(圖8b)。它們一起支撐最佳懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。圖8c示出錐形自滾式生物反應(yīng)器容器。這一滾動運(yùn)動通過重復(fù)沖洗暴露于空氣的容器內(nèi)表面而支撐高細(xì)胞密度生長。而內(nèi)凸的軌道使得滾動時培養(yǎng)基向上運(yùn)動至上部一端和落回下端。這一額外的運(yùn)動幫助培養(yǎng)基在滾動運(yùn)動期間充分混合。它們一起支撐最佳懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。權(quán)利要求1、不使用氧氣或起泡來增加用于哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基中溶氧的方法，其中在具有平滑壁的培養(yǎng)容器內(nèi)含有細(xì)胞培養(yǎng)物。2、權(quán)利要求l的方法，不包括對培養(yǎng)細(xì)胞使用有效剪力。3、權(quán)利要求1的方法，包括培養(yǎng)基以重復(fù)穿過培養(yǎng)容器壁暴露于空氣的平滑表面的清掃運(yùn)動來移動。4、權(quán)利要求3的方法，其中所述運(yùn)動包括下述任一運(yùn)動振蕩、滾動、搖擺、前后動、以及流動。5、權(quán)利要求3的方法，其中所述表面包括玻璃。6、權(quán)利要求3的方法，其中所述表面包括塑料。7、權(quán)利要求3的方法，其中所述表面包括金屬。8、權(quán)利要求1的方法，還包括混合培養(yǎng)基以使懸浮培養(yǎng)物中細(xì)胞最佳生長。9、一種用于哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的容器，其是具有前后運(yùn)動的球形自滾式容器。10、一種用于哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的容器，其是具有軌道振蕩運(yùn)動的球形自滾式容器。11、一種用于哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的容器，其是具有用于培養(yǎng)基其它運(yùn)動的內(nèi)凸軌道的球形自滾式容器。12、權(quán)利要求8的方法，其在權(quán)利要求9、10或11的容器中進(jìn)行。全文摘要基于早先發(fā)現(xiàn)的有效生物反應(yīng)器系統(tǒng)的研究，公開了增加培養(yǎng)基溶氧的方法。這一方法和最佳混合一起形成了有效生物反應(yīng)器設(shè)計和原型構(gòu)建的理論基礎(chǔ)。文檔編號C12N5/00GK101506349SQ200680055546公開日2009年8月12日申請日期2006年9月27日優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日發(fā)明者米祖·惠申請人:安普羅泰恩公司